主管:中华人民共和国农业农村部
主办:中国农业科学院农业信息研究所
主编:路铁刚 研究员
1985年创刊 月刊
ISSN 1002-5464
CN 11-2396/Q
中文核心、科技核心、农业核心、RCCSE(A)
卓越期刊
2021年 第37卷 第12期    刊出日期:2021-12-26
上一期   
研究报告
茶树Gro/Tup1基因家族鉴定及外源激素和非生物胁迫下表达分析
詹冬梅, 朱晨, 周承哲, 黄雪婷, 赖钟雄, 郭玉琼
2021, 37(12):  1-12.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0184
摘要 ( 37 )   HTML ( 8)   PDF (5536KB) ( 61 )  
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明确Groucho/Thymidine uptake 1(Gro/Tup1)辅转录调控因子在茶树基因组中的数量、结构及其在非生物胁迫和外源激素处理下表达差异,为揭示Gro/Tup1在茶树激素信号转导途径及其在茶树逆境胁迫中的作用奠定理论基础。对茶树Gro/Tup1家族进行鉴定、分析,同时对其编码蛋白理化性质、进化关系、顺式作用元件及其在干旱、低温(4℃)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理下表达模式进行分析。结果显示:茶树Gro/Tup1家族具有13个成员,分为TOPLESS/TOPLESS-related(TPL/TPR)和LEUNIG/LEUNIG HOMOLOG(LUG/LUH)两个亚家族。顺式作用元件预测结果表明,茶树Gro/Tup1家族成员启动子区域有大量与GA、ABA、MeJA响应以及干旱和低温应答的顺式作用元件;RT-qPCR分析结果表明,不同处理下,茶树Gro/Tup1家族成员呈现不同表达模式。重度干旱时,CsLUG3CsLUG4基因的表达量显著上调,CsTPL2表达水平在轻度干旱时就开始受到抑制,CsTPL8CsTPL9不受干旱调控;低温处理下CsTPL2CsTPL3表达量显著上调;GA3处理下,多数基因表达量上调;ABA处理下多数基因表达量均呈现先显著增加后显著下降趋势;MeJA处理下,大部分基因表达水平都受到显著抑制。茶树含有13个Gro/ Tup1家族成员,其结构进化高度保守,能够响应非生物胁迫及外源激素,其基因应答呈现不同表达谱。

紫花苜蓿转录因子基因MsAP2的克隆及转化
石欣玥, 尚骁尧, 周玲芳, 张铁军, 晁跃辉
2021, 37(12):  13-21.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0497
摘要 ( 33 )   HTML ( 5)   PDF (6221KB) ( 18 )  
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紫花苜蓿(Medicago sativa)为重要的豆科牧草植物,研究紫花苜蓿转录因子基因MsAP2的功能,为探究MsAP2的信号转导网络提供理论指导和材料基础,也为紫花苜蓿生物技术育种提供一定的参考和借鉴。运用RT-PCR技术克隆MsAP2,利用DNA重组技术构建3302-3flag-AP2植物表达载体,并利用农杆菌介导法对紫花苜蓿进行遗传转化,对再生植株进行转基因鉴定、基因表达量分析、内源激素的测定(脱落酸、细胞分裂素、生长素和赤霉素)和表型鉴定。结果表明,成功获得转MsAP2紫花苜蓿植株,与野生型相比,转基因植株的MsAP2表达量和激素水平均发生明显改变,转基因植株呈现早衰性状,叶片形态和大小发生改变,根系生长受到抑制,分枝数发生改变。

芽孢杆菌苎麻脱胶动态过程分析
吴亚, 刘一, 舒潼, 王慧慧, 李攀登, 杨英, 余龙江
2021, 37(12):  22-28.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1395
摘要 ( 12 )   HTML ( 2)   PDF (4360KB) ( 5 )  
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苎麻纤维被誉为“天然纤维之王”,应用广泛。脱胶是实现苎麻纤维应用的关键,然而传统化学脱胶工艺使用大量酸碱以及高温高压条件,耗能高且严重污染环境。微生物脱胶工艺由于具备节能环保等优势,是当前的研究热点。为了解决微生物脱胶普遍存在效率低、不均匀等问题,本文利用所筛选的芽孢杆菌LY11进行微生物脱胶试验,通过检测、分析脱胶过程中菌体数量变化、酶活变化、单糖含量变化、残胶率变化、胶质成分变化以及苎麻表面形态变化,深入了解微生物脱胶过程变化规律,为后续微生物脱胶过程的优化控制以及大规模工业应用提供理论和实践指导。

根腐病对宁夏枸杞根区土壤丛枝菌根真菌群落的影响
吕燕, 王文彬, 苟琪, 王英娜, 李靖宇, 刘建利
2021, 37(12):  29-40.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0190
摘要 ( 19 )   HTML ( 0)   PDF (4195KB) ( 12 )  
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探究根腐病病原菌侵染对宁夏枸杞根区土壤丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)群落组成的影响,为后续开展应用AMF防控宁夏枸杞根腐病奠定基础。从宁夏银川、宁夏中宁和甘肃靖远采集宁夏枸杞健康和根腐病发病植株根系和土壤样品,采用湿筛倾析法和AMF定殖染色法探究3个样地根区土壤AMF的孢子组成、密度和根系菌根侵染率以及AMF多样性与土壤理化因子间的相关性。结果显示,宁夏枸杞健康植株受根腐病病原菌入侵后,孢子密度、总侵染率和总球囊霉素含量不发生变化,中宁样地易提取球囊霉素含量显著升高;不同样地宁夏枸杞健康植株和发病植株根区土壤AMF群落组成差异显著(R2=0.875,P=0.001);中宁样地和靖远样地优势属种发生变化,但银川样地不变。根腐病发生改变宁夏枸杞根区土壤AMF群落结构,会引起银川样地AMF的α-多样性升高,但对中宁样地和靖远样地α-多样性无影响;AMF孢子密度、种丰度和总侵染率与土壤理化性质存在相关性,但土壤理化性质不影响AMF物种多样性,影响AMF定殖。

根癌农杆菌vbp2基因启动子转录调控的探析
徐楠, 徐宇娟, 孙盼, 宗仁杰, 郭敏亮
2021, 37(12):  41-49.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0151
摘要 ( 13 )   HTML ( 1)   PDF (3567KB) ( 0 )  
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根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)能够将自身质粒上的部分DNA片段(简称T-DNA)以T-复合物的形式转运、整合至宿主基因组,而用作高效的植物转基因工具。vbp2是编码VBP蛋白的3个同源基因之一,VBP蛋白通过与T-复合物上的VirD2结合参与T-DNA的转运过程。根据生物信息学预测,vbp2基因的启动子区可能含有多个转录调控元件。通过同源重组的方法,将A. tumefaciens染色体上的vbp2基因替换成编码红色荧光蛋白的rfp基因,使vbp2的启动子控制rfp的表达,因此,可通过测定所表达的RFP的荧光强度来表征vbp2启动子的活性。结果表明:乙酰丁香酮(AS)和鼠李糖(Rha)均能诱导vbp2启动子表达RFP,AS和Rha的最佳诱导浓度分别为150 μmol/L和100 μmol/L。通过截短vbp2启动子DNA片段的方法,证明响应AS和Rha诱导的调控区域分别位于上游的165-260 bp和126-165 bp。

不同栽培基质诱导对香菇液体发酵产漆酶活性的影响
熊雪, 李鹏, 张贵合, 向准, 陶文广, 周光燕, 和耀威
2021, 37(12):  50-59.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0844
摘要 ( 12 )   HTML ( 0)   PDF (3696KB) ( 2 )  
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为探索贵州不同香菇菌株产漆酶能力,得到高产漆酶的栽培基质,从而为提高和改善香菇的产量和品质奠定理论基础,助推贵州香菇产业振兴。试验以贵州香菇主栽品种香菇808、庆科R20以及贵州特有马桑香菇为研究对象,通过拮抗反应、系统发育树及温度试验,对香菇菌株进行了区别性鉴定,并以香菇的主要栽培基质为诱导物,研究3种不同香菇菌株液体发酵产漆酶活性连续12 d的变化规律。马桑香菇、香菇808和庆科R20虽均同为香菇属的下属分支,但菌株间是有区别的,存在一定种源差异。香菇液体产漆酶活性受菌株遗传差异和4种不同诱导培养基的影响均为极显著(P<0.001),且各处理下漆酶均呈现先升后降的趋势。在培养初期,所有处理下香菇产漆酶活性均较低,在培养中后期漆酶活性较高,峰值也主要集中在第8-11天内。相对菌株庆科R20和马桑香菇,香菇808在含玉米芯、马桑木屑及青杠木屑的诱导培养基中液体产漆酶能力均为最强,最大酶活分别为464.06、238.64、288.94 U/L。而麦麸对庆科R20的诱导力更强,最大酶活达265.07 U/L;麦麸对诱导马桑香菇产漆酶的时间最为集中且反应迅速,最大酶活达161.83 U/L,但高水平诱导力更持久的是马桑木屑,最大酶活达108.61 U/L。香菇808、庆科R20和马桑香菇3种菌株间是有区别的,存在一定种源差异,且从产漆酶水平上看,香菇808、庆科R20和马桑香菇对4种基质木质素降解吸收能力差异较大,最佳基质分别为玉米芯、麦麸和马桑木屑。

扩展青霉erg4的生物信息学、亚细胞定位及表达分析
韩占红, 宗元元, 张学梅, 王斌, PRUSKY Dov, 毕阳
2021, 37(12):  60-70.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0141
摘要 ( 13 )   HTML ( 1)   PDF (6436KB) ( 3 )  
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麦角甾醇是真菌细胞质膜的特有组分,在真菌生长发育中具有重要作用。erg4是参与麦角甾醇生物合成最后一步反应的基因,但扩展青霉中该基因的功能未知。本文通过RT-PCR方法克隆了扩展青霉3个erg4erg4Aerg4Berg4C)基因的 CDS全长,对基因结构、编码蛋白的跨膜螺旋和亲疏水性进行了生物信息学分析,通过融合绿色荧光蛋白定位的方法进行了亚细胞定位,测定了3个基因在不同生长发育阶段、不同培养基状态以及黑暗和蓝光条件下的表达差异。扩展青霉erg4Aeerg4Berg4C的 CDS全长分别为1 476 bp、1 491 bp和 1 596 bp,分别编码491、496和 531个氨基酸;编码蛋白均属于跨膜蛋白,且表现出疏水性。绿色荧光蛋白与内质网红色荧光探针染色共定位结果显示,Erg4A、Erg4B和Erg4C均定位于内质网。erg4Aerg4Berg4C在孢子阶段、孢子萌发阶段及成熟菌丝阶段的表达水平存在显著差异,其中,erg4A在3个阶段的表达量无明显变化,而erg4Berg4C的表达量均显著上调,以erg4B的上调幅度最为明显。erg4A在 CY液体和固体培养条件下的表达量无显著变化,erg4Berg4C在CY液体培养条件下的表达量显著高于固体培养,以erg4B的上调幅度最为明显。erg4Aerg4B在蓝光条件下的表达量显著高于黑暗条件,以erg4B的上调幅度最为明显。erg4C对蓝光条件不敏感。扩展青霉Erg4A、Erg4B和 Erg4C均定位于内质网,erg4Aerg4Berg4C在不同生长发育阶段、固体和液体以及黑暗与蓝光培养条件下的表达存在较大差异,其中,以erg4B的响应最为活跃。

深海出芽短梗霉(Aureobasidium sp. 3A00493)菌株特征与胞外多糖特性分析
潘镜宇, 陈佳乐, 钱玙呈, 刘鑫, 杨昊宁, 刘立, 魏步云, 赵洪新
2021, 37(12):  71-81.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0119
摘要 ( 11 )   HTML ( 0)   PDF (4630KB) ( 1 )  
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普鲁兰糖(pullulan)是短梗霉属(Aureobasidium spp.)的一些菌产生的极具高附加值、开发价值的天然微生物多糖。然而不同来源的菌株在产糖量、抑菌活性、副产物含量等方面有很大的差异,因此,寻找产糖量高、抑菌活性强、副产物少的优良菌株一直是研究人员关注的焦点。本研究的出发菌株3A00493是一株从太平洋深海沉积物中分离的产胞外多糖海洋微生物。通过形态学和显微镜观察、分子鉴定确定其分类归属;改变培养条件确定了其生长特性、最佳产糖条件;选择5种常见微生物作为指示菌,滤纸片法测定其抑菌活性;薄层层析和红外光谱分析了多糖结构。出发菌株3A00493是一株菌落乳白,细胞和菌丝体可转换生长,ITS和18S rDNA部分序列与报道短梗霉属(Aureobasidium sp.)同源性≥ 98%的海洋源出芽短梗霉菌;其最适生长温度为26℃,最适生长pH值为4,最适条件下产糖量达24.58 g/L;3A00493的代谢产物对4种指示菌具有较强抑菌活性;薄层层析和红外光谱测定结果表明3A00493产生的胞外多糖与普鲁兰糖标准品一致,确定为普鲁兰糖。出发菌株3A00493为一株产普鲁兰糖、代谢物抑菌活性较强、色素副产物少的海洋源出芽短梗霉新菌株。本研究为进一步研究海洋源产普鲁兰糖新菌3A00493奠定了理论基础,为寻找海洋源微生物多糖提供了新菌株,也为筛选和开发海洋资源微生物提供研究借鉴。

一株枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素B1产物分析
唐璎, 黄佳, 邓展瑞, 杨晓楠
2021, 37(12):  82-90.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0179
摘要 ( 23 )   HTML ( 0)   PDF (4803KB) ( 10 )  
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为丰富生物降解黄曲霉毒素B1资源,研究菌株降解机制及产物毒性。通过液相色谱串联三重四级杆质谱仪(UPLC-MS/MS)及核磁共振氢谱(1H NMR)检测一株枯草芽孢杆菌WTX1降解黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)产物,并将降解产物进行细胞毒理实验。菌株WTX1降解AFB1机制是破坏AFB1结构中的呋喃环二氢双键、香兰素内脂环及戊烯酮环结构,形成小分子化合物,达到脱毒效果。细胞毒理实验证实菌株WTX1降解AFB1产物基本对细胞无毒。菌株WTX1降解机制是破坏AFB1结构中的致毒致变异结构,产生小分子化合物。WTX1降解AFB1的产物对细胞无致突变性,无毒性。后期研究菌株降解AFB1起主要作用的物质,为工业化去除AFB1毒素提供新思路。

混菌发酵白酒糟生产含功能成分饲料发酵条件的优化
范恩帝, 蒋梦迎, 冯敏雪, 陈叶福, 肖冬光, 郭学武
2021, 37(12):  91-103.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0153
摘要 ( 11 )   HTML ( 1)   PDF (3415KB) ( 8 )  
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以蒸汽爆破预处理酒糟为主要原料,前期筛选菌株作为发酵菌种,以期优化发酵条件并生产富含功能成分酒糟饲料。将粗蛋白含量和烟酸含量作为主要指标,粗纤维含量和乙偶姻含量作为次要指标,通过单因素试验与正交试验结合探究麸皮添加量、装料量、初始pH、发酵时间、发酵温度及接种量对混菌固态发酵白酒糟的影响,进而优化酒糟发酵条件。结果表明酒糟发酵最佳工艺条件为:基料中麸皮添加量5%、装料量80 g、初始pH 3.70、发酵时间5 d、发酵温度30℃、接种量10%。与优化前相比,粗蛋白含量提高了1.56%(35.21%),粗纤维含量降低了33.11%(12.73%),烟酸含量增长率达到290.32%(1.21 mg/g酒糟),乙偶姻含量保持基本不变(37.30 mg/g酒糟)。

腐殖酸煤对牛粪好氧堆肥臭气释放量及微生物群落多样性的影响
赵旭, 王文丽, 李娟
2021, 37(12):  104-112.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0032
摘要 ( 12 )   HTML ( 1)   PDF (5551KB) ( 5 )  
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为对比分析不同腐殖酸煤添加量对牛粪堆肥过程中臭气释放量及微生物群落多样性的影响。以鲜牛粪为主料,分别添加质量分数为5%、10%、15%的腐殖酸煤进行为期50 d的堆肥试验,通过Biolog ECO平板检测技术分析腐殖酸煤添加量对堆肥微生物群落多样性的影响。腐殖酸煤加入量在5%-10%时,堆肥处理的高温持续时间达23-25 d,比CK 处理多35 d;添加腐殖酸煤处理的平均AWCD值、平均Shannon指数、平均Simpson指数比CK处理高22.27%-28.47%、2.32%-6.06%和23.21%-30.48%;堆肥产品的种子发芽指数比CK处理高6.53%-13.06%;NH3和H2S释放量比CK处理分别低20.82%-39.74%和25.17%-45.21%。添加5%-10%的腐殖酸煤可以增加堆肥过程中的微生物多样性,促进微生物种群演替,加快对不同物质的转化代谢,促进堆肥腐熟进程,减少臭气的释放量。

海氏肠球菌IDO5对猪粪废水中吲哚降解条件优化及降解途径分析
余琴, 马现永, 邓盾, 王永飞
2021, 37(12):  113-123.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0071
摘要 ( 12 )   HTML ( 1)   PDF (10153KB) ( 3 )  
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在前期的研究中发现了一株吲哚高效降解菌IDO5,本研究主要对其降解猪粪废水吲哚的性质进行了测定。首先通过形态学和16S rRNA序列分析,并初步分析了IDO5对吲哚的降解效果和可作用的底物类型。其次比较了转速、温度、pH、碳源等因素对IDO5降解猪粪废水中吲哚的影响。最后利用GC-MS分析IDO5降解吲哚的产物结构和降解途径。结果表明,IDO5不仅能够利用吲哚为碳源生长,而且能够降解3-甲基吲哚、苯酚、甲酚等多种污染物,具有广泛的底物谱。菌株IDO5降解猪粪吲哚最适的条件为:温度37oC,转速170 r/min,pH 9,在此条件下24 h内可降解猪粪废水中98.2%的吲哚,去除效率较高。甚至在额外添加100 mg/L吲哚的情况下,IDO5依然能够以93.7%的高降解率去除吲哚。IDO5在降解吲哚过程中形成红色的产物,通过GC-MS分析,菌株IDO5降解吲哚很可能是通过吲哚→靛红→邻氨基苯甲酸→邻甲基苯甲醛途径。本研究表明,菌株IDO5不仅具有较强的吲哚降解能力,而且还能作用多种吲哚类化合物,对pH适应能力也较强,能够在广泛的条件下对畜禽养殖废水中的吲哚进行有效降解,具备一定应用价值。

七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物及酶活性的影响
谢果珍, 唐圆, 吴仪, 黄莉莉, 谭周进
2021, 37(12):  124-131.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0149
摘要 ( 12 )   HTML ( 1)   PDF (2709KB) ( 3 )  
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为揭示七味白术散治疗菌群失调腹泻的物质基础,从七味白术散中提取总苷,探讨了不同剂量的七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生态的影响。结果显示七味白术散总苷有助于恢复菌群失调腹泻小鼠的摄食量及体重。中剂量的七味白术散总苷使菌群失调腹泻小鼠的脾脏指数回到正常水平。不同剂量的七味白术散总苷均可促进双歧杆菌、乳酸菌及大肠杆菌的增殖,其中低剂量的七味白术散总苷对双歧杆菌(P<0.01)及乳酸菌(P<0.05)的增殖效果显著。不同剂量的七味白术散总苷可提高菌群失调腹泻小鼠肠道微生物活度(P<0.01)、乳糖酶(P<0.01)及蔗糖酶活性(P<0.01或P<0.05)。研究表明七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道有益菌、微生物活度及酶活性的影响与水煎液一致,是七味白术散治疗菌群失调腹泻的重要药效成分。

表达非洲猪瘟病毒CD2v与P12蛋白的重组伪狂犬病毒的构建
梁旺旺, 李成龙, 陈文智, 丰志华, 蔡少丽, 陈骐
2021, 37(12):  132-140.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0024
摘要 ( 11 )   HTML ( 0)   PDF (6204KB) ( 5 )  
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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)与伪狂犬病(pseudorabies,PR)分别由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)与伪狂犬病毒感染(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪(或部分猪)高致死、传染性疾病。目前非洲猪瘟无商业化疫苗,两种疾病均给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究以PRV-Fa经典毒株为载体通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)基因编辑技术将ASFV(Pig/HLJ/18)CD2v(EP402R)与p12(O61R)基因分别插入PRV-Fa株TK(UL23)及gI(US7)基因位点中,成功构建TK及gI缺失且重组表达ASFV CD2v与P12的重组弱毒株PRV-∆gI-(P12)-∆TK-(CD2v)。通过基因测序、蛋白质免疫印迹(Western blot)与免疫荧光表明重组毒株遗传性状稳定且CD2v与P12在Vero细胞中稳定表达。通过一步生长曲线、噬斑生长测定、小鼠毒力测试及小鼠病理学评估表明与野生型毒株PRV-Fa相比重组毒株毒力明显减弱,对小鼠不具致死能力,该重组毒株为研究预防PR及ASF的新型疫苗提供了新的选择。

猪乳外泌体对猪流行性腹泻病毒的抑制作用
陈婷, 谢梅英, 魏立民, 欧阳坤, 程晓, 张永亮
2021, 37(12):  141-150.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0112
摘要 ( 9 )   HTML ( 0)   PDF (4352KB) ( 4 )  
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本文旨在探索猪乳外泌体(exosome)对仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中PEDV的抑制作用。试验采用结晶紫染色及MTT方法分别测定细胞活性,qRT-PCR和Western blot分别测定病毒及细胞相关基因和蛋白的表达水平。结果显示,猪乳exosome显著抑制PEDV病毒对IPEC-J2细胞的感染力,细胞存活率和活性显著升高(P<0.05);极显著下调感染PEDV后细胞内及细胞上清中病毒的MNORF3SpikeRNA polymeraseE等基因表达量(P<0.01);猪乳exosome组细胞内PEDV病毒N蛋白及IPEC-J2细胞内凋亡CLDN1 蛋白表达量显著下调;猪乳exosome三种不同处理方式下,处理方式2(杀灭)和3(修复)分别对免疫相关IFN-aIRF3基因表达影响不明显(P>0.05),其他各处理组对猪氨肽酶N(pAPN)表达量极显著下调(P<0.01),而对NF-κB基因的表达无显著影响(P>0.05);以上结果提示,猪乳exosome在3种不同的处理方式下均能降低PEDV对仔猪肠道上皮IPEC-J2细胞的感染能力,推测其机制可能一方面通过抑制病毒感染或复制相关的基因降低感染性,另一方面通过降低细胞内凋亡或提高免疫相关基因的表达增强细胞对病毒的抵抗能力,从而达到对仔猪肠道上皮细胞的保护作用。

PDK4对山羊肌内脂肪细胞脂代谢的影响
张浩, 张亚楠, 李鑫, 王佳美, 王永, 朱江江, 熊燕, 林亚秋
2021, 37(12):  151-159.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0368
摘要 ( 15 )   HTML ( 4)   PDF (5061KB) ( 6 )  
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旨在克隆获得山羊PDK4基因序列,明确其组织细胞表达特性,并明晰其对山羊肌内脂肪细胞脂代谢的作用。构建山羊PDK4过表达和干扰细胞模型,利用RT-PCR、实时荧光定量 PCR等研究PDK4对山羊肌内脂肪细胞脂代谢的影响。结果克隆获得山羊PDK4基因序列,长度为1 808 bp,定位于线粒体和细胞质。明确了山羊PDK4组织及细胞时序表达模式,发现PDK4高表达于山羊肺脏、臂三头肌和肝脏组织(P<0.01);在诱导分化5 d的山羊肌内脂肪细胞中表达水平极显著高于诱导分化之前的表达水平(P<0.01)。干扰和过表达山羊PDK4分别显著降低和增加了脂质积聚,且干扰PDK4后脂代谢相关基因FABP3、CD36、ACACAAGPAT6和ADRP表达水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低,而过表达PDK4后表达水平极显著升高(P<0.01)。PDK4在山羊各组织及肌内前体脂肪细胞分化各个阶段均存在表达。过表达山羊PDK4促进了脂肪细胞脂滴累积和脂质沉积相关基因表达上调,干扰后呈相反的趋势和表达。

斑马鱼(Danio reriomapk1基因对tp53基因调控研究
包林珠, 时灿, 卢玲儿, 徐行, 周泽斌, 任建峰, 李伟明, 张庆华
2021, 37(12):  160-168.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0335
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旨在研究斑马鱼(Danio reriomapk1基因对tp53基因的调控作用。通过生信网站分析斑马鱼tp53启动子序列与mapk1基因CDS序列,构建斑马鱼tp53启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-tp53-Luc和 mapk1表达质粒pCMV-Tag2B-mapk1。利用Luciferase实验验证tp53启动子报告基因的活性,以及mapk1基因对tp53基因的活性影响。结果显示,斑马鱼tp53基因启动子区无CpG岛位点,包含 Oct-1(TATGTAAAGC)、Sp-1(AGATCCCGCC)、c-Jun(CTGACGTCAC)、CREB(CTGACGTCAC)、CRE-BP1(CTGACGTCAC)、NF-kappa B1(AGGGGAATCC)和RAR-alpha1(TTGAACTTTT)共7个转录因子结合位点;斑马鱼与人和小鼠MAPK1氨基酸的一致性分别为91.33%和90.79%。pGL3-tp53-Luc在哺乳动物细胞系和鱼类细胞系中均具有很高的活性,分别是对照组的17倍和9倍。在HEK293T细胞中过表达pCMV-Tag2B-mapk1 质粒后pGL3-tp53-Luc的luciferase活性是对照组的3倍左右。实验验证了斑马鱼mapk1基因可促进tp53基因的表达。

基于重组毕赤酵母的草鱼C型溶菌酶生物合成及其抑菌活性
杨悦, 陶妍, 谢晶, 钱韻芳
2021, 37(12):  169-179.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0256
摘要 ( 9 )   HTML ( 1)   PDF (5396KB) ( 2 )  
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C型溶菌酶(Chicken-type lysozyme)作为草鱼(Ctenopharyngodon idella)内源性免疫系统中的重要蛋白质类免疫因子,能在草鱼抵抗病原微生物侵染的过程中发挥重要作用,亦是开发绿色饲料添加剂或生物类抗菌剂的佳选。本研究通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)克隆草鱼C型溶菌酶的编码基因“CilyC”,再经二次PCR在其5'和3'端添加各种必需位点。将“CilyC”与表达载体“pPICZαA”连接后转入工程菌毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33中,获得重组菌株“X-33/pPICZαA-CilyC”。经含高浓度博莱霉素的培养基筛选得到高拷贝重组菌株后,对其最适蛋白质表达条件进行优化和筛选。通过镍离子亲和层析法纯化重组菌株的表达产物,并对纯化产物进行Western blot分析和LC-MS/MS质谱鉴定。此外,经平板涂布法和最小抑菌浓度(MIC)法考察重组菌株表达产物的抑菌活性。结果表明:X-33/pPICZαA-CilyC在29℃、250 r/min、1%甲醇浓度、96 h的发酵培养条件下,能产13.7 mg/L的重组蛋白;该重组蛋白经结构鉴定为预期分子量14.5 kD的CilyC蛋白。抑菌试验结果显示:重组CilyC具有明显的抗革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisi)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)以及革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和沙门氏菌(Salmonella)的生物学活性。本研究构建的重组毕赤酵母菌株“X-33/pPICZαA-CilyC”能有效合成草鱼C型溶菌酶,为鱼类来源C型溶菌酶的大规模制备奠定了良好基础。

小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的酶活调控
孟晓建, 于建东, 郑小梅, 郑平, 李志敏, 孙际宾, 叶勤
2021, 37(12):  180-190.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0274
摘要 ( 8 )   HTML ( 0)   PDF (6743KB) ( 4 )  
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黑曲霉是柠檬酸的工业生产菌株,糖酵解中的3个不可逆反应是柠檬酸积累的重要调控节点,但己糖激酶和丙酮酸激酶的代谢调控研究相对较少,本研究旨在加深对己糖激酶和丙酮酸激酶代谢调控的认识。首先,将黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶进行内源过表达,经GST亲和层析纯化后重组酶的比酶活分别为(4.86±0.14)U/mg和(1.83±0.02)U/mg。通过小分子代谢物对其酶活影响的检测,发现己糖激酶受果糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、ADP和ATP的抑制,而丙酮酸激酶被果糖-1,6-二磷酸、苹果酸和富马酸抑制,同时存在底物ADP的前馈激活作用。进一步通过蛋白三维结构建模与蛋白-小分子代谢物对接模拟分析,发现黑曲霉己糖激酶底物结合位点Asn210及其附近的氨基酸是与小分子代谢物互作的关键位点,而丙酮酸激酶位于别构效应结构域的Thr416、Thr417与Trp470则为关键小分子代谢物的重要结合位点。本研究系统鉴定了小分子代谢物对己糖激酶与丙酮酸激酶的代谢调控关系并预测了其别构调控位点,加深了对黑曲霉糖酵解调控机制的认识。

泛素E3连接酶CHIP和E4B互换U-box结构域突变体的构建及泛素化活性验证
范宇宸, 陆瑶, 刘香男, 赵博
2021, 37(12):  191-197.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0230
摘要 ( 11 )   HTML ( 2)   PDF (3304KB) ( 5 )  
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旨在构建互换U-box结构域的泛素E3连接酶CHIP和E4B的突变体,用以研究U-box结构域对两种U-box家族泛素E3连接酶CHIP和E4B活性的影响。通过overlap PCR的方法构建CHIP U-box替换为E4B U-box的突变体C+E,以及E4B U-box替换为CHIP U-box的突变体E+C。将突变体质粒分别与CHIP底物RCC2、E4B底物NIPSNAP1、CHIP和E4B共同底物p53、CDC37质粒共转染至HEK-293T细胞。Western Blot检测底物和CHIP、E4B及其突变体表达情况,免疫共沉淀法检测底物的泛素化水平。结果显示,成功构建了两种泛素连接酶互换U-box结构域的突变体,且两种突变体在HEK-293T细胞中均能表达。两种突变体均部分保留了泛素化各自底物的活性,C+E能够泛素化共同底物p53和CDC37。

细胞穿膜肽M918偶联抗体的表达纯化及其内吞效率研究
李雪, 李俊敏, 张雷, 李杉
2021, 37(12):  198-204.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0317
摘要 ( 11 )   HTML ( 1)   PDF (4402KB) ( 3 )  
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细胞穿膜肽由于存在靶细胞摄取效率低等问题,使其在药物递送载体领域的应用受到限制。本研究用基因工程手段将穿膜肽M918与靶向HER2的单链抗体偶联,通过大肠杆菌表达系统和镍亲和层析表达并纯化了重组蛋白M918-scFv。利用微量热泳动技术检测重组蛋白M918-scFv与HER2抗原的亲和能力;利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测重组蛋白的内吞效率。实验结果表明亲和层析获得的重组蛋白M918-scFv纯度较高,偶联M918,不会改变scFv与抗原的亲和能力。在HER2阳性细胞中,重组蛋白M918-scFv的内吞效率是scFv的1.8倍,说明重组蛋白M918-scFv发挥了穿膜肽M918的穿膜特性,表现出更高的内吞效率。穿膜肽M918偶联scFv既表现出穿膜肽的穿膜特性又兼具了scFv的靶向性,提供了一种新的靶向递送的策略。

综述与专论
F-box蛋白参与植物逆境胁迫研究进展
许涛, 夏冬健, 万菁, 姜书涵, 宋江华
2021, 37(12):  205-211.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0203
摘要 ( 18 )   HTML ( 2)   PDF (1242KB) ( 10 )  
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F-box蛋白在植物中广泛存在,在植物生命活动中发挥重要作用。F-box蛋白通过与Skp1、Cullin和Rbx1形成Skp-Cullin-F-box(SCF)蛋白复合体,参与泛素-蛋白酶途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)降解生物体中的蛋白质而发挥作用。F-box蛋白广泛参与植物对干旱、盐害、温度、重金属等非生物胁迫,以及病原菌和害虫造成的生物胁迫的响应过程。主要就F-box蛋白的结构、作用途径及其在植物抗逆响应研究领域的最新进展和存在的问题进行综述,旨在为深入研究F-box蛋白增强植物抗逆性的机制提供参考。

奶牛乳腺炎治疗及抗炎分子机制的研究进展
王晋鹏, 罗仍卓么, 王兴平, 杨箭, 贾立, 马云, 魏大为
2021, 37(12):  212-219.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0170
摘要 ( 17 )   HTML ( 9)   PDF (1667KB) ( 13 )  
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奶牛乳腺炎是乳腺组织受到病原微生物入侵、血液循环障碍和理化因素刺激等发生的一种炎症反应,是奶牛较常见的疾病之一,严重影响着奶产业的经济效益。近年来,为了不断探索和研发奶牛乳腺炎治疗方法,国内外学者进行研究多种物质在奶牛乳腺炎症中的分子作用机制。本文概述了奶牛乳腺炎的致病原因,重点综述了生物活性物质、矿物元素、维生素和生物制剂分别在奶牛乳腺炎治疗及抗炎分子机制方面的最新研究进展,以期为奶牛乳腺炎的预防和精准治疗的研究提供参考。

肠道微生物对疫苗免疫效果影响的研究进展
陈斯谦, 吴边, 柳陈坚, 李晓然
2021, 37(12):  220-226.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0162
摘要 ( 13 )   HTML ( 1)   PDF (2842KB) ( 7 )  
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人类生命早期的肠道已暴露在有菌环境中,正常的肠道菌群能够通过形成菌群屏障,分泌次生代谢产物,调节宿主免疫等方式维持肠道内环境稳态。而疫苗是一类通过宿主免疫应答而发挥作用的药物。疫苗与微生物之间的相互关系目前报道较少,近年研究发现肠道菌群会对疫苗制剂产生一定影响。本文回顾了肠道菌群与疫苗相互作用的研究进展,希望对疫苗研发提供理论基础与指导。

酵母有丝分裂染色体异常分离机制
魏文青, 谢泽雄
2021, 37(12):  227-234.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0616
摘要 ( 10 )   HTML ( 2)   PDF (2629KB) ( 1 )  
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有丝分裂是真核生物细胞遗传和增殖发育的基础,主要分为S期和M期,其中M期是细胞分裂和遗传物质传递的重要过程。染色体的正确分离受到多种细胞机制的高度调控,是保证子代细胞遗传信息完整性的关键。本文主要以典型的真核生物酵母细胞为研究模型,综述了酵母在有丝分裂过程中染色体分离异常形成非整倍体的具体机制。分别包括纺锤体组装监控机制失效、姐妹染色单体黏结蛋白缺陷、动粒-纺锤体微管结合错误和多中心体途径4个方面。并讨论了非整倍体现象对酵母细胞造成的影响,以期更好的理解非整倍体酵母的生理及遗传特性。

基于铂纳米团簇的生物传感研究进展
王鹏飞, 杨敏, 朱龙佼, 许文涛
2021, 37(12):  235-242.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0247
摘要 ( 7 )   HTML ( 1)   PDF (1243KB) ( 3 )  
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在过去的几十年中,金和银纳米簇(gold and silver nanoclusters,Au NCs and Ag NCs)得到了广泛的探索,并用于工业催化、光电器件、生物成像、环境测试、临床诊断和治疗领域。同样作为贵金属团簇,有关铂纳米簇(platinum metal nanoclusters,Pt NCs)的生物传感应用讨论相对较少。Pt NCs具有出色的反应活性、光学特性、催化活性、导电性和生物相容性,并且已被证明可用于生物传感和医学成像。鉴于上述出色的性能,我们从合成和特有性质的角度总结了Pt NCs,并总结了它们在传感和成像中的生物学应用。

巯基-烯点击反应介导的生物传感研究进展
郑淑娟, 仝涛, 许文涛, 黄昆仑
2021, 37(12):  243-251.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0329
摘要 ( 8 )   HTML ( 1)   PDF (2079KB) ( 4 )  
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巯基-烯点击反应是一种无金属催化的点击反应,目前正广泛应用于分子标记、新材料合成和材料表面功能化等方面。详细介绍了巯基-烯点击反应的反应机理、影响反应的因素,以及该反应介导的生物标记技术。在此基础上,论述了巯基-烯点击反应在生物传感、细胞成像、纳米材料的生物功能化方面的应用。最后预测了巯基-烯点击反应在未来的发展方向和应用前景。

技术与方法
大肠杆菌双质粒CRISPR-Cas9系统的优化及应用
王凯凯, 王晓璐, 苏小运, 张杰
2021, 37(12):  252-264.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0618
摘要 ( 14 )   HTML ( 2)   PDF (4498KB) ( 7 )  
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近年来,CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑系统已经成功应用于多种微生物中。由于CRISPR-Cas9系统仅受PAM(protospacer adjacent motif)位点NGG的限制,因此理论上CRISPR-Cas9系统可以编辑基因组中任何含NGG的位点或基因,但研究发现该系统对影响微生物生长及代谢的关键靶基因改造时会出现效率降低,甚至是无法获得突变株的现象。前期已有大量研究报道了降低CRISPR-Cas9系统脱靶效应的策略,但依然未能有效解决编辑效率降低的问题。因此,本研究通过使用不同拷贝数的质粒调节Cas9、gRNA的表达和同源臂浓度使其协同发挥基因编辑功能,建立了更加高效的双质粒CRISPR-Cas9系统。试验结果表明,该系统对大肠杆菌pfkA(6-phosphofructokinase isozyme 1)、pfkB(6-phosphofructokinase isozyme 2)、zwf(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase)单基因敲除最高效率达到100%;在nagABE基因簇位点通过替换引入甘油激酶基因glpK(glycerol kinase)的效率为10%。相比于单质粒CRISPR-Cas9系统,优化的双质粒系统成功进行了pfkB基因的敲除及glpK基因的整合,且将pfkAzwf基因的敲除效率分别提升了31%和63%。突变株与野生株之间碳源代谢的差异进一步表明基因敲除效率与基因特殊活性相关。结果证明,过量的靶基因同源臂和gRNA的过表达可以有效提升CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中的编辑效率。

五种检测嵌合抗原受体表达方法的比较
王欢禹, 常昊宛, 章崇祺, 金卫林, 魏芳
2021, 37(12):  265-273.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1511
摘要 ( 11 )   HTML ( 2)   PDF (5275KB) ( 7 )  
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比较检测新型嵌合抗原受体(CAR)的5种方法。通过慢病毒感染得到稳定表达嵌合抗原受体的细胞。使用免疫球蛋白G抗体染色、蛋白质 L染色、绿色荧光蛋白共表达法、实时荧光定量PCR的绝对定量和相对定量法5种方法检测不同嵌合抗原受体在Jurkat细胞中的表达。成功构建6种CAR慢病毒表达载体(Meso-CAR、Met-CAR、R132H-CAR1-2-GFP、R132H-CAR2-4-GFP、Dupixent-HL-CAR-GFP、Dupixent-LH-CAR-GFP),并得到其对应的CAR稳定表达Jurkat细胞。发现Meso-CAR和Met-CAR可同时用免疫球蛋白G抗体和蛋白质 L染色鉴定其表达(免疫球蛋白G抗体染色效果较优),而其余4种CAR均不可以。对荧光法染色不可行的CAR可使用绿色荧光蛋白共表达法、实时荧光定量PCR的绝对定量和相对定量法间接检测CAR的表达,3种方法的结果之间存在一定的对应性。不同的CAR分子,可用不同方法确定细胞中CAR分子的表达情况。

基于专利分析和社会网络分析的基因编辑技术演化研究
刘佳, 魏佳奇, 刘玉琴, 时歌歌, 郭静
2021, 37(12):  274-284.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1139
摘要 ( 13 )   HTML ( 1)   PDF (6795KB) ( 6 )  
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基因编辑在农业、工业以及生物医学领域都表现出了巨大的应用价值,研究其演化趋势和演化规律对相关决策者制定技术战略具有重要意义。基于德温特专利数据库,对基因编辑技术的研究进展做了整体分析,通过对基因编辑技术的专利申请态势、国家地区分布、主要专利权人和核心技术主题进行分析来揭示该技术的演化过程。结果表明,(1)从专利申请趋势来看,目前基因编辑技术正处于高速发展阶段;(2)发达国家的专利申请数量依然处于优势地位,而中国地区在保护专利知识产权方面作用明显,吸引了众多高质量的专利;(3)与国外专利权人相比,我国专利权人的综合实力进步显著,但仍缺乏与企业的直接联系;(4)基因编辑的发展方向主要受社会需求影响,通过优化技术降低潜在风险是今后发展的重要目标。

其他
目录
2021, 37(12):  285-285. 
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版权
2021, 37(12):  286-286. 
摘要 ( 5 )   PDF (135KB) ( 2 )  
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封面
2021, 37(12):  287-287. 
摘要 ( 6 )   PDF (406971KB) ( 8 )  
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