黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.025

生物技术通报 ›› 2015, Vol. 31 ›› Issue (3): 171-177.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.025

黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化

张晓立^1，3, 郑小梅^2，3, 满云⁴, 罗虎⁴, 于建东^2，3, 郑平^2，3, 刘浩¹, 孙际宾^2，3

(1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308；3.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；4.中粮生物化学(安徽)股份有限公司，蚌埠 233010)

收稿日期:2014-09-23 出版日期:2015-03-16 发布日期:2015-03-16
作者简介:张晓立，女，硕士研究生，研究方向：轻工技术与工程；E-mail：xiaolizhang0607@sina.com；郑小梅为本文并列第一作者，E-mail：zheng_xm@tib.cas.cn
基金资助:
国家“863”计划(2013AA020302)，国家自然科学基金面上项目(31370113)

Preparation of Protoplast for Efficient DNA Transformation of Citric Acid Hyper-producing Aspergillus niger Industrial Strain

Zhang Xiaoli^1，3 Zheng Xiaomei^2，3 Man Yun⁴ Luo Hu⁴ Yu Jiandong^2，3 Zheng Ping^2，3 Liu Hao¹ Sun Jibin^2，3

(1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308)；4. COFCO Biochemical(Anhui)Co.，Ltd.，Bengbu 233010)

Received:2014-09-23 Published:2015-03-16 Online:2015-03-16

摘要/Abstract

摘要： 黑曲霉是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株。尽管现代遗传操作技术在黑曲霉的实验室菌株、蛋白质生产菌株等的应用中获得了成功，但是柠檬酸工业菌株遗传转化异常困难，成为柠檬酸工业持续升级的重要限制因素。以柠檬酸工业生产实际应用的黑曲霉菌株为研究对象，对其原生质体的制备与再生以及PEG介导的转化等条件进行了细致优化。结果表明，柠檬酸高产工业菌株原生质体的制备需选取丰富培养基中培养48 h的年轻菌丝体，在1.5%裂解酶-0.5%蜗牛酶-0.2%溶菌酶的复合酶解体系下裂解2.5 h，原生质体的制备浓度可达10⁶个/mL以上，原生质体再生效率可达90%以上。原生质体的浓度是原生质体-PEG介导转化方法的关键，当原生质体浓度达到10⁶个/mL以上时，高产柠檬酸菌株的转化效率大幅提高。成功建立了由原生质体-PEG所介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系。

关键词: 黑曲霉, 柠檬酸, 遗传操作系统, 原生质体, DNA转化

Abstract: Aspergillus niger is the major industrial strain for citric acid production. In spite of many successes of modern molecular biology approaches in engineering laboratory or protein-producing strains of A. niger, there is few positive report on its application for citric acid industrial strains mainly due to the hard-to-transform nature of these strains. In this study, the protoplast-PEG mediated genetic transformation system for citric acid industrial strain was extensively studied, suggesting an optimized protocol for protoplast preparation, regeneration and DNA transformation. The concentration of protoplasts reached up to 10⁶ /mL by lysing younger mycelia for 2.5 h after 48 h incubation of a proper amount of conidia spores in enrichment medium. The optimal lysing enzyme mixtures comprised of 1.5% lysing enzyme, 0.5% snail enzyme and 0.2% lysozyme. Concentration of protoplast influenced the protoplast-PEG mediated transformation efficiency, which reached the maximal when the concentration of protoplast was higher than 10⁶/mL. The genetic transformation system established in this study should pave the way to molecular biology study of the citric acid hyper-producing strains, for further understanding its acid-tolerant physiology and for rational design of the industrial strain for further improvement of the citric acid production process as well as creation of new organic acid-producing cell factories.

Key words: Aspergillus niger, citric acid, genetic manipulation system, protoplast, DNA transformation

张晓立, 郑小梅, 满云, 罗虎, 于建东, 郑平, 刘浩, 孙际宾. 黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化[J]. 生物技术通报, 2015, 31(3): 171-177.

Zhang Xiaoli, Zheng Xiaomei, Man Yun, Luo Hu, Yu Jiandong, Zheng Ping, Liu Hao, Sun Jibin. Preparation of Protoplast for Efficient DNA Transformation of Citric Acid Hyper-producing Aspergillus niger Industrial Strain[J]. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(3): 171-177.

参考文献

[1] 高年发, 张健, 高强, 等. 黑曲霉柠檬酸发酵机制研究的新进展[C]. 发酵有机酸科技交流, 2009：6-19.
[2] 王玉堂, 刘绯. 我国斑点叉尾鮰产业发展现状及对策[J]. 中国水产, 2007, 12：14-16.
[3] 周进. 斑点叉尾鮰肌肉营养的分析[J]. 河北渔业, 2003, 1：17-19.
[4] 郭艳梅, 郑平, 孙际宾. 黑曲霉作为细胞工厂：知识准备与技术基础[J]. 生物工程学报, 2010, 10；26(10)：1410-1418.
[5] Weenink XO, Punt PJ, van den Hondel CA, Ram AFJ. A new method for screening and isolation of hypersecretion mutants in Aspergillus niger[J]. Appl Environ Microbiol, 2006, 69(6)：711-717.
[6] Fleissner A, Dersch P. Expression and export：recombinant protein production systems for Aspergillus[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(4)：1255-1270.
[7] Cherry JR, Fidantsef AL. Directed evolution of industrial enzymes：an update[J]. Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(4)：438-443.
[8] Ozeki K, Kyoya F, Hizume K, et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1994, 58(12)：2224-2227.
[9] Meyer V. Genetic engineering of filamentous fungi -Progress, obstacles and future trends[J]. Biotechnology Advances, 2008, 26：177-185.
[10] Meyer V, Mueller D, Till S, et al. Comparison of different transform-ation methods for Aspergillus giganteus[J]. Curr Genet, 2003, 43(5)：371-377.
[11] Michielse CB, Hooykaas PJ, van den Hondel CA, Ram AF. Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi[J]. Curr Genet, 2005, 48：1-17.
[12] 姚婷婷, 王正祥. 黑曲霉原生质体的制备、再生及转化条件[J]. 食品与生物技术学报, 2006, 4(25)：116-120.
[13] Ahuja M, Punekar NS. Phosphinothricin resistance in Aspergillus niger and its utility as a selectable transformation marker[J]. Fungal Genetics and Biology, 2008, 45：1103-1110.
[14] Carvalho ND, Arentshorst M, Jin Kwon M. et al. Expanding the ku70 toolbox for filamentous fungi：establishment of complementation vectors and recipient strains for advanced gene analyses[J]. Microbiol Biotechnol, 2010, 87：1463-1473.
[15] Liu L, Liu J, Qiu RX, et al. Improving heterologous gene expression in Aspergillus niger by introducing multiple copies of protein-binding sequence containing CCAAT to the promoter[J]. Microbiology, 2003, 36, 358-361.
[16] 孙晶, 李景鹏, 王敖全, 等. 黑曲霉pepB 基因缺失菌株的构建及其功能分析[J]. 微生物学报, 2004, 6(44)：766-770.
[17] 朱萍, 梁海秋, 张弘, 等. 黑曲霉Ni-5k 原生质体的制备和再生[J]. 广西农业生物科学, 2005, 4(24), 339-342.
[18] 王赓, 杜连祥. 新月弯孢霉原生质体制备及再生条件的研究[J]. 微生物学通报, 1999, 26(1)：21- 23.
[19] Hamlyn PF, Bradshaw RE, Mellon FM, et al. Efficient protoplast isolation from fungi using commercial enzymes[J]. Enzyme Microbial Tech, 1981, 3：321- 325.
[20] 苏彩云, 靳发彬, 张佳, 等. 丝状真菌的DNA转化方法[J]. 河北化工, 2007, 7(30)：29-31.
[21] 周礼红, 王正祥, 诸葛健. 红曲霉不同转化方法的比较[J]. 遗传技术与方法, 2006, 28(4)：479-485.

黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化

Preparation of Protoplast for Efficient DNA Transformation of Citric Acid Hyper-producing Aspergillus niger Industrial Strain

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	陈中元, 王玉红, 代为俊, 张艳敏, 叶倩, 刘旭平, 谭文松, 赵亮. 柠檬酸铁铵对悬浮HEK293细胞转染的影响机制探究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 311-318.
[2]	潘国强, 吴思源, 刘璐, 郭惠明, 程红梅, 苏晓峰. 大丽轮枝菌（Verticillim dahliae）突变体库的构建与分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(5): 112-119.
[3]	唐光甫, 桂艳玲, 满海乔, 赵杰宏. 利用CRISPR/Cas 9编辑红曲霉pyrG基因对其次生代谢的影响[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 198-205.
[4]	石佳, 朱秀梅, 薛梦雨, 余超, 魏一鸣, 杨凤环, 陈华民. 基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术优化及应用[J]. 生物技术通报, 2022, 38(7): 62-69.
[5]	薛鲜丽, 王静然, 毕杭杭, 王德培. 过表达Spt7对黑曲霉生长及抗逆性影响[J]. 生物技术通报, 2022, 38(5): 112-122.
[6]	郭宇飞, 闫荣媚, 张小茹, 曹威, 刘浩. 代谢工程改造黑曲霉生产葡萄糖二酸[J]. 生物技术通报, 2022, 38(11): 227-237.
[7]	曹海鹏, 张书萌, 刁菁, 许拉, 盖春蕾. 一株增强中华绒螯蟹抗病力的固氮红细菌SY5的分离鉴定与表征[J]. 生物技术通报, 2022, 38(11): 277-285.
[8]	李红叶, 陈立佼, 刘明丽, 郭天杰, 王道平, 潘映红, 赵明. 黑曲霉单宁酶基因Tan2克隆与表达[J]. 生物技术通报, 2021, 37(3): 44-52.
[9]	孟晓建, 于建东, 郑小梅, 郑平, 李志敏, 孙际宾, 叶勤. 小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的酶活调控[J]. 生物技术通报, 2021, 37(12): 180-190.
[10]	梁玲, 黄钦耿, 翁雪清, 吴松刚, 黄建忠. 产L-谷氨酸工程菌株的诱变选育及其发酵效率[J]. 生物技术通报, 2020, 36(6): 143-149.
[11]	潘旭耀, 魏韬, 谭柱豪, 林龙镇, 郭丽琼, 林俊芳. 芽孢杆菌种间原生质体融合选育高产Surfactin新菌株[J]. 生物技术通报, 2019, 35(8): 238-245.
[12]	赵小强, 陈志荣, 何芳, 沈楠, 高峰, 黄家风. 大丽轮枝菌原生质体的制备及再生[J]. 生物技术通报, 2018, 34(7): 166-173.
[13]	孙晓瑞, 陈博文, 张小林, 孟俊龙. 秀珍菇单孢子菌株原生质体制备条件的优化[J]. 生物技术通报, 2018, 34(4): 70-76.
[14]	王伟伟, 肖燕, 张艺夕, 刘晶, 唐唯, 李灿辉. 马铃薯晚疫病菌原生质体制备及再生体系的研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(4): 77-82.
[15]	陈浩宇, 徐瑞涛, 程志翔, 高强, 张健. H₂O₂对黑曲霉氧化胁迫机理的研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(4): 201-207.