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假单胞菌DLL-E4尿黑酸降解基因的克隆与功能的初步分析

沈文静;邓海华;曹慧;李晓丹;王世明;崔中利;李顺鹏;   

  1. 南京农业大学生命科学学院微生物学系农业部农业环境微生物工程重点开放实验室;
  • 出版日期:2008-06-26 发布日期:2008-06-26
  • 基金资助:
    国家高技术研究发展计划项目(“863”项目)(No.2007AA021304);; 国家自然科学基金(No.3077033);; 教育部新世纪优秀人才项目资助项目

  • Published:2008-06-26 Online:2008-06-26

摘要: 通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的突变株M18,该突变株不能以L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, Phe)为唯一碳源生长。SEFA-PCR扩增转座子侧翼序列发现其与已报道的尿黑酸1,2-双加氧酶基因hmgA的同源性为92%。将hmgA定向克隆至表达载体pET-29a中,转化至Escherichia coli BL21,经IPTG诱导后可表达分子量约为48kD的蛋白;诱导后转化子粗酶液对尿黑酸有很好的降解效果。将hmgA连入自杀性载体pEX19Gm,通过同源重组整合至M18染色体中,使其恢复了DLL-E4利用Phe的能力,证实了HmgA是尿黑酸苯环裂解酶。

关键词: 尿黑酸1, 2-双加氧酶, 转座子标签法, SEFA-PCR, 同源重组, 基因敲入