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分选酶A(SrtA)的GST融合表达、纯化及活性测定

邓思;罗立新;   

  1. 华南理工大学生物科学与工程学院;
  • 出版日期:2012-05-26 发布日期:2012-05-26

  • Published:2012-05-26 Online:2012-05-26

摘要: 构建GST/金黄色葡萄球菌分选酶A(SrtA)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化分选酶,并利用展示在酵母表面的底物检测分选酶的活性。以pMD20-SrtA为模板,PCR扩增得到SrtA△N59基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-SrtA△N59,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,GST亲和层析分离纯化得到SrtA△N59,与展示在酵母表面的底物序列QALPETGEE-linker-EGFP作用,产生游离的EGFP,通过酶标仪检测EGFP荧光强度确定分选酶的活性。结果显示,重组表达载体pGEX-SrtA△N59经IPTG诱导,表达出相对分子质量约为42 kD的融合蛋白,SDS-PAGE分析,该融合蛋白是以可溶形式表达。分离纯化得到的分选酶与底物作用,其荧光强度由568.66±12.14增加至921.43±13.02。以上结果表明,成功构建了重组表达载体pGEX-SrtA△N59,并在大肠杆菌中获得了可溶表达的有活性的分选酶。

关键词: 分选酶A, GST融合表达, 纯化, 底物, 活性测定