四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳体系建立及应用

生物技术通报 ›› 2013, Vol. 0 ›› Issue (1): 116-122.

四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳体系建立及应用

张胜¹ ,赵忠^1,2，刘昭军¹ ,张博勇^1,2，宗建伟¹ ,张玲玲 ¹

1. 西北农林科技大学林学院，杨陵 712100 ；2. 西北农林科技大学西部环境与生态教育部重点实验室，杨凌 712100

收稿日期:2013-01-31 修回日期:2013-01-31 出版日期:2013-01-30 发布日期:2013-01-30
作者简介:张胜, 男, 硕士研究生, 研究方向: 苗木快繁技术及植物不定根形成过程中的差异蛋白组学研究; E-mail: zhangsheng8630@sina.com
基金资助:
国家自然科学基金项目（30972352）

Establishment and Application of Two-dimensional Gel Electrophoresis for Proteome from the Phloem of Tetraploid Robinia pseudoacacia

Zhang Sheng¹, Zhao Zhong^1,2,Liu Zhaojun¹,Zhang Boyong^1,2Zong Jianwei¹, Zhang Lingling¹,

1. College of Forestry，Northwest A & F University，Yangling 712100;
2. Ministry of Education Key Laboratory of Environment and Ecology in Western China，Northwest A & F University，Yangling 712100

Received:2013-01-31 Revised:2013-01-31 Published:2013-01-30 Online:2013-01-30

摘要/Abstract

摘要： 采用TCA/ 丙酮法对四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白质进行提取，通过对IPG 胶条pH 梯度、分离胶浓度的选择，上样量、等电聚焦条件的优化，建立起四倍体刺槐枝段韧皮部蛋白质双向电泳体系。研究结果表明：采用TCA/ 丙酮法提取四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白质，选用pH4-7 的17 cm IPG 胶条，考马斯亮蓝染色上样量550 μg，等电聚焦IEF 聚焦总伏小时数从60 000 Vh 提高到80 000 Vh，并采用12% 的分离胶对四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白进行双向电泳，能得到背景清晰、蛋白质点数相对较多，分离度高且重复性好的电泳图谱。利用建立的体系进行双向电泳分离蛋白质，能直接挖点送质谱分析。采用该体系分析四倍体刺槐硬枝扦插生根愈伤组织阶段蛋白质表达差异，共筛选出83 个差异蛋白质点，其中上调蛋白15 个，新产生蛋白22 个，下调蛋白22 个，缺失表达24 个。

关键词: 四倍体刺槐 , 韧皮部 , 双向电泳 , 优化方法 , 差异蛋白质分析

Abstract: This paper used the method of TCA/acetone to extract all proteins of phloem in tetraploid Robinia pseudoacacia. A twodimensionalelectrophoresis system for proteomic analysis of tetraploid Robinia pseudoacacia was established by optimizing the parametersincluding the pH gradient of IPG strip, the gel concentration, the loading quantity of sample and isoelectric focusing conditions. The resultsshowed that ：Use the TCA/acetone method to extract all phloem protein of tetraploid Robinia pseudoacacia, choose 17 cm IPG strip withpH4-7, load protein samples of 550 μg, followed staining with colloidal Coomassie Brilliant Blue and use 12% SDS-PAGE for tetraploid Robiniapseudoacacia phloem total proteins in two-dimensional electrophoresis while isoelectric focusing IEF hours increased from 60 000 Vh to 80 000Vh can get a clear background with more protein points, high resolution and good repeatability. Using the established system of two-dimensionalelectrophoresis can dug protein points from the gel directly and send them to mass spectrometry. Use this system to analysis differences ofhardwood cuttings rooting callus phase protein expression in tetraploid Robinia pseudoacacia. Filter out 83 differential protein spots, amongwhich, 15 were higher, 22 were novel, 22 were lower and 24 were lack of expression.

张胜, 赵忠, 刘昭军, 张博勇, 宗建伟, 张玲玲 . 四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳体系建立及应用[J]. 生物技术通报, 2013, 0(1): 116-122.

Zhang Sheng, Zhao Zhong, Liu Zhaojun, Zhang BoyongZong Jianwei, Zhang Lingling, . Establishment and Application of Two-dimensional Gel Electrophoresis for Proteome from the Phloem of Tetraploid Robinia pseudoacacia[J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 0(1): 116-122.

参考文献

[1] O’Farrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis ofproteins[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1975, 250（10）：4007-4021.
[2] G?rg A, Weiss W, et al. Current two-dimensional electrophoresis technologyfor proteomics[J]. Proteomics, 2004, 4（1）：3665-3685.
[3] 马洪雨, 王占奎, 俞阗, 等. 适用于黄麻根部蛋白质组学分析的双向电泳技术[J]. 西北植物报, 2010, 30（1）：195-202.
[4] Wilkins MR, Appel RD, Williams KL, Hochstrasser DF. Proteomeresearch ：Concepts, technology and application[M]. BerlinHeidelberg ：Springer-Verlag, 2007.
[5] Shaw MM, Riederer BM. Sample preparation for two-dimensional gelelectrophoresis[J]. Proteomics, 2003, 3 ：1408-1417.
[6] Jacobs DI, van Rijssen MS, van der Heijden R, Verpoorte R. Sequentialsolubilization of proteins precipitated with trichloroacetic acid inacetone from cultured Catharanthus roseus cells yields 52% more spotsafter two-dimensional electrophoresis[J]. Proteomics, 2001, 1（11）：1345-1350.
[7] 叶景秀, 陈蕊红, 张改生, 等. 杀雄剂SQ-1 诱导小麦雄性不育花药蛋白质组分分析[J]. 农业生物技术学, 2009, 17（5）：858-864.
[8] 宁书菊, 赵敏, 向小亮, 等. 不同氮素水平下水稻生育后期叶片和籽粒的蛋白质组学[J]. 应用生态学报, 2010, 21（10）：2573-2579.
[9] Saravanan RS, Rose JKC. A critical evaluation of sample extractiontechniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant planttissues[J]. Proteomics, 2004, 4（9）：2522-2532.
[10] 黎飞, 徐秋芳, 臧宪朋, 等. 番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立[J]. 园艺学报, 2010, 37（4）：661-668.
[11] 顾宪鹏, 罗秋兰, 高继国, 等. 大豆叶片蛋白质双向电泳技术的改良[J]. 大豆科学, 2011, 30（4）：663-667.
[12] De La Fuente M, Borrajo A, Bermudez J, et al. 2-DE-basedproteomic analysis of common bean seeds[J]. Journal ofproteomics, 2011, 74（2）：262-267.
[13] 甘露, 李殿荣, 臧新, 等. 甘蓝型油菜蛋白质双向电泳体系的建立[J]. 作物学报, 2010, 36（4）：612-619.
[14] 李云, 姜金仲. 我国饲料型四倍体刺槐研究进展[J]. 草业科学, 2006, 23（1）：41-46.
[15] Imin N, Kerim T, Weinman JJ, et al. Characterization of rice antherproteins expressed at the young microspore[J]. Proteomics,2001, 1（9）：1149-1161.
[16] Westermeier R, Naven T. Proteomics in practice ：A laboratory manualof proteome analysis[M]. Weinheim ：WILEYVCH VerlagGmbH, 2002.
[17] Candiano G, Bruschi M, Musante L, et al. Blue silver ：A very sensitivecolloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis[J]. Electrophoresis, 2004, 25（9）：1327-1333.
[18] 丁承强, 马丹, 王绍华, 等. 水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法[J]. 植物学报, 2011, 46（1）：67-73.
[19] 庄维兵, 高志红, 章镇, 等. 果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立[J]. 南京农业大学学报, 2011, 34（6）：47-52.
[20] 任丽萍, 范海延, 王珊珊, 等. 黄瓜叶片蛋白质双向电泳样品分级优化[J]. 西北植物学报, 2011, 31（8）：1706-1710.
[21] 付忠军, 丁冬. 进茜宁, 等. 玉米花丝蛋白质组双向电泳条件的优化[J]. 植物生理学通讯, 2009, 45（12）：1215-1220.
[22] 王娟, 倪志勇, 吕萌, 等. 棉花纤维伸长期与次生壁增厚期蛋白质组比较[J]. 作物学报, 2010, 36（11）：2004-2010.
[23] 顾宪鹏, 罗秋兰, 高继国, 等. 大豆叶片蛋白质双向电泳技术的改良[J]. 大豆科学, 2011, 30（4）：663-667.
[24] 王娟, 倪志勇, 吕萌, 等. 棉花纤维伸长期与次生壁增厚期蛋白质组比较[J]. 作物学报, 2010, 36（11）：2004-2010.
[25] 魏开华, 应天翼, 编著. 蛋白质组学试验技术精编[M]. 北京：化学工业出版社, 2010.
[26] Pasquali C, Fialka I, Huber LA. Preparative two-dimensional gelelectrophoresis of membrane proteins[J]. Electrophoresis, 1997,18（14）：2573-2581