离子对高效液相色谱法分析黄瓜花叶病毒侵染烟草的总RNA 水平变化

生物技术通报 ›› 2013, Vol. 0 ›› Issue (4): 90-95.

离子对高效液相色谱法分析黄瓜花叶病毒侵染烟草的总RNA 水平变化

乔文婕^1，2, 雷荣², 蒋弘山², 胡帆², 李志红¹, 朱水芳^1,2

1. 中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193 ；2. 中国检验检疫科学研究院，北京 100029

收稿日期:2012-10-24 修回日期:2013-04-22 出版日期:2013-04-22 发布日期:2013-04-22
作者简介:乔文婕，女，硕士研究生，研究方向：植物病毒检测和致病机理；E-mail ：qiaoqiao2222@126.com
基金资助:
国家“转基因生物抽样和精准检测技术”资助项目（2011ZX08012-001）

Analysis of Total RNA in CMV Infected Tobacco by Ion Pair Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography

Qiao Wenjie^1，2, Lei Rong², Jiang Hongshan², Hu Fan², Li Zhihong¹, Zhu Shuifang^1，2

1. College of Agriculture and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193 ； 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029

Received:2012-10-24 Revised:2013-04-22 Published:2013-04-22 Online:2013-04-22

摘要/Abstract

摘要： 为研究植物病毒在RNA水平上对寄主植物的基因表达产生的影响，采用离子对高效液相色谱法，对黄瓜花叶病毒侵染烟草造成的总RNA 的组成成分变化进行研究。离子对液相色谱法，是近几年才应用于对RNA 进行分离、纯化和分析的一种试验技术，具有操作简单、重复性好、所需时间短等优点。选择适宜的离子对试剂，并对选定的离子对试剂正己胺/1，1，1，3，3，3- 六氟-2-丙醇进行了优化，达到了较好的总RNA 分离效果，并观察到健康植株和染病植株分离峰之间的差异，有差异的RNA 种类还需进一步试验来验证。为研究植物病毒的致病机制提供一种新的试验方法和途径。

关键词: 离子对高效液相色谱法, 黄瓜花叶病毒, 总RNA, 基因表达差异

Abstract: To study the impact of plant virus on host plant at the RNA level gene expression, in this study differential expressing of total RNA induced by cucumber mosaic virus（CMV）infection in tobacco through ion pair reversed phase liquid chromatography（RP-HPLC） was analyzed. Ion pair RP-HPLC has been applied for RNA isolation, purification and analysis in recent years, and has the advantages of direct injection, good reproducibility, and rapid analysis. Suitable ion pair reagents as the hexylamine/1, 1, 1, 3, 3, 3-Hexafluoro-2-propanol（HA/ HFIP）system was optimized to achieve a acceptable total RNA separation, the separation peak differences between healthy and diseased plant were observed, but needed further experiments to verify. Therefore, this paper provided an alternative method for study the viral effects on gene expression of host plants at the RNA level and plant virus pathogenic mechanisms.

Key words: Ion pair RP-HPLC, Cucumber mosaic virus（CMV）, Total RNA, Differential gene expression

乔文婕, 雷荣, 蒋弘山, 胡帆, 李志红, 朱水芳. 离子对高效液相色谱法分析黄瓜花叶病毒侵染烟草的总RNA 水平变化[J]. 生物技术通报, 2013, 0(4): 90-95.

Qiao Wenjie, Lei Rong, Jiang Hongshan, Hu Fan, Li Zhihong, Zhu Shuifang. Analysis of Total RNA in CMV Infected Tobacco by Ion Pair Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography[J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 0(4): 90-95.

参考文献

［1］薛春生, 肖淑芹, 王国英, 等. 利用cDNA-AFLP 技术分析玉米自交系黄早四甘蔗花叶病毒侵染后基因差异表达[J]. 植物病理学报, 2005, 35（3）：229-234.
［2］周以飞, 戴艳, 潘大仁, 等. 花叶病毒侵染的果蔗（Badila）的基因表达[J]. 福建农林大学学报：自然科学版, 2006, 35（3）: 288-291.
［3］ Ding SW. RNA-based antiviral immunity [J]. Nature Review Immunology, 2010, 10（9）：632-644.
［4］张新华, 李富军. 病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展[J]. 西北植物学报, 2012, 32（2）：419-424.
［5］黄冰艳, 吉万全, 郭蔼光, 等. 转录后基因沉默（PTGS）及其在作物遗传改良中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2005, 25 （5）：1-5.
［6］ Mlotshwa S, Voinnet O, Mette MF, et al. RNA silencing and the mobile silencing signal [J]. Plant Cell, 2002, 14（Suppl. 1）: S289-S301.
［7］ Meister G, Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by doublestranded RNA [J]. Nature, 2004, 431（7006）：343-349.
［8］ Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction [J]. Science, 1992, 257（5072）：967-971.
［9］ Ivanova NB, Belyavsky AV. Identification of differentialy expressed genes by restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting [J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23（15）：2954-2958.
［10］ Oefner PJ, Huber CG. A decade of high-resolution liquid chromatography of nucleic acids on styrene-divinylbenzene copolymers [J].
Journal of Chromatography B, 2002, 782（1）：27-55.
［11］ Azarani A, Hecker KH. RNA analysis by ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography [J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29（2）：e7.
［12］ Dickman MJ, Hornby DP. Enrichment and analysis of RNA centered on ion pair reverse phase methodology [J]. RNA-a Publication of the RNA Society, 2006, 12（4）：691-696.
［13］ Dickman MJ. Ion pair reverse-phase chromatography ：A versatile platform for the analysis of RNA [J]. Chromatography Today, 2011 ：22-26.
［14］ Noll B, Seiffert S, Vornlocher HP, et al. Characterization of small interfering RNA by non-denaturing ion-pair reversed-phase liquid chromatography [J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218 （33）：5609-5617.
［15］ Seiffert S, Debelak H, Hadwiger P, et al. Characterization of side reactions during the annealing of small interfering RNAs [J].
Analytical Biochemistry, 2011, 414（1）：47-57.
［16］ Waghmare SP, Pousinis P, Hornby DP, et al. Studying the mechanism of RNA separations using RNA chromatography and its application in the analysis of ribosomal RNA and RNA ：RNA interactions [J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216（9）: 1377-1382.
［17］ Roossinck MJ, Zhang L, Hellwald KH. Rearrangements in the 5'nontranslated region and phylogenetic analyses of cucumber mosaic virus RNA 3 indicate radial evolution of three subgroups [J].
Journal of Virology, 1999, 73（8）：6752-6758.
［18］ McCarthy SM, Gilar M, Gebler J. Reversed-phase ion-pair liquid chromatography analysis and purification of small interfering RNA [J]. Analytical Biochemistry, 2009, 390（2）：181-188.
［19］ Transgenomic Optimized Purification of siRNA Oligonucleotides Using the WAVE? Oligo System. DOI ：http ：//www.transgenomic.
com/lib/an/612021.pdf.
［20］ Gilar M, Fountain KJ, Budman Y, et al. Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides: Retention prediction [J]. Journal of Chromatography A, 2002, 958（1-2）：167-182.
［21］ Apffel A, Chakel JA, Fischer S, et al. Analysis of oligonucleotides by HPLC-electrospray ionization mass spectrometry [J]. Analytical Chemistry, 1997, 69（7）：1320-1325.
［22］ Apffel A, Chakel JA, Fischer S, et al. New procedure for the use of high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for the analysis of nucleotides and oligonucleotides [J]. Journal of Chromatography A, 1997, 777（1）：3-21.
［23］ Brakke MK, White JL, Samson RG, et al. Chlorophyll, chloroplast ribosomal RNA, and DNA are reduced by barley stripe mosaic virus systemic infection [J]. Phytopathology, 1988, 78（5）：570-574.

[1]	单婷婷 ,陈晓梅 ,郭顺星 ,王倩清 ,王爱荣. 石斛属植物茎部总RNA提取方法的研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(6): 54-58.
[2]	杜文凯, 袁素霞, 胡凤荣. 一种快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的方法[J]. 生物技术通报, 2018, 34(10): 81-86.
[3]	邱艳红,王超楠,朱水芳. 黄瓜花叶病毒致病性研究进展[J]. 生物技术通报, 2017, 33(9): 10-16.
[4]	周东, 刘贞, 刘丽, 许鹏程, 郑银英. 新疆辣椒CMV基因组序列分析与^CP基因多克隆抗体制备[J]. 生物技术通报, 2017, 33(8): 88-94.
[5]	陈小凤, 曾奇峰, 邓旭, 曾光尧, 周应军. 一种大量提取红豆杉中总RNA的方法研究[J]. 生物技术通报, 2017, 33(11): 60-66.
[6]	吴春太, 黎瑜, 冯伟瑜, 曾日中. 不同沉淀方法处理胶乳总RNA对基因扩增效率的影响[J]. 生物技术通报, 2016, 32(11): 124-129.
[7]	陈静,高飞,周宜君,张孜宸,李章磊,曹玉震,张至玮. 改良Trizol法提取高质量蒙古沙冬青总RNA[J]. 生物技术通报, 2013, 0(10): 87-92.
[8]	代小梅;程晓霞;曾会明;韩烈保;. 日本结缕草总RNA提取和mRNA分离方法的优化[J]. , 2010, 0(12): 132-136.
[9]	陈玲娜;杜智欣;邱艳红;鲁洁;高必达;朱水芳;. 在系统侵染的烟草中假重组体病毒FMF的时序变化[J]. , 2010, 0(10): 126-130.
[10]	刘金亮;王凤婷;侯春喜;魏毅;张世宏;潘洪玉;. 侵染辣椒的黄瓜花叶病毒CP基因的序列分析、原核表达及抗血清制备[J]. , 2010, 0(08): 110-115.
[11]	高雪;. 一种适合从柑橘果皮提取总RNA的方法[J]. , 2010, 0(07): 134-136.
[12]	李聪;曾会明;韩烈保;. 草坪草总RNA几种提取方法的比较[J]. , 2008, 0(S1): 219-223.
[13]	汪桂玲;李家乐;. 淡水育珠蚌外套膜提取总RNA的改良方法[J]. , 2008, 0(S1): 356-357.
[14]	李晶晶;邓召花;曾静;张金方;张飞云;. 侵染万寿菊的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析[J]. , 2007, 0(06): 92-96.
[15]	曾静;张飞云;李晶晶;于银霞;王法军;. 四种广普性植物病毒高效mPCR检测方法的建立[J]. , 2007, 0(06): 108-112.