华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.024

生物技术通报 ›› 2015, Vol. 31 ›› Issue (3): 165-170.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.024

华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究

张谦¹, 王剑英², 林智², 贾佳², 郭宏涛^2,

(1.深圳技师学院，深圳 518116；2.深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055)

收稿日期:2014-08-27 出版日期:2015-03-16 发布日期:2015-03-16
作者简介:张谦，男，高级工程师，硕士，研究方向：工业微生物及发酵工程；E-mail：qianz50@hotmail.com
基金资助:
深圳市科技创新委员会技术创新计划项目(CXZZ20130425111508558)

Recombinant Expression of Rhizopus chinensis Lipase in Aspergillus niger

Zhang Qian¹ Wang Jianying² Lin Zhi² Jia Jia² Guo Hongtao²

(1.Shenzhen Institute Technology，Shenzhen 518116；2 .Shenzhen Leveking Bio-engineening Co.，Ltd，Shenzhen 518055)

Received:2014-08-27 Published:2015-03-16 Online:2015-03-16

摘要/Abstract

摘要： 将华根霉脂肪酶基因RCL在黑曲霉中进行了重组表达。通过PCR技术分别获得黑曲霉Pgpd启动子和RCL-TtrpC融合片段并克隆至质粒pCHAMBIA230，构建出RCL超表达载体pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC。将该载体通过冻融法转化农杆菌EHA105，进而通过农杆菌介导转化法转化黑曲霉，随机挑选7株转化子，进行PCR和Southern杂交鉴定，均为阳性。对这7株转化子进行发酵和脂肪酶活力测定，结果显示，所有转化子均能表达RCL，其中T6转化子的脂肪酶活力最高，达到71 U/mL。SDS-PAGE分析表明，重组表达的RCL的分子量约为37 kD。

关键词: 重组表达, 华根霉, 脂肪酶, 黑曲霉, 根癌农杆菌

Abstract: This article carried out the recombinant expression of Rhizopus chinensis lipase(RCL)gene in Aspergillus niger. Promoter of Pgpd from A. niger and RCL-TtrpC fusing fragment were respectively obtained by PCR and further cloned to plasmid pCHAMBIA2302 to generate the RCL over-expression vector pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC. The resulting vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105, and then transformed into A. niger through the mediation of A. tumefaciens. Seven randomly selected transformants were analyzed by PCR and Southern blot. As a result, all the transformants were found to be positive. Then, the seven transformants were subjected to fermentation and lipase assay, and the results showed that all the transformants secreted recombinant RCL, among which transformant T6 produced the highest lipase specific activity, reaching up to approximately 71 U/mL. The fermentation broth was further analyzed by SDS-PAGE, which revealed the molecular weight of the recombinant RCL was 37 kD.

Key words: recombinant expression, Rhizopus chinensis, lipase, Aspergillus niger, Agrobacterium tumefaciens

张谦, 王剑英, 林智, 贾佳, 郭宏涛. 华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究[J]. 生物技术通报, 2015, 31(3): 165-170.

Zhang Qian, Wang Jianying, Lin Zhi, Jia Jia, Guo Hongtao. Recombinant Expression of Rhizopus chinensis Lipase in Aspergillus niger[J]. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(3): 165-170.

参考文献

[1] Yu XW, Wang LL, Xu Y. Rhizopus chinensis lipase：gene cloning, expression in Pichia pastoris and properties[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic, 2009, 57(1-4)：304-311.
[2] 张峦, 黄立群, 喻晓蔚, 等. 重组华根霉脂肪酶的酶学性质及其对面团热机械学和烘焙特性的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(13)：158-163.
[3] 李珍妮, 王宏兹, 黄卫宁, 等. 重组华根霉脂肪酶协同转谷氨酰胺酶提高冷冻面团抗冻发酵特性的研究[J]. 食品科学, 2011, 32(13)：109-113.
[4] Sha C, Yu XW, Lin NX, et al. Enhancement of lipase r27RCL production in Pichia pastoris by regulating gene dosage and co-expression with chaperone protein disulfide isomerase[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2013, 53(6-7)：438-443.
[5] 李洪钊, 李亮助, 孙强明, 等. 巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略[J]. 微生物学报, 2003, 43(2)：288-292.
[6] 郭艳梅, 郑平, 孙际宾. 黑曲霉作为细胞工厂：知识准备于技术基础[J]. 生物工程学报, 2010, 26(10)：1410-1418.
[7] Schuster E, Dunn-Coleman N, Frisvad JC, et al. On the safety of Aspergillus niger-a review[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 59(4-5)：426-435.
[8] Mekmouche Y, Zhou S, Cusano AM, et al. Gram-scale production of a Basidiomycetous laccase in Aspergillus niger[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 117(1)：25-27.
[9] Fleissner A, Dersch P. Expression and export：recombinant protein production systems for Aspergillus[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87(4)：1255-1270.
[10] Prathumpai W, Flitter SJ, McIntyre M, et al. Lipase production by recombinant strains of Aspergillus niger expressing a lipase-encoding gene from Thermomyces lanuginosus[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 65(6)：714-719.
[11] de Groot MJ, Bundock P, Hooykaas PJ, et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi[J]. Nature Biotechnology, 1998, 16(9)：839-842.
[12] Zhang T, Qi Z, Wang Y, et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Penicillium expansum PE-12 and its application in molecular breeding[J]. Research in Microbiology, 2013, 168(3)：130-137.
[13] Piechaczyk M, Blanchard JM, Marty L, et al. Post-transcriptional regulation of glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase gene expression in rat tissues[J]. Nucleic Acids Research, 1984, 12(18)：6951-6963.
[14] Li B, Rotsaert FAJ, Gold MH, et al. Homologous expression of recombinant cellobiose dehydrogenase in Phanerochaete chrysosporium[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 270(1)：141-146.
[15] Kajita S, Sugawara S, Miyazaki Y, et al. Overproduction of recombi-nant laccase using a homologous expression system in Coriolus versicolor[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 66(2)：194-199.
[16] Michielse CB, Hooykaas PJ, van den Hondel CA, et al. Agrobacter-ium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi[J]. Current Genetics, 2005, 48(1)：1-17.
[17] Meyer V. Genetic engineering of filamentous fungi-Progress, obstacle and future trends[J]. Biotechnology Advances, 2008, 26(2)：177-185.
[18] 黎明, 刘萌, 黄云雁, 等. 根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化体系的建立及优化[J]. 中国生物工程杂志, 2012, 32(1)：56-63.
[19] Verdoes JC, Punt PJ, van den Hondel CAMJJ. Molecular genetic strain improvement for the overproduction of fungal proteins by flamentous fungi[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1995, 43(2)：195-205.
[20] 张黎, 赵鹤云, 徐莉, 等. 解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达[J]. 微生物学报, 2010, 50(7)：969-974.
[21] 杨江科, 严翔翔, 张正平, 等. 二步法黑曲霉脂肪酶基因lipA的全基因合成及其在毕赤酵母中的高效表达[J]. 生物工程学报, 2009, 25(3)：381-387.
[22] Dai DZ, Xia LM. Enhanced production of Penicillium expansum PED-03 lipase through control of culture conditions and application of the crude enzyme in kinetic resolution of racemic allethrolone[J]. Biotechnology Progress, 2005, 21(4)：1165-1168.
[23] 张田, 唐克轩. 丝状真菌的遗传工程研究进展[J]. 上海交通大学学报：农业科学版, 2010, 28(5)：480-486.

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Recombinant Expression of Rhizopus chinensis Lipase in Aspergillus niger

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[1]	陈金行, 张逸, 张军涛, 未本美, 王宏勋, 郑明明. 固定化脂肪酶的创制及其在乙酸肉桂酯无溶剂制备中的应用[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 97-104.
[2]	薛鲜丽, 王静然, 毕杭杭, 王德培. 过表达Spt7对黑曲霉生长及抗逆性影响[J]. 生物技术通报, 2022, 38(5): 112-122.
[3]	常晴, 束月蓉, 王文韬, 蒋昊, 延泉德, 钱政, 高雪纯, 吴金鸿, 张勇. 来自Yeosuana marina sp. JLT21内切型海藻酸裂解酶的异源表达及酶学表征[J]. 生物技术通报, 2022, 38(2): 123-131.
[4]	周承哲, 常笑君, 朱晨, 程春振, 陈裕坤, 赖钟雄, 林玉玲, 郭玉琼. 茶树原位转化方法的建立[J]. 生物技术通报, 2022, 38(2): 263-268.
[5]	郭宇飞, 闫荣媚, 张小茹, 曹威, 刘浩. 代谢工程改造黑曲霉生产葡萄糖二酸[J]. 生物技术通报, 2022, 38(11): 227-237.
[6]	张泽颖, 范清锋, 邓云峰, 韦廷舟, 周正富, 周建, 王劲, 江世杰. 一株高产脂肪酶菌株WCO-9全基因组测序及比较基因组分析[J]. 生物技术通报, 2022, 38(10): 216-225.
[7]	曹汝菲, 李泽轩, 许欢, 张莎, 张敏敏, 戴枫, 段晓雷. 脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长[J]. 生物技术通报, 2021, 37(9): 180-190.
[8]	段绪果, 张玉华, 黄婷婷, 丁乾, 栾舒越, 朱秋雨. 化学分子伴侣及诱导条件协同强化Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表达[J]. 生物技术通报, 2021, 37(8): 233-242.
[9]	李红叶, 陈立佼, 刘明丽, 郭天杰, 王道平, 潘映红, 赵明. 黑曲霉单宁酶基因Tan2克隆与表达[J]. 生物技术通报, 2021, 37(3): 44-52.
[10]	吴蓉, 曹佳睿, 曹君, 刘飞翔, 杨猛, 苏二正. 南极假丝酵母脂肪酶B基因在大肠杆菌中的表达和发酵优化[J]. 生物技术通报, 2021, 37(2): 138-148.
[11]	孟晓建, 于建东, 郑小梅, 郑平, 李志敏, 孙际宾, 叶勤. 小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的酶活调控[J]. 生物技术通报, 2021, 37(12): 180-190.
[12]	徐楠, 徐宇娟, 孙盼, 宗仁杰, 郭敏亮. 根癌农杆菌vbp2基因启动子转录调控的探析[J]. 生物技术通报, 2021, 37(12): 41-49.
[13]	赵震, 王莎莎, 吕星星, 陶妍, 谢晶, 钱韻芳. 重组毕赤酵母产青蛤Mytimacin抗菌肽的表达研究[J]. 生物技术通报, 2020, 36(5): 150-158.
[14]	黄阳天, 陆育彪, 黄益帖, 孟繁龙, 徐凯文, 李鹏. 产电海洋脂肪酶生产菌的分离筛选鉴定及培养条件研究[J]. 生物技术通报, 2020, 36(12): 91-97.
[15]	朱彩林, 吕祥, 夏小乐. 盖子区域氨基酸的定点突变对T1脂肪酶酶学性质的影响[J]. 生物技术通报, 2020, 36(11): 94-102.