生物技术通报

食用菌生物技术研究任重道远

黄晨阳

2021, 37(11): 1-3.

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CRISPR/Cas9基因编辑系统在食药用真菌中的研究进展

刘笑天, 仇昊, 田莉, 任昂, 赵明文

2021, 37(11): 4-13. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1055

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CRISPR/Cas9是目前最成功的基因组精准编辑技术。迄今为止至少在9种食药用真菌中已有相关的应用报道,包括刺芹侧耳（杏鲍菇）、糙皮侧耳（平菇）、双孢蘑菇、灵芝、裂褶菌、灰盖鬼伞、金针菇、蛹虫草和竹黄菌。本文综述了CRISPR/Cas9系统的工作原理及递送策略,针对在食药用真菌中应用存在的一些问题进行分析,并提出优化方案。最后借鉴目前CRISPR技术发展的前沿方向,如多基因编辑、碱基编辑、引导编辑、转录调控等,对未来在食药用真菌领域的应用前景进行了展望。

牛樟芝化学成分及其药理作用研究进展

李晶, 冯娜, 王升陽, 林占熺

2021, 37(11): 14-31. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1052

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近年来,牛樟芝以其稀有的资源和独特的功效逐渐被人们关注。越来越多的研究表明牛樟芝子实体、菌丝体和发酵液中均含有大量三萜、多糖等功效成分,也有公开报道其部分化合物具有抑制肿瘤、抗氧化、抗炎症等重要功效。本文对已公开报道的牛樟芝主要化合物、生物和化学合成及其药理功效等进行较全面的整理,对于牛樟芝产业的发展提出期望并指明方向,以期为牛樟芝在药物研究、开发、应用和提升牛樟芝商品化程度、市场价值等方面提供科学参考,促进牛樟芝在我国及世界的发展。

真菌黑色素研究现状与产业应用

薛帆正, 黄海辰, 吴福泉, 李晓敏, 吴小平, 傅俊生

2021, 37(11): 32-41. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0562

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天然黑色素是一种由生物细胞合成并分泌的多羟基吲哚或多羟基酚类聚合物,具有溶于碱而不溶于水和其他有机溶剂的特性,在各种动物、植物和微生物中广泛存在。当前研究已表明,天然真菌黑色素具有多种生物活性,其在多个领域均有广泛应用,是一种重要的生物材料与资源。本文综述了真菌黑色素的分类、结构、合成途径、理化性质及生物活性等研究现状,指出真菌黑色素在生产应用中具有极大的潜力和价值;进一步通过综合比较浸提法、超声波辅助提取法、超声波-微波辅助提取法和酶-超声波协同提取法等4种真菌黑色素制备方法,为产业上高效制取真菌黑色素提供借鉴;最后,归纳总结了近年来国内外对真菌黑色素在农业、工业、医药等产业上的开发应用现状,讨论了真菌黑色素在产业应用上的意义及存在的问题,以期为推动我国真菌黑色素产业应用与发展方向提供借鉴。

紫芝栽培品种‘武芝2号’（‘紫芝S2’）全基因组测序及分析

陈体强, 徐晓兰, 石林春, 钟礼义

2021, 37(11): 42-56. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1158

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采用 PacBio SMART技术并基于三代和二代数据（3+2策略）完成紫芝栽培品种‘武芝2号’（原名:S2）（通称‘紫芝S2’）基因组De novo测序、组装,完整地获得紫芝栽培品种‘武芝2号’（原名:S2）全基因组,序列总长度56.849 Mb,包括核基因组和线粒体基因组共72条Scaffolds。其中,核基因组16 681个基因,完成其中13 161个基因的注释,约占总数的78.89%;预测分析到4组串联重复的rRNA簇、405个非编码RNA 和3 305个启动子,并找到rpb2、beta-tubulin和18S,28S rRNA（SSU,LSU）等基因序列以及漆酶同工酶基因,鲨烯合酶、羊毛甾醇合酶基因与麦角甾醇合成代谢相关基因及其分布位置,为今后紫芝栽培品种（系）分子鉴定与菌株鉴别、功能基因的挖掘与利用提供可靠信息,同时也为其后续开展中国栽培灵芝种类的比较基因组学分析积累科学数据。

柱状田头菇和杨柳田头菇B交配型位点特征分析及其应用

陈卫民, 柴红梅, 杨玮娴, 马渊浩, 赵永昌

2021, 37(11): 57-64. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1091

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柱状田头菇（茶树菇）Cyclocybe aegerita在我国广泛种植,其菌株资源分为多个类群且遗传背景多样。多种命名和复杂的交配特征给柱状田头菇及近缘种的育种研究带来障碍。以两个物种柱状田头菇和杨柳田头菇C. salicacola菌株群体为研究材料,通过基因组测序及序列分析,设计特异引物扩增获取菌株群体的交配区域片段,用于菌株鉴定及系统构建。克隆获得了两个柱状田头菇菌株的B交配位点,其中约8 kb的片段序列非常保守,包括信息素受体rcb1、rcb2和部分非编码区。基于该区域含有变异区的片段设计特异引物,经对35个菌株扩增及克隆测序后,每个实验菌株中均获得1-2类型约3.2 kb片段（cbmr）。使用该片段与线粒体小亚基构建的聚类树契合度较高,但前者在类群的划分上更为精细。此外,该片段的变异区也为类群和交配型鉴定提供了靶位点。依据B交配型部分位点设计的引物在所有的实验菌株中均获得相应的片段,可以作为分子标记用于柱状田头菇和杨柳田头菇菌株及B交配型分子鉴定。

RNAi法分析糙皮侧耳XBP1转录因子

齐雨慧, 黄晨阳, 张利姣

2021, 37(11): 65-71. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1068

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转录因子XBP1是真菌发育和其他生物过程的关键调节因子。利用RNAi法探究其在糙皮侧耳生长发育过程中的功能。以糙皮侧耳CCMSSC00389为材料,克隆获得PoXBP1基因,全长1 326 bp,编码441个氨基酸,生物信息学分析结果表明XBP1蛋白含有HTH APSES结构域,无信号肽,是非跨膜结构蛋白。在野生型菌株的不同发育阶段的表达显示,PoXBP1基因在菌丝、原基、孢子、菌盖、菌柄中的表达依次降低。通过农杆菌介导的遗传转化法筛选获得PoXBP1干扰菌株,其中,干扰菌株RNAiPoXBP1-1和RNAiPoXBP1-4的生长速度慢于野生型菌株,表明了PoXBP1表达量降低,延缓了糙皮侧耳菌丝和子实体的生长速度。

虫草素抗三阴性乳腺癌的转录组学分析

黄海辰, 吴文雅, 戚梦, 薛帆正, 吴小平, 张君丽, 傅俊生

2021, 37(11): 72-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0444

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前期研究表明,蛹虫草活性成分虫草素能有效抑制乳腺癌移植瘤的生长和转移,但其作用机制未清楚。本研究取三阴性乳腺癌移植瘤样品,通过转录组测序技术分析虫草素抗乳腺癌移植瘤的分子作用机制。结果表明,以P<0.05、log₂|FC|>1为标准,筛选获得584个差异表达基因,其中上调基因69个,下调基因515个;KEGG分析表明,虫草素对乳腺癌移植瘤的分子调控涉及Hippo signaling pathway、Hedgehog signaling pathway、ECM-receptor interction、TGF-beta signaling pathway等多条癌症相关信号通路;GO分析表明,这些差异基因富集在biological adhesion、growth、metabolic process、locomotion和biological process等16个生物学过程中,提示虫草素对乳腺癌移植瘤生长与转移有极显著的调节作用;进一步对生长和转移过程的基因进行PPI互作分析,提示Hedgehog signaling pathway、Hippo signaling pathway是虫草素抗三阴性乳腺癌的重要潜在作用通路。研究结果提示Hippo-Yap/TAZ信号通路和Hedgehog-Gli信号通路为潜在作用通路,为进一步理解虫草素治疗三阴性乳腺癌的分子机制奠定了基础。

灵芝子实体、菌丝体和孢子黑色素的结构表征与理化性质研究

王昭玉, 常明昌, 徐丽婧, 孟俊龙, 左宁柯, 潘旭

2021, 37(11): 81-91. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0659

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为探讨灵芝子实体（GLM）、菌丝体（GLHM）和孢子（GLSM）黑色素结构和理化性质的差异,通过元素分析、紫外-可见光谱和傅里叶红外光谱等手段分析这3种黑色素的结构,并对这3种黑色素的理化性质如溶解性、色价、稳定性及体外抗氧化活性和对胰脂肪酶活性的抑制作用进行了比较研究。结果表明,这3种黑色素为真黑色素。与灵芝子实体和孢子黑色素相比,灵芝菌丝体黑色素具有更好的溶解性、色价和稳定性以及具有较强的体外抗氧化活性和体外对胰脂肪酶活性的抑制作用。研究结果为灵芝菌丝体黑色素的生物活性和实际应用提供理论基础。

鹿茸菇多糖抗氧化保肝研究

张凤培, 徐慧, 邱绍峰, 张君丽, 吴小平, 傅俊生

2021, 37(11): 92-100. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0891

摘要 ( 694 )

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鹿茸菇是一种珍贵的食药用真菌,鹿茸菇子实体粗多糖具有抗肿瘤、保肝等多种生理活性。以自由基清除率为指标,分析鹿茸菇多糖的化学抗氧化活性,再以H₂O₂建立LO2肝细胞损伤模型,进一步研究鹿茸菇子实体多糖对肝细胞氧化应激损伤的改善机制。结果表明:在体外抗氧化方面,鹿茸菇子实体多糖对DPPH、ABTS、OH自由基具有一定的清除能力,其EC₅₀值分别为:0.218 mg/mL、0.027 mg/mL和2.744 mg/mL;在改善肝细胞氧化应激损伤方面,随着多糖浓度升高,细胞存活率也显著提高,当多糖浓度为5 mmol/mL时,细胞存活率达到94.1%;在清除机体过氧化机制上,相对于模型组,鹿茸菇多糖组抗氧化酶SOD和CAT活力分别提高2.55倍和2.17倍,显著降低细胞内ROS水平,从细胞水平表明鹿茸菇子实体多糖对肝细胞氧化损伤具有一定的改善作用,为鹿茸菇制备保肝类产品提供了一定的研究思路。

白灵侧耳野生种质群体生长发育相关性状评价

杨雅舒, 汪颖, 高巍

2021, 37(11): 101-108. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1147

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通过对野生种质群体生长发育性状的表型鉴定和分析,揭示我国特有种类白灵侧耳种质资源的多样性和可利用性。从国家标准菌株库的库藏中随机选择了100个白灵侧耳野生菌株,对其生长发育性状,即PDA培养基平板中的菌丝生长速度、棉籽壳培养料试管中的菌丝长速及原基形成时间等3个性状进行了表型测定和分析。根据性状数据的统计分析发现3个性状均为多基因控制的数量性状,且性状间不具有显著的相关性;菌丝长速性状具有较高的广义遗传力,说明性状的遗传变异主要由基因型决定。来源于不同地区的菌株原基形成所需的时间存在显著性差异,发现来自于托里县的菌株原基形成所需的时间最短,而来自于青河县的菌株原基形成时间最长,推测可能由不同来源地菌株的进化机制不同造成。研究结果为发掘白灵侧耳育种的可利用种质提供了科学依据,为将优异种质资源转化为可利用的亲本材料提供理论基础。

双孢蘑菇野生种质资源营养成分分析与评价

郑惠清, 郭仲杰, 蔡志欣, 卢园萍, 廖剑华, 陈美元

2021, 37(11): 109-118. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1137

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为了评价双孢蘑菇野生种质资源的营养成分,筛选具有较好或特殊营养成分的种质,为双孢蘑菇育种提供科学的参考依据。以3份主栽品种为对照,分析评价了93份双孢蘑菇野生种质材料的蛋白质、氨基酸和脂肪酸的营养成分含量,并以营养成分含量均高于均值为依据筛选营养高效均衡的种质资源。结果表明,双孢蘑菇野生种质的蛋白质含量为29.50-37.60 g/100g,必需氨基酸含量为4.51-8.89 g/100g,必需氨基酸的比例为24.69%-40.59%,亚油酸含量为4 086.55-14 190.28 mg/kg,不饱和脂肪酸的比例为77.63%-87.47%。氨基酸的平均变异系数21.05%,亚油酸的变异系数22.93%。93份双孢蘑菇野生种质资源中氨基酸、脂肪酸含量存在丰富的变异,基于实验结果筛选到14份营养高效均衡的种质资源,可为双孢蘑菇品质提升定向育种提供亲本材料。

等离子体诱变选育高产胞外多糖花脸香蘑菌株

范敏, 王丽宁

2021, 37(11): 119-124. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0278

摘要 ( 353 )

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花脸香蘑多糖具有较大的药用价值,选育高产多糖花脸香蘑菌株可丰富种质资源并促进花脸香蘑多糖科技创新和产业发展。以花脸香蘑原生质体单核体菌株LS01_10作为出发菌株,利用等离子体诱变技术选育高产胞外多糖的花脸香蘑菌株。在诱变功率为200 W,诱变时间为60 s的条件下,共获得5个性状稳定遗传的高产胞外多糖诱变菌株,其胞外多糖的产量是出发菌株的1.2-2.4倍。诱变菌株的菌丝形态和颜色都发生不同程度改变,且生物量均高于出发菌株。ISSR实验结果表明,诱变菌株与出发菌株相比在遗传水平发生不同程度的改变。高产多糖诱变菌株为进一步解析多糖高产机制提供了重要的菌种资源。

泰山野生蛹虫草优良菌株的筛选

郭玉峰, 汪乔, 王祥锋, 周婷, 杨晓君, 王庆佶, 王丽

2021, 37(11): 125-133. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1011

摘要 ( 353 )

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为进一步深入挖掘泰山地区的蛹虫草资源,获得高产优质的优良菌株,以采集分离自泰山地区的14株野生蛹虫草菌株为实验材料,通过菌丝长速测定、菌落特征观察、出草试验及主要活性物质（虫草素、N⁶-（2-羟乙基）腺苷、虫草多糖、β-类胡萝卜素、叶黄素）的测定分析,并利用归一化算法对各菌株特性进行综合评价。最终筛选出2个综合性状优异的蛹虫草菌株和1个虫草素含量较高的菌株。2个综合性状较优良的菌株的子实体成熟周期均为46.3 d,子实体粗长,生物学效率分别为55.31%和58.08%,虫草素含量分别为5.43 mg/g和7.13 mg/g,腺苷含量分别为0.38 mg/g和0.56 mg/g,多糖含量分别为90.44 mg/g和84.68 mg/g;1个菌株产量较低,但虫草素含量高达 15.14 mg/g,腺苷含量也较高,为0.66 mg/g。

双孢蘑菇新型颗粒原种配方的优化

曾志恒, 曾辉, 蔡志欣, 郭仲杰, 卢园萍, 陈美元, 廖剑华, 戴建清

2021, 37(11): 134-141. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1113

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旨在研发菌丝含量高、菌丝活力强、萌发点多、松散均一的双孢蘑菇新型颗粒原种。采用单因素和正交试验,以相对菌丝量为指标,考察了颗粒基质配方的C/N、起始pH、含水量和珍珠岩添加量对双孢蘑菇颗粒原种的影响,并优化新型颗粒原种配方;以谷粒原种为对照,通过多项指标比较了新型颗粒原种扩繁栽培种效果。结果表明,双孢蘑菇颗粒基质配方的C/N越小,相对菌丝量越大;珍珠岩添加量越少,相对菌丝量越大;颗粒原种最优配方组合A₁B₁C₃D₃,优化配方为菜籽粕78 g,麸皮10 g,粪草发酵料20 g,硅藻岩20 g,珍珠岩5 g、轻质碳酸钙15 g,起始pH 7.6,含水量54%;新型颗粒原种颗粒数280-300 n/g,多于小米原种颗粒数180-200 n/g,显著多于麦粒原种颗粒数16-18 n/g,新型颗粒原种相对菌丝量为326.5 mg/g,分别是小米原种相对菌丝量252.9 mg/g的1.29倍和麦粒原种139.2 mg/g的2.35倍。在接种量为0.2%条件下,新型颗粒原种扩繁透气袋栽培种平均菌丝满袋时间为15.8 d,短于小米原种的18.4 d和麦粒原种的19.6 d。说明新型颗粒原种较谷粒原种扩繁栽培种具有优势。

东方栓孔菌漆酶的固定化及其对不同类型染料的脱色作用

王豪, 唐禄鑫, 马鸿飞, 钱坤, 司静, 崔宝凯

2021, 37(11): 142-157. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1173

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漆酶是一种天然的绿色催化剂,由于具有催化效率高、底物特异性广、对辅因子和特定环境条件要求少、无毒等优点,因而在制浆造纸、生物合成、改善纤维性能、食品加工、生物传感器制造、农林废弃物的生物转化和炼制,特别是环境污染物的生物降解和生物修复等领域具有巨大的应用潜力。但游离漆酶稳定性差且成本较高,固定化方法成为解决该问题的有效手段,其能够有效增强酶的热稳定性及对极端环境的耐受力、使酶易与产物分离以提高酶回收率。本研究基于前期筛选获得的一株高产漆酶白腐真菌菌株东方栓孔菌（Trametes orientalis）所分泌的漆酶（Tolacc-T）,对其纯化酶蛋白以壳聚糖作为载体、戊二醛作为交联剂进行了固定化处理,命名为Tolacc-T@Chit@GA,并优化了固定化条件为戊二醛浓度0.7%（V/V）、交联时间4 h、给酶量6.0 mL、固定化时间6 h。与Tolacc-T相比,Tolacc-T@Chit@GA的pH适应性、耐热变性能力及贮存稳定性均显著增强。循环使用时的稳定性和耐久性也十分明显,循环使用7次后,Tolacc-T@Chit@GA的相对活性仍可保持在80%以上。此外,Tolacc-T@Chit@GA还可使不同类型的染料脱色,尤其对金属络合染料萘酚绿B的脱色效果最佳,气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectroscopy,GC-MS）检测确定该染料部分代谢产物为1-萘胺、2-萘酚、1-氨基-2-萘酚、1-亚硝基-2-萘酚、1-亚硝基-2-萘酚-6-磺酸。上述结果证明,东方栓孔菌固定化漆酶Tolacc-T@Chit@GA具有较好的稳定性和可重复利用性,存在广阔的应用前景。

香菇菌渣高效纤维素降解菌的筛选及产酶优化

陶治东, 何艳慧, 邓子禾, 孙琳琳, 武占省

2021, 37(11): 158-165. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1120

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利用香菇菌渣开发生物有机肥目前是解决废弃菌渣资源化的主要趋势,为了更好地腐熟香菇菌渣,从废弃香菇菌渣中筛选出1株高效纤维素降解菌株DGW1,并优化产纤维素酶条件及评估降解菌渣能力,以期为后续利用香菇菌渣进行堆肥发酵生产生物有机肥奠定基础。采用CMC-Na平板法和刚果红染色法初步筛选,结合滤纸条崩解试验和纤维素酶活性测定进行复筛,并通过形态学观察和18S rDNA分子生物学鉴定菌株,优化菌株DGW1的产纤维素降解酶条件。结果表明:获得的高效纤维素降解菌株DGW1鉴定为里氏木霉,7 d内可将滤纸条降解为糊状。菌株DGW1最佳产酶条件为温度30℃、时间4 d,滤纸酶的酶活（FPase）为112.71 U/g,并在pH 4-7都能达到较高酶活且不低于96 U/g。菌株DGW1对香菇菌渣的降解率为31.14%（14 d）。因此,获得的菌株DGW1能够高效降解香菇菌渣,其纤维素酶活较高,对香菇菌渣发酵堆肥,制备生物有机肥具有较大应用潜力。

羊肚菌栽培对沙漠砂基质中微生物群落及基质理化性质的影响

谭昊, 刘天海, 闫世杰, 余洋, 姜邻, 彭卫红

2021, 37(11): 166-177. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1110

摘要 ( 389 )

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为开发沙漠砂代替土壤作为羊肚菌栽培基质,研究羊肚菌栽培对沙漠砂中微生物群落及基质理化性质的影响。利用扩增子测序分别检测栽培与未栽培羊肚菌的沙漠砂中细菌、真菌群落,解析总有机碳、腐殖质和氮素含量等理化性质。收获子实体产量（1 210±259）g/m²鲜重,说明沙漠砂栽培羊肚菌可行。沙漠砂基质中微生物多样性在羊肚菌栽培过程中短暂下降,在羊肚菌出菇采收后回升。真菌群落以子囊菌门为主。随着羊肚菌在沙漠砂中增殖,扫描电镜观察到大量菌丝形成网络状缠绕固定沙漠砂颗粒。细菌群落以变形菌门、放线菌门、拟杆菌门为主。假单胞菌属相对丰度在羊肚菌菌丝生长期明显上升,蓝细菌门在羊肚菌采收后大幅度扩增,伴随总氮和铵态氮含量显著上升,超越了栽培羊肚菌之前的初始水平。栽培羊肚菌使沙漠砂中有机质含量提升7倍,出菇后基质中胡敏酸、富啡酸、胡敏素含量显著上升。研究结果揭示了用沙漠砂种植羊肚菌在收获高值农产品的同时改良沙漠砂理化性质的应用潜力。

银耳胶复配体系的流变学特性研究

陈剑秋, 黄胜, 赵伟超, 占观平, 孙淑静, 陈利丁

2021, 37(11): 178-189. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0634

摘要 ( 308 )

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银耳胶是一种经简易浸提工艺所制得的新型食品添加剂,主要成分为银耳多糖。本研究制备了两种不同的黄原胶-银耳胶（XG-TFG）和瓜儿豆胶-银耳胶（GG-TFG）的复配胶溶液并分析了两种单胶体（XG、GG）及其复配胶溶液在不同理化条件下的表观黏度和流变学特性,并比较了添加不同比例复配胶酸奶的感官评价。结果表明所有胶体溶液的表观黏度随胶浓度的增加呈现非线性增长;离子种类和浓度对XG-TFG复配胶表观黏度的影响显著小于XG单体胶;此外,复配胶表观黏度在弱酸和弱碱环境中保持稳定,但会在较低加热温度下随加热时间增加而下降。加入TFG能减缓由低浓度糖溶液和超声处理引起的胶体表观黏度下降。冻融后的复配胶表观黏度均未下降,呈现较好的稳定性。流变学测试结果表明了复配后的胶体均为假塑性流体,具有较好的剪切恢复能力。GG与TFG配比为1:1时,酸奶中添加复配胶的总体评价最高,口感最佳,说明合适的胶体配比能够改善酸奶的质构和风味。以上研究结果将为TFG与其他胶体的复配及其应用提供理论依据。

拟南芥IQM4互作蛋白的筛选和鉴定

杨华杰, 周玉萍, 范甜, 吕天晓, 谢楚萍, 田长恩

2021, 37(11): 190-196. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0235

摘要 ( 415 )

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拟南芥IQM4由AT2G26190编码,是1个含有IQ基序的Ca²⁺不依赖型钙调素结合蛋白,筛选和鉴定与IQM4互作的蛋白为进一步阐明IQM4所涉及的信号途径奠定基础。通过酵母双杂交筛选拟南芥幼苗cDNA文库,进而通过一对一的酵母双杂交试验和双分子荧光互补试验验证蛋白之间的互作关系。结果表明,获得15个与IQM4互作的候选蛋白;确定了CAT2和FBA1与IQM4蛋白存在互作关系,表明IQM4与CAT2及FBA1在植物细胞中存在相互作用。

山杏种子MATE家族分析及其重要成员MATE40克隆表达

刘潇菡, 林子欣, 修宇, 党瑗, 林善枝

2021, 37(11): 197-211. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0590

摘要 ( 398 )

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山杏种子中的苦杏仁苷极大限制其油脂及其他相关产品的开发利用,而多药和有毒化合物排出（multidrug and toxic compound extrusion,MATE）转运蛋白可能在苦杏仁苷转运过程中起重要作用。运用生物信息学方法对山杏种子PsMATE家族成员进行预测分析,采用qRT-PCR技术对其在发育种子中的表达模式进行分析测定;利用qRT-PCR技术对PsMATE40进行组织特异性表达分析,使用GFP融合蛋白表达法对其进行亚细胞定位分析。基于实验室前期获得的山杏种子转录组数据,利用功能注释及生物信息学分析确定17个山杏种子PsMATE基因家族成员,可分为3个亚家族:亚家族1、亚家族2与亚家族4;上述基因编码蛋白二级结构以α-螺旋为主,含多个磷酸化位点;除PsMATE23、PsMATE33、PsMATE35A与PsMATE35B蛋白为酸性蛋白外,其余均为碱性蛋白;15个PsMATE蛋白为强疏水性跨膜转运蛋白,定位于质膜。qRT-PCR分析显示,PsMATE家族成员在山杏发育种子中均有表达,但不同发育期表达量差异显著,其中PsMATE40表达量在该家族基因中最高;结合系统发育结果,PsMATE40与已被鉴定具有苦杏仁苷转运的MATE蛋白聚类在一起,据此推测PsMATE40基因在山杏种子苦杏仁苷的转运中起重要作用;成功克隆获得PsMATE40基因序列;qRT-PCR分析表明,PsMATE40基因在山杏种子中表达量最高而在根中最低,表明PsMATE40表达具有组织特异性;构建植物表达载体pBI121-GFP-PsMATE40并瞬时转化烟草叶片,荧光显微镜检测PsMATE40转运蛋白定位于质膜。研究结果为阐明山杏种子苦杏仁苷的跨膜转运原理及分子定向培育低苦杏仁苷含量的油料植物奠定重要基础。

橡胶草TkDREB2基因的克隆以及在烟草中的抗旱功能分析

张云川, 林熠轩, 曹新文, 王海楠, 闫洁

2021, 37(11): 212-224. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0108

摘要 ( 404 )

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为探究茉莉酸在提高植物抗旱性方面发挥的重要作用。对橡胶草外施茉莉酸甲酯（MeJA）处理的转录组进行差异表达谱分析,并筛选克隆出一个受茉莉酸诱导表达显著上调的AP2/EREBP亚家族基因DREB,命名为TkDREB2,对其进行生物信息学分析并转化烟草,进一步对TkDREB2转基因烟草植株在发育期的抗旱性功能鉴定,对转基因烟草进行自然干旱处理,并测定相关生理指标。结果显示在茉莉酸甲酯处理的转录组分析中发现与茉莉酸合成相关的基因和转录因子AP2/EREBP、MYB、MYC、NAC和WRKY的表达水平发生显著变化。筛选克隆的TkDREB2基因全长CDS序列为1 002 bp,编码333个氨基酸,属于AP2/EREBP亚家族的DREB型转录因子;系统进化树分析表明,该蛋白与苜蓿的DREB蛋白同源性最近。对转基因烟草进行自然干旱处理15 d后发现野生型叶片开始萎蔫;继续处理至22 d,野生型叶片严重萎蔫而转基因烟草仅轻微萎蔫,测定正常生长及干旱处理后野生型和转基因烟草的相关生理指标发现:在正常生长条件下,转基因烟草的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性大约是野生型的2倍;在干旱处理后,转基因烟草的CAT、SOD和POD活性分别是野生型的2倍、2倍和1.5倍左右,丙二醛（MDA）含量和相对电导率仅是野生型的1/2左右。综合以上结果表明TkDREB2能够积极响应茉莉酸的诱导表达,过表达TkDREB2基因能够明显提高烟草的抗旱性,推测DREB2转录因子可能在茉莉酸信号转导调控植物抗旱性方面发挥重要作用。

西藏沙棘根瘤及根际土壤放线菌分离及抗菌活性研究

罗亚军, 孙红敏, 何宁, 袁丽杰, 解云英

2021, 37(11): 225-236. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0288

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探索西藏林芝与山南地区沙棘根瘤及其根际土壤样品中放线菌的多样性及抗菌活性,为天然产物药物研发提供新的微生物资源。采用稀释涂布法对10份样品中可培养放线菌进行分离,后经菌株16S rRNA序列测序,以邻接法（neighbor-joining method,N-J）构建系统发育树分析放线菌种属多样性;利用微孔板法对代表性菌株进行发酵培养及抗菌活性评价;进一步利用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）考察活性菌株代谢产物情况。从10份样品中分离到112株放线菌,分属于7个目12科23个属,优势菌属为链霉菌属（Streptomyces）;抗菌活性结果表明有17株放线菌至少对一种检定菌有抗菌活性,阳性抑菌率为36.9%。有16株放线菌对临床常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）有较强抑制活性,其中13株放线菌对MRSA抑制率超过阳性对照药万古霉素;另外有7株放线菌对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRAB）有抑制活性,其中Streptomyces sp. XZ19-363对CRAB抑菌作用最强,抑制率为91.3%,UPLC-MS分析显示,具有广谱抗菌活性的菌株在不同培养基中产生了较为丰富的次级代谢产物。西藏林芝与山南地区沙棘根瘤及其根际土壤中可培养放线菌资源丰富多样,同时具有较好的抗菌活性且代谢产物丰富。

好氧堆肥高温期灭活病原菌的效果和影响因素研究

杨天杰, 张令昕, 顾少华, 潘子豪, 江高飞, 王世梅, 韦中, 徐阳春, 沈其荣

2021, 37(11): 237-247. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0048

摘要 ( 354 )

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畜禽粪便和秸秆等农业有机废弃物中存在大量具有致病风险的人体和动植物病原菌,好氧堆肥高温期对病原菌的消减效果和影响病原菌存活的理化因子需探明。首先检测了市售25种商品有机肥料中病原菌存活的情况;其次考察了好氧堆肥高温阶段病原菌的灭活效果,并探究温度、pH、铵浓度对2种模式病原菌（大肠杆菌与青枯菌）存活的影响。调查的25种商品有机肥中有3个样品检测出存活的潜在病原菌,表明市售商品有机肥仍存在环境风险。好氧堆肥高温期对病原菌的灭活试验表明,高温期后堆体中仅检测出丰度极低的病原菌DNA。室内试验表明随着温度的升高,2种模式病原菌的存活能力减弱,灭活的时间缩短;pH对2种病原菌的灭活效果不同;铵浓度越高,对2种病原菌生长的抑制效果越强。高温期是好氧堆肥过程中病原菌灭活的重要阶段,堆肥高温期可有效消减畜禽粪便堆肥原料中的大部分病原菌,达到相关行业标准的要求。堆体温度、pH和铵浓度是影响病原菌存活的重要因素。

雨生红球藻转录因子Whirly1的获得及其表达分析

刘纹甫, 黄丹琼, 胡群菊, 王潮岗

2021, 37(11): 248-256. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1348

摘要 ( 342 )

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Whirly转录因子广泛存在于植物中,参与植物生长发育进程和逆境胁迫耐受,对其功能的研究有助于我们理解雨生红球藻响应胁迫的机制。因此,先根据雨生红球藻192.80转录组测序数据,分离克隆到一个Whirly转录因子序列,并对其结构及表达进行分析。该转录因子的cDNA序列为924 bp,基因组序列为2 556 bp,由有5个外显子和4个内含子组成,命名为HpWhirly1。HpWhirly1预测由244个氨基酸组成,拥有Whirly转录因子的保守结构域。HpWhirly1在醋酸钠和水杨酸胁迫早期表达上调,在强光-醋酸钠联合胁迫和缺氮胁迫条件下表达下调,表明其在雨生红球藻受到胁迫时发挥一定的作用。以上研究结果将有助于进一步研究Whirly转录因子的功能及其在雨生红球藻响应胁迫时的作用。

一种新型酰基转移酶GPAT的克隆、表达与酶学性质研究

刘珊, 叶伟, 朱牧孜, 李赛妮, 邓张双, 章卫民

2021, 37(11): 257-266. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1508

摘要 ( 375 )

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Lithocarpins为分离自海洋真菌Phomopsis lithocarpus的聚酮类新骨架化合物,具有开发成为新型抗肿瘤药物先导化合物的潜力。基于基因组测序和生物信息学分析预测了lithocarpins的生物合成基因簇,对其中的未知功能基因g7779进行扩增,并在大肠杆菌中进行表达,利用镍亲和层析柱进行纯化,通过质谱测序、生物信息学分析及酶活力检测等方法,对纯化的蛋白进行了功能分析。结果表明:基因g7779表达的蛋白是一个兼具较强的酰基转移酶活性和一定的谷丙转氨酶活性的新型双功能酶（glutamic-pyruvic transaminase-acyltransferase,GPAT）,纯度达到98.6%。结构分析显示,该蛋白由326个氨基酸残基组成,其分子量为36 kD,其二级结构包括55.52% α-螺旋、29.45%无规则卷曲、9.82%延伸链和5.21% β-转角;酰基转移酶活性分析表明,GPAT对底物乙酰辅酶A的最适反应温度为35℃,当pH为7.0时酶活最高,在40℃时的热稳定性较好,在此温度下处理2 h后,残留酶活力仍大于80%,而在50℃下热稳定性较差,处理30 min后残留酶活力低于10%;其酶动力学常数K_m = 761.57 μmol/L,最大反应速率V_max= 29 370 μmol/（mg·min）。研究结果将为后续阐明lithocarpins生物合成途径提供分子生物学依据。

维氏气单胞菌新型sRNA N155的鉴定及功能研究

何金花, 马香, 唐燕琼, 王丹, 李宏, 刘柱

2021, 37(11): 267-275. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1506

摘要 ( 335 )

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维氏气单胞菌（Aeromonas veronii,A.veronii）是一种新型病原体,既能感染鱼类,又可以感染包括人在内的哺乳动物,其致病机理尚不完全清楚。基于A.veronii C4野生型菌株转录组数据一个新的sRNA N155被鉴定,进一步利用同源重组等分子生物学手段构建了sRNA N155的缺失菌株。转录组数据和RT-qPCR分析结果表明,sRNA N155独立转录。序列比对分析发现,sRNA N155具有物种特异性,仅存在于气单胞菌属中。生长曲线测定和运动性实验结果表明,sRNA N155的敲除不影响A.veronii生长,但会导致A.veronii运动能力下降。本研究成功构建的ΔsRNA N155敲除菌株,为进一步研究sRNA N155在A.veronii中的功能提供了可靠材料。

降水变化驱动下的高寒湿地产甲烷菌群落特征变化

章妮, 暴涵, 左弟召, 陈克龙

2021, 37(11): 276-284. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1580

摘要 ( 349 )

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高寒湿地土壤微生物对全球气候变化十分敏感。为研究青藏高原高寒湿地土壤产甲烷菌群落对降水变化的响应,本研究设置了5种降水梯度,即自然降雨、减少自然降雨的25%和50%以及增加自然降雨的25%和50%。利用mcrA基因进行高通量测序分析土壤产甲烷菌的群落结构及多样性。高寒湿地产甲烷菌优势菌目为甲烷微菌目、八叠球菌目及甲烷杆菌目。增雨处理显著降低了产甲烷菌菌群的相对丰度以及多样性指数,减雨处理显著增加了产甲烷菌菌群的相对丰度以及多样性指数。产甲烷菌群落组成对增减雨50%处理的响应更显著,仅甲烷丝菌属和甲烷杆菌属分别对增雨25%处理及减雨25%处理较敏感;产甲烷菌群落的丰富度指数对增雨50%处理及减雨25%处理较为敏感,Shannon及Simpson多样性指数则与之相反。Lefse分析表明,不同降水梯度处理后,产生了16个差异菌群,以减雨50%处理下差异菌群最多,纲水平到属水平共有9个差异菌群。总之,降水变化显著影响对高寒湿地产甲烷菌的群落结构以及群落多样性。

基于荧光自淬灭引物的沙门氏菌新型荧光定量PCR方法的开发

丰敏, 李舒婷, 张洋子, 粟元, 朱龙佼, 曹际娟, 刘海燕, 许文涛

2021, 37(11): 285-292. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0101

摘要 ( 392 )

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沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌,由沙门氏菌引起的食源性疾病位居榜首。荧光定量聚合酶链式反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）是一种准确、可靠的用于核酸定量的扩增技术,常用的荧光探针法使得扩增体系复杂、引物合成成本高。为了简化FQ-PCR的扩增体系,减少标记基团的修饰,拟通过单标记的荧光自淬灭引物实现新型荧光定量聚合酶链式反应（innovative FQ-PCR,IFQ-PCR）用于模板DNA的定量检测。根据沙门氏菌特异性基因设计单标记发卡型荧光自淬灭引物,并将其应用于FQ-PCR实现了沙门氏菌的检测。设计的自淬灭引物探针一体化,只需单标记,无需额外探针或染料的加入,简化了扩增体系,降低了检测成本;同时引物的发卡结构提高了检测特异性。在最优的引物浓度（0.4 μmol/L）下,沙门氏菌在10¹-10⁵ CFU/mL的浓度范围内其浓度的对数值与循环阈值（cycle threshold,CT）值之间呈现良好的线性关系,R²高达0.99,检测限低至2 CFU/mL,并且在1.5 h内即可完成扩增检测,方法的稳定性符合要求。因此,一种基于荧光自淬灭引物的IFQ-PCR方法被开发出来并实现了沙门氏菌的简便、快速、灵敏、特异、低成本的检测。

基于荧光检测技术的青稞品种鉴定方法的建立

管俊娇, 杨晓洪, 张鹏, 黄清梅, 张建华

2021, 37(11): 293-302. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1494

摘要 ( 342 )

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本研究通过筛选出一套SSR 核心引物,建立青稞DNA指纹鉴定体系,为青稞品种选育、品种鉴定提供高通量检测技术方法。首先以形态差异大的 24 份种质为材料,对198 对 SSR 引物进行初筛,筛选出 42对多态性好、扩增稳定、条带清晰的 SSR 引物,并对之进行荧光标记。采用筛选出的42对引物对226份材料进行 PCR 扩增,扩增产物经毛细管电泳检测,最终筛选出28对SSR 荧光引物建立基于高通量荧光 SSR 标记的青稞品种鉴定体系。采用 28对 SSR 引物构建的 DNA 指纹图谱进行226个青稞材料的鉴定。28对SSR引物共检测到252 个等位基因,每对引物可检测到有效等位基因数为5-16个,平均等位基因数为9;基因多样性指数变异范围为0.48-0.86,平均为0.68;多态信息量（PIC）变幅为0.44-0.84,平均为 0.65。226份材料的遗传距离为0-0.99,该套引物可以将大部分参试材料区分开。从 28 对SSR 引物中选择了 7对分布于不同染色体上、扩增和检测效果较好的引物（Bmag0211、Scssr07759、HVM62、EBmac0679、Scssr03907、Bmag0870、EBmac0827）,构建青稞品种（系）DNA的指纹图谱库。为消除不同检测平台、不同试验批次等引起的误差,为7对SSR 核心引物各主要等位变异选择相应的参照品种,作为普通聚丙烯酰胺凝胶电泳的读带依据。最终构建了在2个检测平台（毛细管电泳平台及聚丙烯酰胺凝胶电泳平台）通用的SSR分子标记青稞品种鉴定体系。

2021, 37(11): 303.

摘要 ( 102 )

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