小鼠KGF基因毛囊特异性表达载体的构建及mESC脂质体悬浮转染条件的优化

小鼠KGF基因毛囊特异性表达载体的构建及mESC脂质体悬浮转染条件的优化

梁伟;肖红;高笑宇;杜晓媛;汪慧;郭旭东;刘东军;

内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室;

出版日期:2011-11-26 发布日期:2011-11-26
基金资助:
国家转基因新品种培育重大专项(2008ZX08008-002)

Published:2011-11-26 Online:2011-11-26

摘要/Abstract

摘要： 旨在构建小鼠角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体pCDsR-UKA,通过脂质体转染法转染小鼠胚胎干细胞(mESC),并进一步优化其转染条件,最终获得可以正常生长并稳定表达红色荧光蛋白的转KGF基因的ES细胞。利用RT-PCR技术扩增小鼠KGF基因cDNA并构建表达载体pCDsR-UKA(6.6 kb),经鉴定正确的重组质粒DNA用脂质体包裹后转染mESC。从小鼠成纤维细胞cDNA扩增出891 bp的KGF基因片段与UHS启动子和BGH polyA序列成功重组到pCDsRed2载体中。经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为KGF基因且方向正确。采用脂质体法优化转染条件,mESC最高转染效率达到(34.4±4.1)%。经G418筛选的转基因ES细胞通过PCR鉴定证实外源基因已整合在ES细胞基因组中。成功获得了小鼠KGF基因片段,以及真核表达载体pCDsR-UKA,经优化的脂质体悬浮法转染条件,在六孔板中当DNA与脂质体比例为3∶10时,可获得最佳转染效率且不改变ES细胞的生长状态,经筛选获得了转基因ES细胞克隆。为下一步通过四倍体补偿技术获得ES小鼠提供了转基因ES细胞。

关键词: KGF, 表达载体, 胚胎干细胞, 毛囊, UHS, 红色荧光蛋白, 脂质体转染, 悬浮法

梁伟;肖红;高笑宇;杜晓媛;汪慧;郭旭东;刘东军;. 小鼠KGF基因毛囊特异性表达载体的构建及mESC脂质体悬浮转染条件的优化[J]. .

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