生物技术通报 ›› 2020, Vol. 36 ›› Issue (10): 142-149.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0106
收稿日期:
2020-02-06
出版日期:
2020-10-26
发布日期:
2020-11-02
作者简介:
伍婷婷,女,硕士研究生,研究方向:微生物遗传;E-mail: 基金资助:
WU Ting-ting(), GUI Zhe, QIN Ying-qiu, XIE Zhi-xiong()
Received:
2020-02-06
Published:
2020-10-26
Online:
2020-11-02
摘要:
东湖假单胞菌HYS对秀丽隐杆线虫具有较强毒性,但机制尚不完全了解。本研究旨在探究东湖假单胞菌HYS中σ因子SigW与反σ因子RsiW在其对秀丽隐杆线虫毒性中的作用。通过对东湖假单胞菌HYS减毒突变株突变位点序列进行生物信息分析,构建目的基因敲除突变株,借助酵母双杂交、荧光定量PCR以及假单胞菌-秀丽隐杆线虫互作等研究方法进行相关基因蛋白功能验证。结果发现:(1)基因rsiW与东湖假单胞菌HYS菌株对秀丽隐杆线虫毒性相关;(2)RsiW与基因组上邻近的SigW(σ24)是一对σ因子与反σ因子,在蛋白水平存在互作;(3)RsiW与SigW互作参与东湖假单胞菌HYS对秀丽隐杆线虫毒性作用且存在一定的剂量效应,即SigW表达相对较强时,存在减毒效应。该研究发现一对σ因子与反σ因子(SigW/RsiW)参与东湖假单胞菌HYS对秀丽隐杆线虫的毒性作用,为深入探讨假单胞菌毒力因子调控机制提供了新线索和思路。
伍婷婷, 桂哲, 秦迎秋, 谢志雄. σ Factor SigW/Anti-σ Factor RsiW参与东湖假单胞菌HYS对秀丽隐杆线虫毒性作用[J]. 生物技术通报, 2020, 36(10): 142-149.
WU Ting-ting, GUI Zhe, QIN Ying-qiu, XIE Zhi-xiong. σ Factor SigW/ Anti-σ Factor Involving in the Toxicity of Pseudomonas donghuensis HYS to Caenorhabditis elegans[J]. Biotechnology Bulletin, 2020, 36(10): 142-149.
引物名称 | 序列(5'-3') | 用途 |
---|---|---|
M13-47 | AGGGTTTTCCCAGTCACG | 回补检测 |
M13-48 | GAGCGGATAACAATTTCACAC | 回补检测 |
rsiW -up-1 | CGGAATTCGCCGGTACGA | rsiW上游同源臂扩增 |
rsiW -up-2 | CGGGATCCGATCAAGCTCATTTC | rsiW上游同源臂扩增 |
rsiW -down-1 | CGGGATCCATCACTTTGTAGCTG | rsiW下游同源臂扩增 |
rsiW -down-2 | CCCAAGCTTGAGATTGATTCT | rsiW下游同源臂扩增 |
rsiW -M-1 | GCCCTTGGCGTGATTCTTA | rsiW敲除检测 |
rsiW -M-2 | CACCTGGATGGATTAGACTCAA | rsiW敲除检测 |
rsiW -com-1 | CCAAGCTTTGTCACGCTTGTCG | HYS的rsiW片段扩增 |
rsiW -com -2 | CGGAATTCGCGGATACCTCG | HYS的rsiW片段扩增 |
sigW -up-1 | CGGGATCCACTTGCTGGTAGAA | sigW上游同源臂扩增 |
sigW -up-2 | CGGAATTCTAGTTCGTTCATTGC | sigW上游同源臂扩增 |
sigW -down-1 | CGGAATTCAAATGAGCTTGA | sigW下游同源臂扩增 |
sigW -down-2 | CCAAGCTTGTAGGCCGAGA | sigW下游同源臂扩增 |
sigW -M-1 | GCTGGCGTAGGTCGTGTTG | sigW敲除检测 |
sigW - M-2 | CTTACGCCCCTAATGGCA | sigW敲除检测 |
sigW -com-1 | CCAAGCTTGTCTGCTTCGTACAC | HYS的sigW片段扩增 |
sigW -com -2 | CGGAATTCTCGGACGGGAT | HYS的sigW片段扩增 |
sigWrsiW -up-1 | CGGGATCCCTGAACACCCTCG | sigWrsiW上游同源臂扩增 |
sigWrsiW -up-2 | CGGAATTCGTCTAGTTCGTTCATTGC | sigWrsiW上游同源臂扩增 |
sigWrsiW -down-1 | CGGAATTCGGTATCACTTTGTAGCTG | sigWrsiW下游同源臂扩增 |
sigWrsiW -down-2 | CCAAGCTTGCCTTCGAGCCGA | sigWrsiW下游同源臂扩增 |
sigWrsiW -M-1 | AGGTCGTGTTGCAGGTAGTCGTTG | sigWrsiW敲除检测 |
sigWrsiW - M-2 | GCGATGCTCCCGATAGAGGC | sigWrsiW敲除检测 |
sigWrsiW -com-1 | CCAAGCTTCACTGATCGCCTACA | HYS的sigWrsiW片段扩增 |
sigWrsiW -com -2 | CGGAATTCCGTGCGCTTCA | HYS的sigWrsiW片段扩增 |
rpoB -RT-1 | CGGGAGCGACCAAAGATCAG | HYS的RT-PCR内参基因扩增 |
rpoB - RT -2 | CGTACTCCAGGGCAGCATTG | HYS的RT-PCR内参基因扩增 |
sigW- RT -1 | GCAACACCGAAGATATCGTC | HYS的RT-PCR sigW扩增 |
sigW - RT -2 | TGCCAATCGGCACATCCA | HYS的RT-PCR sigW扩增 |
rsiW - RT -1 | TACGGTTTTACCCCGCTAGGT | HYS的RT-PCR rsiW扩增 |
rsiW -RT -2 | GTCGGTTCGCTCACCACT | HYS的RT-PCR rsiW扩增 |
rsiW -in-1 | AACGTGCGCCGTGAGTTG | HYS的rsiW转录检测 |
rsiW -in -2 | CGTCGGTTCGCTCACCACT | HYS的rsiW转录检测 |
sigW -in-1 | TGCGTCGCTTCGCCCTGT | HYS的sigW转录检测 |
sigW -in -2 | GCGACAAGCGTGACATTACCG | HYS的sigW转录检测 |
sigWrsiW- in-1 | TCGATCCTGTACCGGCAGTTT | HYS共转录检测 |
sigWrsiW-in -2 | TAGCGGGGTAAAACCGTAGG | HYS共转录检测 |
rsiW -com-3 | ATGAGCTTGATCCCGTCCGA | rsiW酵母双杂交扩增 |
rsiW -com -4 | CTACAAAGTGATACCAAGCGCCTG | rsiW酵母双杂交扩增 |
rsiW -N-com-1 | ATGAGCTTGATCCCGTCCGA | rsiW - N酵母双杂交扩增 |
rsiW -N-com -2 | TCAGCGCCGTTGCCG | rsiW - N酵母双杂交扩增 |
rsiW -C-com-1 | ATGCGCGAGGCGAGCCCT | rsiW - C酵母双杂交扩增 |
rsiW -C-com -2 | CTACAAAGTGATACCAAGCGCCTG | rsiW - C酵母双杂交扩增 |
sigW -com-3 | ATGAACGAACTAGACGACGAGC | sigW酵母双杂交扩增 |
sigW -com-4 | TCATTTCAACCTCCGCAGCG | sigW酵母双杂交扩增 |
表1 本研究中所用引物
引物名称 | 序列(5'-3') | 用途 |
---|---|---|
M13-47 | AGGGTTTTCCCAGTCACG | 回补检测 |
M13-48 | GAGCGGATAACAATTTCACAC | 回补检测 |
rsiW -up-1 | CGGAATTCGCCGGTACGA | rsiW上游同源臂扩增 |
rsiW -up-2 | CGGGATCCGATCAAGCTCATTTC | rsiW上游同源臂扩增 |
rsiW -down-1 | CGGGATCCATCACTTTGTAGCTG | rsiW下游同源臂扩增 |
rsiW -down-2 | CCCAAGCTTGAGATTGATTCT | rsiW下游同源臂扩增 |
rsiW -M-1 | GCCCTTGGCGTGATTCTTA | rsiW敲除检测 |
rsiW -M-2 | CACCTGGATGGATTAGACTCAA | rsiW敲除检测 |
rsiW -com-1 | CCAAGCTTTGTCACGCTTGTCG | HYS的rsiW片段扩增 |
rsiW -com -2 | CGGAATTCGCGGATACCTCG | HYS的rsiW片段扩增 |
sigW -up-1 | CGGGATCCACTTGCTGGTAGAA | sigW上游同源臂扩增 |
sigW -up-2 | CGGAATTCTAGTTCGTTCATTGC | sigW上游同源臂扩增 |
sigW -down-1 | CGGAATTCAAATGAGCTTGA | sigW下游同源臂扩增 |
sigW -down-2 | CCAAGCTTGTAGGCCGAGA | sigW下游同源臂扩增 |
sigW -M-1 | GCTGGCGTAGGTCGTGTTG | sigW敲除检测 |
sigW - M-2 | CTTACGCCCCTAATGGCA | sigW敲除检测 |
sigW -com-1 | CCAAGCTTGTCTGCTTCGTACAC | HYS的sigW片段扩增 |
sigW -com -2 | CGGAATTCTCGGACGGGAT | HYS的sigW片段扩增 |
sigWrsiW -up-1 | CGGGATCCCTGAACACCCTCG | sigWrsiW上游同源臂扩增 |
sigWrsiW -up-2 | CGGAATTCGTCTAGTTCGTTCATTGC | sigWrsiW上游同源臂扩增 |
sigWrsiW -down-1 | CGGAATTCGGTATCACTTTGTAGCTG | sigWrsiW下游同源臂扩增 |
sigWrsiW -down-2 | CCAAGCTTGCCTTCGAGCCGA | sigWrsiW下游同源臂扩增 |
sigWrsiW -M-1 | AGGTCGTGTTGCAGGTAGTCGTTG | sigWrsiW敲除检测 |
sigWrsiW - M-2 | GCGATGCTCCCGATAGAGGC | sigWrsiW敲除检测 |
sigWrsiW -com-1 | CCAAGCTTCACTGATCGCCTACA | HYS的sigWrsiW片段扩增 |
sigWrsiW -com -2 | CGGAATTCCGTGCGCTTCA | HYS的sigWrsiW片段扩增 |
rpoB -RT-1 | CGGGAGCGACCAAAGATCAG | HYS的RT-PCR内参基因扩增 |
rpoB - RT -2 | CGTACTCCAGGGCAGCATTG | HYS的RT-PCR内参基因扩增 |
sigW- RT -1 | GCAACACCGAAGATATCGTC | HYS的RT-PCR sigW扩增 |
sigW - RT -2 | TGCCAATCGGCACATCCA | HYS的RT-PCR sigW扩增 |
rsiW - RT -1 | TACGGTTTTACCCCGCTAGGT | HYS的RT-PCR rsiW扩增 |
rsiW -RT -2 | GTCGGTTCGCTCACCACT | HYS的RT-PCR rsiW扩增 |
rsiW -in-1 | AACGTGCGCCGTGAGTTG | HYS的rsiW转录检测 |
rsiW -in -2 | CGTCGGTTCGCTCACCACT | HYS的rsiW转录检测 |
sigW -in-1 | TGCGTCGCTTCGCCCTGT | HYS的sigW转录检测 |
sigW -in -2 | GCGACAAGCGTGACATTACCG | HYS的sigW转录检测 |
sigWrsiW- in-1 | TCGATCCTGTACCGGCAGTTT | HYS共转录检测 |
sigWrsiW-in -2 | TAGCGGGGTAAAACCGTAGG | HYS共转录检测 |
rsiW -com-3 | ATGAGCTTGATCCCGTCCGA | rsiW酵母双杂交扩增 |
rsiW -com -4 | CTACAAAGTGATACCAAGCGCCTG | rsiW酵母双杂交扩增 |
rsiW -N-com-1 | ATGAGCTTGATCCCGTCCGA | rsiW - N酵母双杂交扩增 |
rsiW -N-com -2 | TCAGCGCCGTTGCCG | rsiW - N酵母双杂交扩增 |
rsiW -C-com-1 | ATGCGCGAGGCGAGCCCT | rsiW - C酵母双杂交扩增 |
rsiW -C-com -2 | CTACAAAGTGATACCAAGCGCCTG | rsiW - C酵母双杂交扩增 |
sigW -com-3 | ATGAACGAACTAGACGACGAGC | sigW酵母双杂交扩增 |
sigW -com-4 | TCATTTCAACCTCCGCAGCG | sigW酵母双杂交扩增 |
HYS突变株编号 | HYS基因编号 | HYS插入位置 | HYS蛋白编号 |
---|---|---|---|
0201 7A | UW3_RS0125385 | 24892-24893 | WP_010226811.1 |
表2 东湖假单胞菌HYS转座子插入突变株
HYS突变株编号 | HYS基因编号 | HYS插入位置 | HYS蛋白编号 |
---|---|---|---|
0201 7A | UW3_RS0125385 | 24892-24893 | WP_010226811.1 |
图5 RsiW与SigW酵母双杂交 A:杂交后的二倍体细胞影印到平板SC-Ura-Leu-His;B:杂交后的二倍体细胞影印到平板SC-Ura-Leu-His + 5 mmol/L 3-AT;C:杂交后的二倍体细胞影印到平板SC-Ura-Leu-His-Ade;D:将杂交后的二倍体细胞影印到上述三种平板后结果的处理图,其中“”代表横纵轴处的菌种杂交后的二倍体细胞在能在平板SC-Ura-Leu-His生长,“”代表横纵轴处的菌种杂交后的二倍体细胞在能在平板SC-Ura-Leu-His + 5 mmol/L 3-AT生长,“”代表横纵轴处的菌种杂交后的二倍体细胞在能在平板SC-Ura-Leu-His-Ade生长
[1] |
Gao JW, Xie GF, Peng F, et al. Pseudomonas donghuensis sp. nov. , exhibiting high-yields of siderophore[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2015,107(1):83-94.
URL pmid: 25331337 |
[2] |
Spiers AJ, Buckling A, Rainey PB. The causes of Pseudomonas diversity[J]. Microbiology, 2000,146:2345-2350.
URL pmid: 11021911 |
[3] |
Breidenstein EB, de la Fuente-Nunez C, Hancock RE. Pseudomonas aeruginosa:all roads lead to resistance[J]. Trends in Microbiology, 2011,19:419-426.
URL pmid: 21664819 |
[4] |
Xie GF, Zeng M, You J, et al. Pseudomonas donghuensis HYS virulence towards Caenorhabditis elegans is regulated by the Cbr/Crc system[J]. Scientific Reports, 2019,9(1):8772.
URL pmid: 31217473 |
[5] |
Llamas MA, Imperi F, et al. Cell-surface signaling in Pseudomonas:stress responses, iron transport, and pathogenicity[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2014,38:569-597.
URL pmid: 24923658 |
[6] |
Burgess RR, Travers AA, et al. Factor stimulating transcription by RNA polymerase[J]. Nature, 1969,221(5175):43-46.
URL pmid: 4882047 |
[7] | Otero-Asman JR, Wettstadt S, et al. Diversity of extracytoplasmic function sigma(σECF)factor-dependent signaling in Pseudomonas[J]. Molecu Microb, 2019,112(2):356-373. |
[8] |
Blanka A, Schulz S, Eckweiler D, et al. Identification of the alternative sigma factor SigX regulon and its implications for Pseudomonas aeruginosa pathogenicity[J]. Journal of Bacteriology, 2014,196(2):345-356.
URL pmid: 24187091 |
[9] |
Quesada JM, Otero-Asman JR, Bastiaansen KC, et al. The activity of the Pseudomonas aeruginosa virulence regulator σ(VreI)is modulated by the anti-σ factor VreR and the transcription factor PhoB[J]. Frontiers in Microbiology, 2016,7:1159.
URL pmid: 27536271 |
[10] |
Nie WC, He F, Yuan SM, et al. Roles of an N-terminal coiled-coil-containing domain in the localization and function of Bem3, a Rho GTPase-activating protein in budding yeast[J]. Fungal Genetics and Biology, 2017,99:40-51.
URL pmid: 28064039 |
[11] |
Rowen DW, Deretic V. Membrane-to-cytosol redistribution of ECF sigma factor AlgU and conversion to mucoidy in Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients[J]. Molecular Microbiology, 2000,36(2):314-327.
URL pmid: 10792719 |
[12] |
Heinrich J, Hein K, Wiegert T. Two proteolytic modules are involved in regulated intramembrane proteolysis of Bacillus subtilis RsiW[J]. Molecular Microbiology, 2009,74(6):1412-1426.
URL pmid: 19889088 |
[13] |
Devkota SR, Kwon1 E, Ha SC, et al. Structural insights into the regulation of Bacillus subtilis SigW activity by anti-sigma RsiW[J]. PLoS One, 2017,12(3):e0174284.
doi: 10.1371/journal.pone.0174284 URL |
[14] |
Zweers JC, Nicolas P, Wiegert T, et al. Definition of the σ W regulon of Bacillus subtilis in the absence of stress[J]. PLoS One, 2012,7(11):e48471.
doi: 10.1371/journal.pone.0048471 URL pmid: 23155385 |
[15] |
Asai K, Yamaguchi K, Kang CM, et al. DNA microarray analysis of Bacillus subtilis sigma factors of extracytoplasmic function family[J]. FEMS Microbiology Letters, 2003,220:155-160.
URL pmid: 12644242 |
[16] |
Yoshimura M, Asai K, Sadaie Y, et al. Interaction of Bacillus subtilis extracytoplasmic function(ECF)sigma factors with the N-terminal regions of their potential anti-sigma factors[J]. Microbiology, 2004,150:591-599.
URL pmid: 14993308 |
[17] |
Potvin E, Sanschagrin F, Levesque RC. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2008,32(1):38-55.
URL pmid: 18070067 |
[18] |
Chevaliera S, Bouffartiguesa E, Bazireb A, et al. Extracytoplasmic function sigma factors in Pseudomonas aeruginosa[J]. BBA - Gene Regulatory Mechanisms, 2019,1862(7):706-721.
doi: 10.1016/j.bbagrm.2018.04.008 URL pmid: 29729420 |
[19] |
Llamas MA, van der Sar A, Chu BC, et al. A novel extracytoplasmic function(ECF)sigma factor regulates virulence in Pseudomonas aeruginosa[J]. PLoS Pathogens, 2009,5(9):e1000572.
doi: 10.1371/journal.ppat.1000572 URL pmid: 19730690 |
[20] | 胡莉, 谭泽文, 郜晨, 等. Sigma因子高效调控微生物多功能研究进展[J]. 生命科学, 2018,30(3):285-292. |
Hu L, Tan ZW, Gao C, et al. Advances in the high efficient regulation of microbiological functions by sigma factors[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2018,30(3):285-292. | |
[21] |
Yu H, Boucher JC, Hibler NS, et al. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU[J]. Infection and Immunity, 1996,64(7):2774-2781.
URL pmid: 8698507 |
[1] | 陈宝强, 李莹莹, 马博雅, 肉扎古丽·马利克, 优丽图孜·乃比, 宋金迪, 刘君, 王希东. 西瓜食酸菌III型分泌效应物基因aop2功能分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 286-297. |
[2] | 王万顺, 付强, 魏玉荣, 胡新艳, 陈俊贞, 李泽宇, 史慧君. 慢病毒介导Occludin过表达影响BVDV感染BALB/c小鼠的研究[J]. 生物技术通报, 2022, 38(6): 291-298. |
[3] | 龚晓惠, 杨敏, 李舒婷, 林晟豪, 许文涛. 银纳米簇抗菌机理、活性及其应用的研究进展[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 212-220. |
[4] | 付强, 陈俊贞, 郭妍婷, 姚刚, 冉多良, 史慧君. 应用CRISPR/Cas9技术敲除SERPINF2基因对牛病毒性腹泻病毒复制的影响[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 267-272. |
[5] | 付强, 郭妍婷, 陈俊贞, 王金泉, 史慧君. 牛病毒性腹泻病毒离子孔道蛋白p7多肽多克隆抗体的制备和鉴定[J]. 生物技术通报, 2021, 37(10): 137-142. |
[6] | 王亚楠, 文海若, 王雪. 基于L5178Y细胞体外Pig-a基因突变试验方法的建立与初步探索[J]. 生物技术通报, 2020, 36(1): 220-228. |
[7] | 张文君, 吴梦婷, 吕春艳, 王晴, 陈泳霖. 介孔二氧化硅在药物递送系统及其体内外研究进展[J]. 生物技术通报, 2019, 35(12): 159-168. |
[8] | 林胜红, 潘晓梅, 石晓玲, Ihsan Ali, 刘震飞, 于爽, 张锦锋, 牛振峰, 田永强. 土壤霉菌菌丝球的筛选、鉴定及固定化菌丝球的应用[J]. 生物技术通报, 2019, 35(1): 76-81. |
[9] | 任亚林, 李耘, 吴静. AFB1和ZEN对HepG2细胞体外联合毒性效应及机制研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(11): 160-167. |
[10] | 吕鹏, 徐嘉擎, 王森, 闫艳春. 杀菌剂苯并异噻唑啉酮对斑马鱼胚胎的急性毒性和氧化应激效应研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(1): 172-182. |
[11] | 裘天休, 李长红, 陈炯. 大黄鱼Wap65-2基因成熟肽区酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定[J]. 生物技术通报, 2015, 31(8): 108-113. |
[12] | 余凯敏, 冯为民, 李国超, 张家禹, 刘丽丽, 闫艳春. 毒死蜱的环境生物学效应分析[J]. 生物技术通报, 2015, 31(8): 225-230. |
[13] | 徐丹, 李帅, 张敏, 孙野青. 硫丹的生物学效应研究进展[J]. 生物技术通报, 2013, 0(5): 45-51. |
[14] | 汪小杰,毛若雨,张勇,滕达,王秀敏,王建华. SUMO在蛋白表达中的应用[J]. 生物技术通报, 2013, 0(10): 28-33. |
[15] | 赵雪娜;董相陈;侯登勇;孙丽霞;王晶翼;王庆民;. 白喉毒素突变体CRM197在大肠杆菌中表达纯化及性质研究[J]. , 2010, 0(01): 153-156. |
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