摘要： 建立HIV-1的调节基因Nef基因在内皮细胞稳定表达的细胞株ECV304-Nef,为研究Nef对血管内皮细胞生物学活性的影响奠定试验基础。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Nef,将其质粒和pcDNA3.1(+)质粒(阴性对照)分别转染血管内皮细胞ECV304,G418筛选。通过RT-PCR检测NefmRNA在细胞中的表达;细胞免疫荧光法检测Nef蛋白的表达及定位;Western blotting检测Nef蛋白的特异性表达,获得稳定表达的细胞株。构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-Nef经BamHI和EcoRI双酶切鉴定,得到的片段大小与理论值相符,分别为载体的5400bp和目的基因的621bp。测序结果显示碱基序列与GenBank(登录号:K03455)序列相同。转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的ECV304细胞株,RT-PCR显示转染pcD-NA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞出现621bp条带,对照组无目的条带出现;荧光显微镜下观察转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。Western blotting结果显示,转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞约27kD处检测到目的条带,表明pcDNA3.1(+)-Nef表达正确。
