生物技术通报

果树赤霉素代谢与信号途径研究进展

王文然, 樊秀彩, 张文颖, 刘崇怀, 房经贵, 王晨

2017, 33(11): 1-7. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0650

摘要 ( 367 )

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赤霉素作为5大植物激素之一,在果树的花芽分化、花序发育、开花坐果、果实的生长发育及植株的形态建成等方面扮演着重要的角色,但对果树赤霉素的分子生物学研究与其他大田作物相比差距较大。为了在果树生产中能更加合理有效地利用赤霉素调控果树花果发育,研究果树赤霉素的合成及其信号转导途径的分子调控机制十分必要。研究发现GA合成的关键酶KO、GA2ox及GA20ox的表达均与果树矮化呈负相关,而KS的含量则与植株高矮呈正相关,板栗雄性不育现象也与KO、KAO的表达量密切相关。GAMYB基因及LFY基因则在果树的成花诱导和雄蕊发育等生殖生长过程中发挥重要作用。DELLA蛋白在果树的GA信号途径中作为负调控因子可致使矮化植株形成,在果树的细胞周期循环过程、转录调控、花的形成、细胞的信号转导及许多生理过程中,DELLA蛋白泛素化降解均扮演着至关重要的角色。主要从果树赤霉素的合成及赤霉素的信号途径两大方面,着重对果树赤霉素合成过程中的关键酶基因及其定位、果树赤霉素信号途径的重要元件如赤霉素受体GID1、DELLA蛋白等进行了综述,以期为高效利用赤霉素调控果树生长发育提供重要的理论参考。

芝麻诱发突变技术育种研究进展

于沐, 周秋峰, 赵建国, 张果果

2017, 33(11): 8-12. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0219

摘要 ( 248 )

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近年来,空间环境诱变、离子束辐照及核辐射传统诱变技术在我国改良农作物和发掘新基因中应用日趋活跃。诱发突变技术应用于芝麻新材料创制及新品种选育始于1950年,据国际诱变育成品种数据库的不完全统计,截至2017年3月,世界上60多个国家在217种植物上诱变了3 246个正式发布的突变品种,8个国家诱变了25个芝麻突变体,其中我国诱变5个芝麻突变体,占总量20%而位居世界第二。综述了芝麻诱变育种的成果及诱变获得的芝麻农艺性状、抗病性等性状突变,并对今后芝麻诱变育种的目标及方法进行了展望,以期为研究芝麻功能基因组学提供丰富的多样材料及芝麻种质创新提供重要的理论参考。

药用植物根际促生菌促生机理研究进展

曾美娟, 钟永嘉, 刁勇

2017, 33(11): 13-18. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0359

摘要 ( 219 )

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药用植物是中药体系中最重要的药物来源,是人类赖以防病治病的天然宝库。根际是植物与外界环境进行物质与能量交换的主要场所。根际促生菌能够改变药用植物根际土壤的理化性质,加快根际土壤有效养分的转化,产生相应的特定物质,进而影响着其生长、发育及代谢活动等,这些促生菌对植物生长起到极其重要的作用。就国内外近年来药用植物根际促生菌在固氮、溶磷、产生激素以及生物防治方面研究进展进行总结,旨在为药用植物的研究奠定理论基础,为应用于药用植物的栽培、生产及种质创新提供新思路。

植物核苷二磷酸激酶研究进展

朱馨妮, 汪珊珊, 周佳琴, 朱世华

2017, 33(11): 19-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0261

摘要 ( 278 )

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核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinases,NDPKs）是一类高度保守的蛋白,大小一般在70-100 kD,在生物体内大多数以六聚体形式存在,仅在少数原核生物中以四聚体形式存在。NDPK主要参与维持核苷二磷酸和核苷三磷酸的平衡。目前在植物中已发现4种NDPK：NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ和NDPKⅣ,相关研究主要集中在前3种。NDPKⅠ与植物生长发育、非生物胁迫、感病应激和激素响应有关;NDPKⅡ参与光合作用和活性氧清除;NDPKⅢ参与能量代谢和细胞程序性死亡;NDPKⅣ仅在拟南芥和水稻基因组中发现,预测定位于内质网,功能未知。除了上述的主要作用外,NDPK在某些植物中还有特殊功能,如参与DNA复制、参与淀粉和纤维素的合成、参与生长素调节和发挥核酶活性等。这些作用机制是否存在物种特异性还有待进一步的研究。对NDPK的系统进化、生物功能的最新进展进行了综述。最后对NDPK的发展趋势进行了展望,有助于将来对NDPK进行更深入和全面的研究。

高浓度CO₂下植物内源激素响应机制研究进展

王琦, 徐萌, 石鑫, 高嘉, 马莲菊, 王兰兰

2017, 33(11): 29-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0433

摘要 ( 178 )

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随着工业化的不断发展,特别是化石燃料的使用迅速增加,大气CO₂浓度随之不断上升。CO₂浓度的不断升高会很大程度的影响植物生长发育,而植物体内各种激素之间的相互协调是调节植物生长发育的重要途径。因此,研究大气CO₂浓度升高后植物内源激素含量的变化及内在响应机制将有重大的意义及发展前景。现阶段,对于高CO₂浓度下植物根系形态、生长发育等研究的比较广泛,但与植物内源激素相结合的研究还甚少。回顾了其他学者的研究成果,研究发现大气CO₂浓度升高能够加速净同化率,改善净光合,同时积累生长促进激素,减少生长抑制激素,从而调节同化物的分配,促进植物生长。并综述了植物的内源激素,包括生长素（IAA）、赤霉素（GA₃）、脱落酸（ABA）、细胞分裂素（CK）和乙烯（ET）对CO₂浓度升高的响应,分析了CO₂对于相关激素合成和信号转导途径中基因表达的影响,包括不同植物内源激素含量变化及其内在响应机制的研究进展,并展望本领域中有待深入的研究方向。

RNAi技术的最新研究进展

王伟伟, 刘妮, 陆沁, 凌晓霏, 陈航

2017, 33(11): 35-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0455

摘要 ( 302 )

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RNA干扰（RNA interference,RNAi）是真核生物中由双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）诱发同源mRNA降解,使靶基因沉默的现象。目前,RNAi技术作为基因调控的有效工具,具有高度特异性、高效、可传播等特点,被广泛用于病虫害防治、肿瘤及癌症治疗等领域。尤其在医学上的应用,相对于传统的疫苗预防和药物治疗而言,RNAi技术在靶点用药、减少副作用、抑制致病基因表达等方面具有不可比拟的优越性,在癌症等疾病治疗的新方法中发挥越来越重要的作用。主要介绍RNAi的作用机理、导入方法及其在植物改良、生物防治、昆虫抗药性、疾病的预防与治疗中的最新应用进展,并对其应用前景进行综合分析与评价,以期为相关领域的研究者提供参考。

抗癌肽研究进展

岳硕豪, 田弛, 胡元昭, 张军林

2017, 33(11): 41-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0424

摘要 ( 393 )

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随着全球癌症患病比例的逐年增加,癌症已经成为全球死亡的主要原因和重大的公共卫生问题。抗癌肽能破坏肿瘤细胞膜结构或抑制癌细胞增殖和迁移以及肿瘤血管的形成,几乎不表现溶血性且对正常的人体细胞基本无损伤等优点,已经成为抗肿瘤新药研究的一大热点。抗癌肽主要来源可分为4类：抗菌肽类如牛乳铁蛋白肽（LfcinB）、天蚕素等,对细菌等微生物具有广谱高效的抑制活性,同时能够抑制多种癌细胞的增殖和生长,诱导癌细胞凋亡;多肽激素类如心房利钠肽（ANP）以及在ANP形成过程中的其他一些多肽,在临床上具有增加血管通透性、降压、利钠、利尿、舒张血管平滑肌、调节水盐平衡和抑制细胞增殖等作用,最近研究发现它们可以直接杀死肿瘤细胞或强力抑制癌细胞DNA的合成,从而抑制癌细胞的生长;多肽毒素类如蜂毒、蛇毒、蝎毒等毒性较强的生物毒素,对多种肿瘤均有抑制作用;内皮抑制素可以抑制肿瘤血管的生成抑制癌细胞的生长和转移。抗癌肽主要通过诱导细胞凋亡、破坏细胞的膜结构,改变细胞周围或细胞内pH以及增强免疫应答等多种机制来抑制癌细胞增殖。综述抗癌肽的来源、抑癌机理,并对抗癌肽的应用前景进行分析,旨为抗癌肽的深入研究和开发应用提供参考。

核酸适配子结合无机纳米材料在肿瘤研究中的应用

彭立, 张兴梅

2017, 33(11): 48-53. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0301

摘要 ( 175 )

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在倡导精准医疗的今日,在基本掌握与肿瘤发生密切相关的靶点的机理后,如何实现肿瘤靶向治疗,尽量消减由治疗带来的不良反应显得尤为关键。核酸适配子是能与靶标以高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸;无机纳米材料是纳米材料作为医学领域诊疗制剂中重要的组成部分;利用核酸适配子与靶标结合的特性将其与无机纳米材料结合后,可将靶向结合、生物成像及药物递送等特点集于一体,综合应用于肿瘤研究,同时有力于促进核酸纳米技术的发展。综述了近年不同无机纳米材料结合核酸适配子在肿瘤研究领域中的研究进展,以及对无机纳米材料在医学应用的安全性思考,以期早日实现新型靶向肿瘤治疗策略的开发。

牛卵母细胞及着床前胚胎发育的蛋白质组学研究进展

濮黎萍, 陈富美, 赵秀玲, 王焕景, 候振, 徐壮壮, 张鹏飞, 张明

2017, 33(11): 54-59. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0404

摘要 ( 198 )

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蛋白质组学作为一种能够全景式展示特定生物学过程的蛋白质表达谱的高通量研究手段,正被应用到越来越多的研究领域。牛的卵子发生以及着床前胚胎的生长发育都离不开蛋白质的一系列变化,通过蛋白质组学的研究手段可对牛卵母细胞成熟以及胚胎发育分子机制进行研究。前人通过构建成熟前后的卵母细胞或不同时期的着床前胚胎等的蛋白质组表达谱,来获得与卵母细胞成熟相关的标志蛋白,并对这些标志物进行验证和分析,将有利于理解牛卵母细胞成熟、体外受精及着床前胚胎发育的分子机制,为提高牛卵母细胞的成熟率以及胚胎的发育率及提高牛繁殖率等奠定基础。主要从双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、色谱技术以及质谱技术等蛋白质组学研究手段为切入点,对蛋白质组学在牛卵母细胞和着床前胚胎发育过程中的研究进展进行综述,为进一步研究牛卵母细胞及附植前胚胎提供参考。

一种大量提取红豆杉中总RNA的方法研究

陈小凤, 曾奇峰, 邓旭, 曾光尧, 周应军

2017, 33(11): 60-66. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0319

摘要 ( 216 )

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旨在确定高质量红豆杉中总RNA的提取和纯化工艺条件。以湖南长沙红豆杉叶为材料,以Trizol和CATB两种植物RNA通用提取方法为基础,以RNA的浓度、OD₂₆₀/OD₂₈₀及OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值为标准,考察提取方法、提取试剂、提取时间等因素对RNA提取率的影响,优化了红豆杉叶中总RNA的提取方法;通过对比PVP法、β-巯基乙醇法、高盐沉淀法、低浓度乙醇沉淀法、凝胶柱层析法五种不同纯化方法来探讨对红豆杉RNA的影响。考虑到成本的问题,选择使用Trizol法提取红豆杉总RNA,确定了较优的提取条件：红豆杉叶与Trizol提取液的作用体积确定为3∶40;裂解时间确定为5 min;氯仿与水液的作用体积确定为1∶5。实验表明凝胶柱层析法能显著的提高红豆杉总RNA的纯度并能得到富含miRNA的小分子RNA。最终可得到浓度约为1 000 μg/mL,OD_260/OD₂₈₀在2.00-2.20之间及OD_260/OD₂₃₀大于1.7的高质量RNA样品。与现有的提取方法相比,本方法提取的红豆杉总RNA具有很高的质量和纯度,且大大降低了提取成本,并首次实现了植物总RNA的大量提取。

核酸适配体筛选的改良与优化策略

李世雨, 傅强, 严亚贤

2017, 33(11): 67-75. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0469

摘要 ( 313 )

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核酸适配体以其类似抗体的功能及诸多优于抗体的特点引起人们的广泛关注,如何利用指数富集的配基系统进化技术（SELEX技术）来高效地筛选核酸适配体是其应用的关键。结合近些年核酸适配体的研究进展,为提高筛选效率及核酸适配体性能,针对适配体筛选三大不同环节所做的尝试及改良进行相关的阐述,包括初始随机寡核苷酸文库的设计与修饰、筛选过程所用方法及次级文库的制备、筛选过程后（Post-SELEX）核酸适配体性能的优化等;特别比较了筛选方法包括毛细管电泳SELEX、细胞SELEX、磁珠SELEX、加尾SELEX、微流控SELEX、微阵列SELEX和高通量SELEX,以及次级文库的制备方法诸如不对称PCR法、λ核酸外切酶法、磁珠法、不等长PCR法、综合性方法等;对核酸适配体发展面临的问题及发展前景进行探讨,以期为相关科研人员的研究提供参考。

外源ABA及其抑制剂钨酸钠对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响

邓昌哲, 安飞飞, 李开绵, 陈松笔

2017, 33(11): 76-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0349

摘要 ( 290 )

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旨在研究外源ABA及其抑制剂钨酸钠（Na₂WO₄）对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响。以木薯品种华南9号（Manihot esculenta Crantz SC9）为材料,HPLC测定块根β-胡萝卜素;Western blot分析相关蛋白表达量;QPCR分析相关基因表达量。结果显示,外源ABA及钨酸钠能提高块根β-胡萝卜素的含量;其中外源ABA与钨酸钠都提高了类胡萝卜素合成途径基因PSY2与LCYB表达,并抑制降解相关的ZEP与NCED3基因的表达,从而能够在转录水平的变化上解释β-胡萝卜素含量的变化,且LCYB与ZEP在转录与翻译水平具有一致性;与质体相关PAP1基因和FBN1a在处理下上调表达在一定程度上增加了质体小球的数量;外源ABA及钨酸钠使活性氧（ROS）相关的超氧化物歧化酶（Fe-SOD和Cu/Zn-SOD）表达量升高保护了块根中类胡萝卜素的稳定。这三者共同作用,提高了块根β-胡萝卜素的含量。

木薯MeTPS9基因克隆及表达特性分析

丁泽红, 付莉莉, 铁韦韦, 颜彦, 胡伟

2017, 33(11): 84-91. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0416

摘要 ( 194 )

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旨在揭示木薯MeTPS9基因在干旱、低温、遮荫等非生物胁迫应答中的作用。用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆MeTPS9基因（GenBank登录号：MF276889）,用MEGA软件构建系统进化树,用DnaSP软件分析基因结构变异,用PlantCARE分析启动子元件,用荧光定量PCR技术分析MeTPS9在不同组织中以及响应不同非生物胁迫的表达特性。结果显示,从木薯中克隆了一个TPS基因MeTPS9。该基因具有2 598 bp的开放阅读框,编码865个氨基酸,含有TPS家族保守结构域。系统进化树分析表明,MeTPS9与荠菜花和拟南芥中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别为76.2%和75.6%。基因结构变异发现,木薯野生种和栽培种之间共有66个突变位点,其中11个为错义突变。启动子元件分析表明,MeTPS9含有干旱相关元件MBS、低温相关元件LTR、热胁迫相关元件HSE、以及ABA相关元件ABRE。实时荧光定量PCR分析表明,MeTPS9的表达量在须根中最高,在叶片中最低。而且,MeTPS9基因的表达能被干旱、低温、和遮荫处理显著诱导。MeTPS9在转录水平对木薯干旱、低温、和遮荫胁迫起调控作用,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的作用。

蛋白激发子PeaT1与井冈霉素混合使用诱导烟草对TMV抗性的研究

彭智超, 仝赞华, 邱德文

2017, 33(11): 92-95. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0454

摘要 ( 177 )

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烟草病毒可侵染危害烟草、番茄、辣椒和土豆等多种作物导致病毒病发生,是生产上难以防治的病害。为了探索蛋白激发子PeaT1与井冈霉素混合使用对烟草病毒病防治的最佳混配比例,本研究选用3-7片真叶的本生烟（Nicotiana benthamiana cv. Huangmiaoyu）,分别喷施清水、井冈霉素、蛋白激发子PeaT1及蛋白激发子PeaT1-井冈霉素复合制剂,采用摩擦接种的方式接种TMV-GFP病毒,在紫外光下观察病毒的侵染情况。结果表明,喷施了井冈霉素和蛋白激发子复合制剂的本生烟对TMV的抗性较单剂具有增效作用,其中蛋白激发子PeaT1-井冈霉素按3：4混配的性价比最高,共毒系数达到157.64,相对防效为73.39%。这说明井冈霉素和蛋白激发子PeaT1都能使烟草产生对TMV的系统获得抗性,而其复合制剂更有着叠加效应。

甘草悬浮细胞肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）基因的克隆及表达分析

邹广平, 李雅丽, 冯梦薇, 杨修, 许智伟

2017, 33(11): 96-100. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0466

摘要 ( 207 )

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根据已报道的刺甘草C4H基因序列（GenBank ID：D87520.1）,采用RT-PCR技术克隆得到乌拉尔甘草悬浮细胞的C4H基因编码区序列,并对其进行生物信息学分析。另外,采用q-PCR方法对C4H基因受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）诱导后的表达模式进行分析。所克隆的C4H基因编码区开放阅读框（Opening reading frame,ORF）长为1 515 bp,编码504 个氨基酸。q-PCR实验证明C4H基因受MeJA的诱导,在悬浮体系添加MeJA后12 h达到最高表达水平。

花椒挥发油的提取及其抑菌抗虫活性测定

王珊珊, 吴昊, 李梁

2017, 33(11): 101-105. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0412

摘要 ( 215 )

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本实验研究了不同溶剂对花椒挥发油的提取效果,进行了花椒挥发油对不同菌种的抑菌实验,并探究了其对棉铃虫幼虫的拒食性和忌避性。实验结果表明：当乙醚作为提取剂时,提取率最高为8.77%;对不同菌种的抑菌效果无明显差别;乙醚提取的花椒挥发油对棉铃虫幼虫在拒食率及忌避率上均优于其他溶剂所提取的挥发油,对棉铃虫幼虫有着更好的抑制力。

一株野大豆内生真菌YD02菌株的鉴定及抗逆性研究

周振宇, 胡金丽, 苏昕, 刘冬雪, 卜宁, 马莲菊

2017, 33(11): 106-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0403

摘要 ( 219 )

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从野大豆组织中分离筛选出1株内生真菌菌株YD02,通过形态学观察和分子生物学方法对该菌株进行鉴定;用单因素实验和正交试验确定菌株的最佳发酵条件;采用菌丝干重法和对峙培养法分别测定菌株的抗重金属镉胁迫的能力以及对植物病原菌的影响。结果表明：YD02菌落黑色或墨绿色,菌丝分支且产孢;为链格孢属（Alternaria Nees）菌株;其最佳发酵条件是以PDB培养基为基础,蔗糖 4％,氯化铵 0.6％,磷酸氢二钾 0.4％,硫酸镁0.05％,pH5或pH9,培养温度28℃,装液量为60％,120 r/min发酵60 h;当镉浓度为140 mg/L时,YD02正常生长几乎停止。YD02菌株对瓜果腐霉病和苹果霉心病的病原菌具明显拮抗作用,抑菌率分别达到64.15%和71.68%。

利用PCR技术快速检测根际产ACC脱氨酶细菌

秦媛, 潘雪玉, 袁志林

2017, 33(11): 112-122. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0370

摘要 ( 285 )

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通过产生ACC脱氨酶降低胁迫乙烯水平并缓解盐胁迫危害,是植物根际促生菌（PGPR）促进宿主生长和抗逆的重要机制。本研究提出了利用PCR技术快速检测产ACC脱氨酶细菌的快捷方法。以编码ACC脱氨酶的acdS基因为标记,分别使用acdSf3/acdSr4、DegACCf/DegACCr和F1936f/F1938r三对引物,对多种盐生植物和美洲黑杨（Populus deltoids）的根部及根际土中分离得到的细菌菌株进行检测。结果表明,结合acdSf3/acdSr4引物和递减PCR（touchdown-PCR）方法时,能获得单一的特异性扩增条带且扩增成功率高;但DegACCf/DegACCr和F1936f/F1938r两对引物特异性较差。从247个菌株中检测到25株含有acdS基因,旨为今后研究植物根际细菌acdS基因遗传性及储备丰富的功能性菌株奠定基础。

可抑制致病菌的益生菌筛选及抑菌物质的初步确定

王利杰, 余晓斌, 方银兵, 顾秋亚

2017, 33(11): 123-129. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0411

摘要 ( 221 )

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为了得到可抑制致病菌的益生菌并初步确定其抑菌物质。从土壤、饲料添加剂和肥料添加剂3种样品中初筛能产生抑菌圈的菌株。用牛津杯法,对初筛得到的菌株和实验室保存的菌株进行复筛。对复筛的未知菌株进行形态学、16S rRNA基因序列和生理生化特征鉴定。对复筛菌株的发酵上清液进行酸碱作用验证、高温处理、蛋白酶处理、盐析处理和透析处理,再进行抑菌活力测定。结果显示复筛中有8株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌都有较强抑制作用的菌株。8株菌中有4株已知菌,4株未知菌。已知菌株分别为保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌。4株未知菌中3株被鉴定为地衣芽孢杆菌,1株被鉴定为乳酸片球菌。地衣芽孢杆菌能产生多种耐高温的抑菌物质,其中包含能透过8-14 kD透析袋的小分子和不能透过8-14 kD透析袋的大分子,初步判定为多肽类物质。5株产酸菌株产生的抑菌物质主要是酸性物质。

产β-葡萄糖苷酶细菌的筛选及转化白藜芦醇的研究

冯薇, 胡小妍, 马明娜, 郭萌, 路福平, 李玉

2017, 33(11): 130-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0439

摘要 ( 201 )

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白藜芦醇具有抗癌、抗氧化等八大功效,在医药、化妆品等领域应用广泛。为获得分泌β-葡萄糖苷酶的细菌菌株,并实现其对虎杖苷的有效转化。通过栀子苷平板初筛、虎杖苷摇瓶复筛,筛选得到一株能够分泌β-葡萄糖苷酶,转化虎杖苷生成白藜芦醇的菌株,并利用16S rDNA序列对筛选得到的菌株进行鉴定,鉴定为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）,命名为CGMCC 13129,该菌株在37℃,接种量为7%,底物虎杖苷浓度为0.1%,pH为7,转化8 h的条件下,对底物虎杖苷的转化率可达90%以上,利用HPLC、HPLC-MS、¹H-NMR等手段检测转化产物为白藜芦醇,经甲醇萃取一次,纯度高达99.3%。

利用糖基转移酶UGT73B6在大肠杆菌中生物催化酚苷类天然产物

何庆林, 白艳芬, 周威, 殷华, 陈宁, 庄以彬, 刘涛

2017, 33(11): 136-142. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0363

摘要 ( 192 )

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植物红景天来源的糖基转移酶UGT73B6,具有底物宽泛性,能糖基化多种天然化合物。旨在实现在大肠杆菌中生物催化合成酚苷类化合物。利用糖基转移酶UGT73B6的催化活性,在大肠杆菌BL21（DE3）中饲喂7种不同酚类化合物,通过生物转化的方法,首次实现利用糖基转移酶UGT73B6催化8种糖苷化合物的合成,进一步探索了糖基转移酶UGT73B6的底物宽泛性。在此基础上,提供了一种通过微生物转化实现生物合成酚苷类化合物的方法,具有较大的应用价值。

谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶G359D突变解除赖氨酸与苏氨酸协同抑制的研究

徐德雨, 郑小梅, 赵晶, 郑平, 赵树欣

2017, 33(11): 143-152. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0387

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天冬氨酸激酶（Aspartate Kinase,AK）是赖氨酸合成途径中关键酶,其受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,旨在发现其解除协同抑制的新突变体并解析其机理。通过对赖氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum ZL5与野生型C. glutamicum ATCC 13032的天冬氨酸激酶氨基酸序列比对,发现在高产菌的天冬氨酸激酶中存在G359D突变。通过体外天冬氨酸激酶野生型和G359D突变体酶活检测,发现该G359D突变体在10 mmol/L赖氨酸和苏氨酸同时存在时仍保留了76.94%±1.61%的酶活,而野生酶的酶活仅残留4.38%±1.28%。这一结果在赖氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌的回复突变中也可得到验证,其回复突变后使赖氨酸产量下降15.57%。通过同源建模和结构分析发现,与野生酶相比,G359D突变体结合赖氨酸后,其位于活性中心附近的Arg¹⁵¹与Glu⁷⁴之间无法形成离子键,允许底物分子的结合而具有较高活性。发现天冬氨酸激酶G359D突变体可阻断赖氨酸引起的别构效应,从而有效解除赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。

一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选、鉴定及发酵优化

来蒋丽, 刘姝, 胡晟源, 顾张慧, 王淑军, 房耀维

2017, 33(11): 153-159. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0413

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利用对硝基-N-乙酰苯胺筛选培养基从海州湾海域海泥中筛选获得产几丁质脱乙酰酶细菌MCDA02。经过形态学、生理生化和16S rDNA序列分析初步鉴定该菌株为解角质素微杆菌。通过单因素优化和正交试验优化,得出最优发酵条件。在单因素优化基础上,利用正交试验优化获得菌株MCDA02最优发酵条件为发酵温度25℃,培养基起始pH7.0,装液量50 mL/250 mL,几丁质3%,发酵时间48 h。在此发酵条件下,菌株MCDA02发酵水平达到158.47 U/mL,是优化前的3.2倍。试验结果为菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶的进一步研究奠定基础。

氮胁迫对埃氏小球藻生长及油脂积累的影响

程蔚兰, 邵雪梅, 宋程飞, 史飞飞, 季春丽, 李润植

2017, 33(11): 160-165. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0519

摘要 ( 230 )

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以生长快、可除污的埃氏小球藻株系SXND-25为试材,研究不同氮浓度培养条件对其生物量和油脂产量的影响,以期建立优化培养体系利用该株小球藻生产优质生物燃油。以硝酸钠为氮源、BG11培养基中的氮浓度为基准（1.5 g/L）,设置氮浓度梯度对小球藻进行培养。通过光密度测定、尼罗红染色、转酯化法抽提油脂和GC分析,对小球藻生物量、油脂含量及脂肪酸组分进行分析。结果显示,培养8 d时,在氮浓度为1.5 g/L时,生物量达到最大,干重为3.4 g/L,而油脂含量仅为28.24%,油脂产量为0.96 g/L;在氮浓度为0 g/L时生物量最小,干重为0.49 g/L,而油脂含量最高,为44.57%,油脂产量为0.22 g/L;在氮浓度为0.75 g/L时,干重为3.2 g/L,油脂含量为40.36%,油脂产量最高为1.3 g/L,是标准氮浓度下油脂产量的1.4倍。0.75 g/L氮浓度下连续培养8 d,藻油脂肪酸组成更适于制取优质生物柴油。综合生物量、油脂含量及脂肪酸组成等指标,确定0.75 g/L氮浓度为该埃氏小球藻株系规模化培养以生产优质生物燃油的优化参数。

大黄鱼Lc-UBE2D4基因的克隆及其表达分析

韩坤煌, 周鹏, 邹志华, 张子平, 王艺磊

2017, 33(11): 166-173. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0451

摘要 ( 209 )

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泛素缀合酶E2是蛋白质泛素化系统中的关键酶,对降解的靶蛋白的特异性选择起决定性作用,参与了细胞内80%以上的蛋白降解,对于细胞周期调控、细胞凋亡、基因转录及表达等生理活动具有重要的调控作用。本研究从已构建的大黄鱼（Larimichthys crocea）性腺线性化cDNA文库中筛选出泛素缀合酶（Ubiquitin-conjugating enzymes E2 D4,Lc-UBE2D4）同源基因片段,利用SMART-RACE方法克隆出其全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR技术检测其在大黄鱼不同组织和性腺不同发育阶段的差异表达情况。结果显示,Lc-UBE2D4基因全长798 bp,其中ORF为441 bp,可编码147个氨基酸,含有一段典型的泛素缀合酶UBC结构域及其半胱氨酸激活位点。定量PCR结果分析发现,Lc-UBE2D4在脾脏和性腺中表达量较高,在脾脏和精巢的表达水平极显著高于其他各组织（P<0.01）,同时在卵巢中的表达亦显著高于除脾脏和精巢外的其他各组织（P<0.05）;通过对Lc-UBE2D4基因在性腺不同发育阶段表达模式的研究发现,该基因在精巢3个时期中的表达水平显著高于各发育阶段的卵巢（P<0.05）,推测Lc-UBE2D4基因在大黄鱼性腺发育过程中起着重要的调节作用,脾脏中的高表达也暗示其可能参与免疫机能。

华细辛实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

赵晓冰, 潘磊, 柳威, 林懋怡, 李宏庆, 刘忠

2017, 33(11): 174-179. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0352

摘要 ( 258 )

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选择合适的内参基因是准确分析目标基因表达水平变化的重要条件。选取SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP2、GAPDH、TUB 6个常用的内参基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,通过geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等软件分析和评价6个候选内参基因在华细辛营养生长期、花期和花后期等不同生长阶段的根、根茎、叶片、叶柄等不同组织中的表达稳定性,筛选适宜华细辛不同生长阶段不同组织基因表达水平分析的内参基因。结果表明,18S rRNA在华细辛所有样品中表达最为稳定,是进行华细辛基因表达水平分析的适宜的内参基因。研究结果可为华细辛重要活性成分生物合成途径相关基因的功能分析,以及基因差异表达的研究提供有效的校正工具,确保基因表达分析结果的准确性与可靠性。

应用CRISPR/Cas9系统下调长链非编码RNA HOTAIR

刘宏博, 郑鹏, 印泽, 张同存

2017, 33(11): 180-187. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0394

摘要 ( 253 )

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近来CRISPR/Cas9系统作为一种成熟的基因编辑工具,被广泛应用。然而由于长链非编码RNA特殊的结构,该系统针对其研究的报道并不多见。选取与肿瘤生成、发展密切相关的长链非编码RNA HOTAIR为研究对象,通过构建Cas9核酸酶稳定遗传表达细胞株,建立pgRNA文库,对其进行基因敲除。qRT-PCR结果显示,pgRNA/Cas9系统靶向HOTAIR基因可使其表达下调60%。MTT增殖检测及细胞划痕实验结果表明：此系统介导的HOTAIR下调可明显抑制HeLa细胞的增殖与迁移。同时,肿瘤抑制因子p21、p53、pRB和DLC1转录水平的变化也暗示,HOTAIR对细胞功能的影响与其调控相关肿瘤抑制因子之间存在紧密联系。因此,利用Cas9技术抑制HOTAIR的表达对全面了解其功能具有重要意义。

人GPC3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

腾桥, 夏丽洁, 张富春

2017, 33(11): 188-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0379

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旨在构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican3,GPC3）原核蛋白,制备小鼠GPC3抗血清。扩增人 GPC3基因cDNA的完整的开放阅读框,克隆至pET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21表达菌株中诱导表达磷酯酰肌醇蛋白聚糖融合蛋白,利用亲和层析的方法纯化his-融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度,并测定蛋白含量;免疫Balb/c小鼠,制备抗血清。结果显示,成功制备了小鼠抗GPC3多克隆抗体,抗体滴度为1∶51 200,经Western blot检查特异性良好。原核表达的重组人GPC3蛋白具有较好的免疫原性。

抗结核海洋放线菌的筛选及菌株HY286生物活性研究

瞿佳, 赵玲侠, 陈锐, 路鹏鹏, 孙晓宇, 沈卫荣

2017, 33(11): 194-199. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0388

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海洋放线菌是研究抗结核药物及其先导化合物的重要来源。以耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Msm）作为指示菌,采用平板对峙法,从漳州浅滩泥土分离的77株放线菌中筛选出9株对Msm具有抑制作用的抗性放线菌,其中1株对Msm具有高效抑制作用的拮抗放线菌HY286。通过对菌株HY286的菌落形态观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析,初步鉴定其为一株马杜拉属放线菌。通过测定菌株HY286发酵产物的抗耻垢分枝杆菌MIC值、抗菌活性和细胞毒活性。结果表明,该菌株产生化合物的抗耻垢分枝杆菌MIC值为200 μg/mL,具有较好的抗结核分枝杆菌的潜力,且对枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌也具有较好的抑制作用,对HeLa和HepG2的抑制率分别为89.3%和94.2%。

ANGPTL8调控糖代谢作用机制研究

马石楠, 李忠耀, 郭兴荣

2017, 33(11): 200-206. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0353

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探讨ANGPTL8在胰岛素作用下对人肝细胞糖代谢影响及可能的作用机制。利用尾静脉水动力转染证实在小鼠肝脏过表达ANGPTL8可提高进食期糖耐受;在HepG2细胞中利用qPCR检测进食的主要调控因素胰岛素、葡萄糖等对ANGPTL8表达影响,发现单独的葡萄糖或胰岛素对ANGPTL8表达影响不明显,而葡萄糖和胰岛素组合可显著促进ANGPTL8表达;利用Western blotting分析在ANGPTL8敲除（ANGPTL8^-/-）和ANGPTL8稳定过表达（ANGPTL8⁺⁺）的HepG2细胞中胰岛素介导PI3K/AKT信号通路蛋白及其蛋白磷酸化表达差异,结果显示ANGPTL8可上调胰岛素介导的AKT信号通路中AKT、GSK-3β、FoxO1 蛋白磷酸化;PAS染色分析ANGPTL8可促进胰岛素介导的糖原合成。

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2017, 33(11): 300.

摘要 ( 114 )

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