一种大量提取红豆杉中总RNA的方法研究

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0319

生物技术通报 ›› 2017, Vol. 33 ›› Issue (11): 60-66.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0319

一种大量提取红豆杉中总RNA的方法研究

陈小凤, 曾奇峰, 邓旭, 曾光尧, 周应军

中南大学湘雅药学院,长沙 410013

收稿日期:2017-04-19 出版日期:2017-11-26 发布日期:2017-11-22
作者简介:陈小凤,女,硕士研究生,研究方向：天然药物化学成分提取与分离;E-mail：929506981@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金项目（81573314）

A Method for Extracting Total RNA of Taxus chinensis at Large-scale

CHEN Xiao-feng, ZENG Qi-feng, DENG Xu, ZENG Guang-yao, ZHOU Ying-jun

Xiangya School of Pharmaceutical Science,Central South University,Changsha 410013

Received:2017-04-19 Published:2017-11-26 Online:2017-11-22

摘要/Abstract

摘要： 旨在确定高质量红豆杉中总RNA的提取和纯化工艺条件。以湖南长沙红豆杉叶为材料,以Trizol和CATB两种植物RNA通用提取方法为基础,以RNA的浓度、OD₂₆₀/OD₂₈₀及OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值为标准,考察提取方法、提取试剂、提取时间等因素对RNA提取率的影响,优化了红豆杉叶中总RNA的提取方法;通过对比PVP法、β-巯基乙醇法、高盐沉淀法、低浓度乙醇沉淀法、凝胶柱层析法五种不同纯化方法来探讨对红豆杉RNA的影响。考虑到成本的问题,选择使用Trizol法提取红豆杉总RNA,确定了较优的提取条件：红豆杉叶与Trizol提取液的作用体积确定为3∶40;裂解时间确定为5 min;氯仿与水液的作用体积确定为1∶5。实验表明凝胶柱层析法能显著的提高红豆杉总RNA的纯度并能得到富含miRNA的小分子RNA。最终可得到浓度约为1 000 μg/mL,OD_260/OD₂₈₀在2.00-2.20之间及OD_260/OD₂₃₀大于1.7的高质量RNA样品。与现有的提取方法相比,本方法提取的红豆杉总RNA具有很高的质量和纯度,且大大降低了提取成本,并首次实现了植物总RNA的大量提取。

关键词: 红豆杉, 总RNA提取, Trizol法, CATB法, 凝胶柱层析法

Abstract: This study was directed to develop the optimal method for the extraction and purification of total RNA in Taxus chinensis R. First,we investigated the effects of extraction reagent,time,and method on the yield of total RNA from T. chinensis R. using Trizol and CATB extraction methods in respect of RNA concentration and the ratios of OD₂₆₀/OD₂₈₀ and OD₂₆₀/OD₂₃₀. Furthermore,we compared the effects of PVP,β-mercaptoethanol,high salt precipitation,low concentration ethanol precipitation and gel column chromatography on the purification of total RNA. The optimal extraction method was determined as follows：treatment of taxus leaves with Trizol by the action volume of 3：40 in 5 minutes using chloroform and water（1：5）as solvent. It’s also found that column chromatography significantly improved the purity of total RNA of taxus and obtained small molecular RNA with rich miRNA. Finally,the high-quality RNA in concentration of 1000µg/mL with 2.00 - 2.20 of OD₂₆₀/OD₂₈₀ and 1.7 of OD₂₆₀/OD₂₃₀was acquired. Compared with previous methods,this method provides taxus RNA in large-scale with high quality and purity as well as with low cost,which guarantees sufficient materials.

Key words: Taxus chinensis R., total RNA extraction, Trizol method, CATB method, gel column chromatography

陈小凤, 曾奇峰, 邓旭, 曾光尧, 周应军. 一种大量提取红豆杉中总RNA的方法研究[J]. 生物技术通报, 2017, 33(11): 60-66.

CHEN Xiao-feng, ZENG Qi-feng, DENG Xu, ZENG Guang-yao, ZHOU Ying-jun. A Method for Extracting Total RNA of Taxus chinensis at Large-scale[J]. Biotechnology Bulletin, 2017, 33(11): 60-66.

参考文献

[1] Hao DC, Xiao PG, Yang L. Phylogenetic relationships of the genus Taxus inferred from chloroplast intergenic spacer and nuclear coding DNA[J]. Biol Pharm Bull, 2008, 31（2）：260-265.
[2] Hao DC, Xiao PG, Huang BL, et al. Interspecific relationships and origins of Taxaceae and Cephalotaxaceae revealed by partitioned Bayesian analyses of chloroplast and nuclear DNA sequences[J]. Plant Syst Evol, 2008, 276（1-2）：89-104.
[3] Wani MC, Taylor HL, Harold L, et al. Plant antitumor agents. VI. Isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia[J]. J Amer Chem Soc, 1971, 93（9）：2325-2327.
[4] Schiff PB, Fant J, Horwitz SB, et al. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol[J]. Nature（London）：1979, 277（5698）：665-667.
[5] 张静, 植物红豆杉的抗癌药用价值研究[J]. 中国药业 2014, （1）：1-3.
[6] 李良松, 冯仲科, 刘德庆, 红豆杉名实与功用通考[J]. 中国中药杂志, 2011（12）：1682-1685.
[7] Martin RC, Liu PP, Nonogaki H. MicroRNAs in seeds：modified detection techniques and potential applications[J]. Can J Bot, 2006, 84（2）：189-198.
[8] Liu PP, Montgomery TA, Fahlgren N, et al. Repression of AUXIN RESPONSE FACTOR10 by microRNA160 is critical for seed germination and post-germination stages[J]. Plant J, 2007, 52（1）：133-46.
[9] Nodine MD, Bartel DP. MicroRNAs prevent precocious gene expr- ession and enable pattern formation during plant embryogenesis[J]. Genes Dev, 2010, 24（23）：2678-2692.
[10] Kang MM, Zhao Q, Zhu DY, et al. Characterization of microRNAs expression during maize seed development[J]. BMC Genomics, 2012：13, 360.
[11] Abdin MZ, Israr M, Rehman RU, et al. A novel antimalarial drug：Biochemical and molecular approaches for enhanced production[J]. Planta Med, 2003, 69（4）：289-299.
[12] Hao D, Yang L, Liu M, et al. Identification of Taxus microRNAs and their targets with high-throughput sequencing and degradome analysis[J]. Physiol Plant, 2012, 146：388-403.
[13] 赵双宜, 吴耀荣, 夏光敏. 介绍一种简单高效的植物总RNA 提取方法[J]. 遗传, 2002, 34（3）：337-338.
[14] 李宏, 王新力. 植物组织 RNA 提取的难点及对策[J]. 生物技术通报, 1999（1）：36-39.
[15] 杨成君, 王军, 周莉, 等. 红果人参叶片RNA的提取[J]. 生物技术通报, 2008（1）：136-139.
[16] Couch JA, Fritz PJ. Isolation of DNA from plants high in polyphenolics[J]. Plant Mol Biol Rep, 1990, 8（1）：8-12.
[17] Bahloul M, Burkard G. An improved method for the isolation of total RNA from spruce tissues[J]. Plant Mol Biol Rep, 1993, 11（3）：212-215.
[18] Fang G, Hammar S, Grumet R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J]. BioTechniques, 1992, 13（1）：52-54, 56.
[19] Chang SJ, Puryear J, Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees[J]. Plant Mol Biol Rep, 1993, 11（2）：113-116.
[20] Manning K. Isolation of nucleic acids from plants by differential solvent precipitation[J]. Anal Biochem, 1991, 195（1）：45-50.

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A Method for Extracting Total RNA of Taxus chinensis at Large-scale

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[1]	蒋路园, 丰美静, 杜雨晴, 邸葆, 陈段芬, 邱德有, 杨艳芳. 红豆杉低温半致死温度和低温胁迫下紫杉烷含量[J]. 生物技术通报, 2023, 39(3): 232-242.
[2]	王刚, 罗建勋, 蒲尚饶, 李亚平, 王刚, 孙志鹏. 遮荫对云曼红豆杉活性成分10-DAB及矿质营养累积的影响[J]. 生物技术通报, 2022, 38(11): 175-184.
[3]	单婷婷 ,陈晓梅 ,郭顺星 ,王倩清 ,王爱荣. 石斛属植物茎部总RNA提取方法的研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(6): 54-58.
[4]	吴春太, 黎瑜, 冯伟瑜, 曾日中. 不同沉淀方法处理胶乳总RNA对基因扩增效率的影响[J]. 生物技术通报, 2016, 32(11): 124-129.
[5]	刘新星, 余响华, 刘学端. 红豆杉分布与培育技术研究进展[J]. 生物技术通报, 2015, 31(7): 51-57.
[6]	陈静,高飞,周宜君,张孜宸,李章磊,曹玉震,张至玮. 改良Trizol法提取高质量蒙古沙冬青总RNA[J]. 生物技术通报, 2013, 0(10): 87-92.
[7]	余响华,戴永强,邵金华. 乙醇提取红豆杉树叶紫杉醇醇提条件的研究[J]. 生物技术通报, 2013, 0(10): 98-102.
[8]	张庆波, 陈玉婵, 李浩华, 潘清灵, 王磊, 李冬利, 陶美华, 章卫民. 南方红豆杉内生真菌的分离鉴定及其细胞毒活性研究[J]. 生物技术通报, 2013, 0(1): 172-177.
[9]	周佳;程新;李昆太;. 现代发酵技术在紫杉醇生产中的应用前景[J]. , 2012, 0(08): 59-63.
[10]	黄仕杰;陈平;陈晓阳;辛燕花;郭丽琼;林俊芳;. 外显子拼接法克隆紫杉烷2α-羟基化酶基因与生物信息学分析[J]. , 2011, 0(04): 186-192.
[11]	程抒劼;黄仕杰;郭丽琼;韩飞;林俊芳;. 南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析[J]. , 2011, 0(01): 107-112.
[12]	黄仕杰;程抒劼;郭心悦;郭丽琼;林俊芳;. 蔓地亚红豆杉3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶基因的克隆与序列分析[J]. , 2010, 0(12): 191-195.
[13]	何健行;陈乐;郭新伦;余有见;杨玲;. 番茄果实总RNA提取方法的优化[J]. , 2010, 0(08): 150-152.
[14]	姚宁涛;祝建波;邓福军;. 改良Trizol法快速提取棉叶片总RNA[J]. , 2010, 0(07): 125-127.
[15]	钟凤林;郭志雄;马传营;潘东明;. 琯溪蜜柚汁胞RNA提取方法的比较[J]. , 2010, 0(02): 109-112.