基于荧光检测技术的青稞品种鉴定方法的建立

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1494

摘要/Abstract

摘要：

本研究通过筛选出一套SSR 核心引物,建立青稞DNA指纹鉴定体系,为青稞品种选育、品种鉴定提供高通量检测技术方法。首先以形态差异大的 24 份种质为材料,对198 对 SSR 引物进行初筛,筛选出 42对多态性好、扩增稳定、条带清晰的 SSR 引物,并对之进行荧光标记。采用筛选出的42对引物对226份材料进行 PCR 扩增,扩增产物经毛细管电泳检测,最终筛选出28对SSR 荧光引物建立基于高通量荧光 SSR 标记的青稞品种鉴定体系。采用 28对 SSR 引物构建的 DNA 指纹图谱进行226个青稞材料的鉴定。28对SSR引物共检测到252 个等位基因,每对引物可检测到有效等位基因数为5-16个,平均等位基因数为9;基因多样性指数变异范围为0.48-0.86,平均为0.68;多态信息量（PIC）变幅为0.44-0.84,平均为 0.65。226份材料的遗传距离为0-0.99,该套引物可以将大部分参试材料区分开。从 28 对SSR 引物中选择了 7对分布于不同染色体上、扩增和检测效果较好的引物（Bmag0211、Scssr07759、HVM62、EBmac0679、Scssr03907、Bmag0870、EBmac0827）,构建青稞品种（系）DNA的指纹图谱库。为消除不同检测平台、不同试验批次等引起的误差,为7对SSR 核心引物各主要等位变异选择相应的参照品种,作为普通聚丙烯酰胺凝胶电泳的读带依据。最终构建了在2个检测平台（毛细管电泳平台及聚丙烯酰胺凝胶电泳平台）通用的SSR分子标记青稞品种鉴定体系。

关键词: 青稞, SSR标记, 核心引物, 指纹图谱, 品种鉴定

Abstract:

A series of SSR core primers were screened to provide a DNA fingerprinting of hulless barley varieties,which may provide high-throughput detection method for the breeding and variety identification of hulless barley. First of all,24 hulless barley germplasms with large morphological differences were used,42 primers were screened from the original 198 SSR primers,which had clear amplification bands,rich polymorphism and stable amplification. These screened primers were labeled with fluorescent,and used for the PCR amplification of the total 226 cultivars. The amplified products were detected by capillary electrophoresis. Finally,28 pairs of SSR fluorescent primers were screened to establish an identification system for hulless barley variety based on the high-throughput fluorescent SSR marker. And the selected 28 primers were used to construct DNA fingerprinting for identifying the 226 cultivars of hulless barley. A total of 252 alleles were detected by 28 pairs of SSR primers,the effective number of alleles ranged from 5 to 16,and the average number of alleles was 9. The genetic diversity ranged from 0.48 to 0.86 and the average value was 0.68. The polymorphism information content（PIC）changed from 0.44 to 0.84 and the average value of PIC was 0.65. The genetic distance of 226 materials was 0-0.99. This set of primers distinguished the most of the test materials. Seven SSR primers（Bmag0211,Scssr07759,HVM62,EBmac0679,Scssr03907,Bmag0870,and EBmac0827）with good amplification and detection effect as well as distributed in different chromosomes were chosen from the 28 SSR primers,and they were used for constructing DNA fingerprinting spectrum. The corresponding reference cultivars to major allelic variations of 7 pairs of primers were selected to eliminate the errors caused by different platforms and experimental batches. These reference cultivars can be used as the basis for reading bands of ordinary polyacrylamide gel electrophoresis. In this study,a SSR high-throughput identification system was constructed in two detection platforms（fluorescent capillary electrophoresis platform and polyacrylamide gel electrophoresis platform）based on 28 pairs of primers.

Key words: hulless barley, SSR marker, core primers, fingerprinting, variety identification

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图/表 7

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序号 No.	材料名称 Material name	来源 Origin	棱型 Type
1	长芒六棱露仁	江苏省农业科学院	多棱
2	藏83062	江苏省农业科学院	多棱
3	昆仑1号	青海省农林科学院	多棱
4	昆仑14号	青海省农林科学院	多棱
5	北青1号	青海省农林科学院	多棱
6	中甸紫青稞	云南地方品种	多棱
7	镇康软壳青稞	云南地方品种	多棱
8	禄劝裸黑大麦	云南地方品种	二棱
9	康青3号	四川省甘孜农科所	多棱
10	米大麦	云南地方品种	多棱
11	勾芒米大麦	云南地方品种	多棱
12	北青88	西北农林科技大学	多棱
13	阿青5号	青海省农林科学院	多棱
14	迪青3号	迪庆州农业科学院	多棱
15	黄长钩裸大麦	云南地方品种	多棱
16	紫光芒裸大麦	云南地方品种	二棱
17	开宝麦	云南地方品种	多棱
18	光芒鲜大麦	云南地方品种	二棱
19	早熟白青稞	云南地方品种	多棱
20	洋大麦	云南地方品种	多棱
21	早熟大麦	云南地方品种	多棱
22	云青3号	云南省农业科学院	多棱
23	Atahualpa	国际干旱农业研究中心	二棱
24	MADRE SELVA	国际干旱农业研究中心	二棱

序号 No.	材料名称 Material name	来源 Origin	棱型 Type
1	长芒六棱露仁	江苏省农业科学院	多棱
2	藏83062	江苏省农业科学院	多棱
3	昆仑1号	青海省农林科学院	多棱
4	昆仑14号	青海省农林科学院	多棱
5	北青1号	青海省农林科学院	多棱
6	中甸紫青稞	云南地方品种	多棱
7	镇康软壳青稞	云南地方品种	多棱
8	禄劝裸黑大麦	云南地方品种	二棱
9	康青3号	四川省甘孜农科所	多棱
10	米大麦	云南地方品种	多棱
11	勾芒米大麦	云南地方品种	多棱
12	北青88	西北农林科技大学	多棱
13	阿青5号	青海省农林科学院	多棱
14	迪青3号	迪庆州农业科学院	多棱
15	黄长钩裸大麦	云南地方品种	多棱
16	紫光芒裸大麦	云南地方品种	二棱
17	开宝麦	云南地方品种	多棱
18	光芒鲜大麦	云南地方品种	二棱
19	早熟白青稞	云南地方品种	多棱
20	洋大麦	云南地方品种	多棱
21	早熟大麦	云南地方品种	多棱
22	云青3号	云南省农业科学院	多棱
23	Atahualpa	国际干旱农业研究中心	二棱
24	MADRE SELVA	国际干旱农业研究中心	二棱

序号 No.	位点 Locus	引物序列 Primer sequence（5'-3'）	退火温度 Annealing temperature/℃	序号 No.	位点 Locus	引物序列 Primer sequences（5'-3'）	退火温度 Annealing temperature/℃
1	Bmag0211	F:ATTCATCGATCTTGTATTAGTCC R:ACATCATGTCGATCAAAGC	58	15	EBmac0701	F:ATGATGAGAACTCTTCACCC R:TGGCACTAAAGCAAAAGAC	55
2	Bmag0345	F:ATGAGGAATAACTCAACCAAA R:AATATATTTTCGATGTCGAGC	58	16	Bmac0310	F:CTACCTCTGAGATATCATGCC R:ATCTAGTGTGTGTTGCTTCCT	55
3	Bmag0579	F:CCTAGATAAGGAACATAGCCA R:CAAAGACCCTAACTCATGTTC	55	17	Bmag387	F:CGATGACCATTGTATTGAAG R:CTCATGTTGATGTGTGGTTAG	58
4	EBmac0501	F:ACTTAAGTGCCATGCAAAG R:AGGGACAAAAATGGCTAAG	58	18	Bmac0096	F:GCTATGGCGTACTATGTATGGTTG R:TCACGATGAGGTATGATCAAAGA	58
5	Scssr07759	F:GCAACTCCTCATCATCTCAGG R:CAACAGCCAGAAGGTCTACG	62	19	Scssr03907	F:CTCCCATCACACCATCTGTC R:GACATGGTTCCCTTCTTCTTC	60
6	Bmag0378	F:CTTTTGTTTCCGTAGCATCTA R:ATCCAACTATAGTAGCAAAGCC	58	20	Scssr10148	F:AAGCAGCAAAGCAAAGTACC R:TCATCAGCATCTGATCATCC	60
7	Bmag0711	F:GGAGAGTCACATATCAAGGAC R:CCACTCCTTCTCATACCTTTA	55	21	Bmac0018	F:GTCCTTTACGCATGAACCGT R:ACATACGCCAGACTCGTGTG	60
8	Bmag125	F:AATTAGCGAGAACAAAATCAC R:AGATAACGATGCACCACC	55	22	Bmag0009	F:AAGTGAAGCAAGCAAACAAACA R:ATCCTTCCATATTTTGATTAGGCA	58
9	Bmag0013	F:AAGGGGAATCAAAATGGGAG R:TCGAATAGGTCTCCGAAGAAA	58	23	Bmag0867	F:CCCCACACTGACCTACAG R:TTACATCTGCTAGATCGAAGC	55
10	EBmac705	F:GTGGAAAACTGAGTGAAACTC R:TTGAGGAGAAGTAATGACGAT	55	24	Bmag0870	F:AACCATAGGATTTGTACTAGTTTC R:TCATGACATCTCAAGAACG	55
11	HVM60	F:CAATGATGCGGTGAACTTTG R:CCTCGGATCTATGGGTCCTT	58	25	Bmac0064	F:CTGCAGGTTTCAGGAAGG R:AGATGCCCGCAAAGAGTT	58
12	HVM62	F:TCGCGACCAGACGAGAAG R:AGCTAGCCGACGACGCAC	60	26	HVCMA	F:GCCTCGGTTTGGACATATAAAG R:GTAAAGCAAATGTTGAGCAACG	62
13	EBmac0635	F:TGCTGCGATGATGAGAACT R:TAGGGTAGATCCGTCCCTATG	58	27	EBmac0827	F:CATGGTATTCAAACATACACG R:AAGGTCTTAAGGGGTGATG	55
14	EBmac0679	F:ATTGGAGCGGATTAGGAT R:CCCTATGTCATGTAGGAGATG	55	28	Scssr15864	F:GCATAAACGGGTGTAAGAGC R:CATCCAGTTCAGAGGATAGAGC	55

序号 No.	位点 Locus	引物序列 Primer sequence（5'-3'）	退火温度 Annealing temperature/℃	序号 No.	位点 Locus	引物序列 Primer sequences（5'-3'）	退火温度 Annealing temperature/℃
1	Bmag0211	F:ATTCATCGATCTTGTATTAGTCC R:ACATCATGTCGATCAAAGC	58	15	EBmac0701	F:ATGATGAGAACTCTTCACCC R:TGGCACTAAAGCAAAAGAC	55
2	Bmag0345	F:ATGAGGAATAACTCAACCAAA R:AATATATTTTCGATGTCGAGC	58	16	Bmac0310	F:CTACCTCTGAGATATCATGCC R:ATCTAGTGTGTGTTGCTTCCT	55
3	Bmag0579	F:CCTAGATAAGGAACATAGCCA R:CAAAGACCCTAACTCATGTTC	55	17	Bmag387	F:CGATGACCATTGTATTGAAG R:CTCATGTTGATGTGTGGTTAG	58
4	EBmac0501	F:ACTTAAGTGCCATGCAAAG R:AGGGACAAAAATGGCTAAG	58	18	Bmac0096	F:GCTATGGCGTACTATGTATGGTTG R:TCACGATGAGGTATGATCAAAGA	58
5	Scssr07759	F:GCAACTCCTCATCATCTCAGG R:CAACAGCCAGAAGGTCTACG	62	19	Scssr03907	F:CTCCCATCACACCATCTGTC R:GACATGGTTCCCTTCTTCTTC	60
6	Bmag0378	F:CTTTTGTTTCCGTAGCATCTA R:ATCCAACTATAGTAGCAAAGCC	58	20	Scssr10148	F:AAGCAGCAAAGCAAAGTACC R:TCATCAGCATCTGATCATCC	60
7	Bmag0711	F:GGAGAGTCACATATCAAGGAC R:CCACTCCTTCTCATACCTTTA	55	21	Bmac0018	F:GTCCTTTACGCATGAACCGT R:ACATACGCCAGACTCGTGTG	60
8	Bmag125	F:AATTAGCGAGAACAAAATCAC R:AGATAACGATGCACCACC	55	22	Bmag0009	F:AAGTGAAGCAAGCAAACAAACA R:ATCCTTCCATATTTTGATTAGGCA	58
9	Bmag0013	F:AAGGGGAATCAAAATGGGAG R:TCGAATAGGTCTCCGAAGAAA	58	23	Bmag0867	F:CCCCACACTGACCTACAG R:TTACATCTGCTAGATCGAAGC	55
10	EBmac705	F:GTGGAAAACTGAGTGAAACTC R:TTGAGGAGAAGTAATGACGAT	55	24	Bmag0870	F:AACCATAGGATTTGTACTAGTTTC R:TCATGACATCTCAAGAACG	55
11	HVM60	F:CAATGATGCGGTGAACTTTG R:CCTCGGATCTATGGGTCCTT	58	25	Bmac0064	F:CTGCAGGTTTCAGGAAGG R:AGATGCCCGCAAAGAGTT	58
12	HVM62	F:TCGCGACCAGACGAGAAG R:AGCTAGCCGACGACGCAC	60	26	HVCMA	F:GCCTCGGTTTGGACATATAAAG R:GTAAAGCAAATGTTGAGCAACG	62
13	EBmac0635	F:TGCTGCGATGATGAGAACT R:TAGGGTAGATCCGTCCCTATG	58	27	EBmac0827	F:CATGGTATTCAAACATACACG R:AAGGTCTTAAGGGGTGATG	55
14	EBmac0679	F:ATTGGAGCGGATTAGGAT R:CCCTATGTCATGTAGGAGATG	55	28	Scssr15864	F:GCATAAACGGGTGTAAGAGC R:CATCCAGTTCAGAGGATAGAGC	55

位点 Locus	染色体 Chromosome	等位基因数 Allele number	基因多样性指数 Gene diversity	杂合性 Heterozygosity	多态信息量 PIC	特异等位基因 Unique gene
Bmag0211	1H	8	0.68	0.01	0.62	1
Bmag0345	1H	5	0.75	0.00	0.71	0
Bmag0579	1H	9	0.69	0.06	0.63	0
EBmac0501	1H	10	0.45	0.02	0.44	2
Scssr07759	2H	6	0.70	0.13	0.64	1
Bmag0378	2H	6	0.55	0.02	0.45	2
Bmag0711	2H	11	0.77	0.14	0.74	0
Bmag125	2H	11	0.66	0.12	0.62	0
Bmag0013	3H	16	0.86	0.09	0.84	3
EBmac705	3H	11	0.72	0.19	0.68	3
HVM60	3H	10	0.72	0.09	0.69	3
HVM62	3H	11	0.78	0.18	0.75	3
EBmac0635	4H	8	0.64	0.07	0.62	0
EBmac0679	4H	11	0.72	0.15	0.70	1
EBmac0701	4H	9	0.66	0.10	0.64	1
Bmac0310	4H	12	0.83	0.14	0.81	0
Bmag0387	5H	10	0.79	0.08	0.76	3
Bmac0096	5H	10	0.71	0.07	0.68	2
Scssr03907	5H	13	0.78	0.11	0.75	3
Scssr10148	5H	9	0.80	0.13	0.77	1
Bmac0018	6H	5	0.53	0.12	0.50	0
Bmag0009	6H	5	0.56	0.10	0.51	0
Bmag0867	6H	8	0.50	0.12	0.45	2
Bmag0870	6H	7	0.82	0.15	0.80	0
Bmac0064	7H	9	0.54	0.08	0.50	1
HVCMA	7H	6	0.63	0.16	0.58	1
EBmac0827	7H	10	0.75	0.13	0.73	1
Scssr15864	7H	9	0.48	0.15	0.46	3
平均（Average）	-	9	0.68	0.10	0.65	1.32