核酸适体的筛选制备及分析应用

摘要/Abstract

摘要： 核酸适体（Aptamer）是通过配体指数富集系统进化技术（SELEX）在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列，它可以和不同的靶标，如小分子物质、蛋白质、药物及抗生素等进行高亲和力和高特异性的结合。由于靶分子范围广、相对稳定、易体外合成和修饰等特性，核酸适体在疾病检测、临床治疗、生化分析、药物研发等领域得到了广泛应用。以农药为靶标的核酸适体技术在农药残留检测中也得到了初步应用。总结相关文献，介绍核酸适体的发现、特点及其筛选方法的基本原理和筛选过程中的主要分离方法，列举核酸适体在农药、抗生素、金属离子、生物毒素、微生物以及蛋白质检测中的应用，并对核酸适体的检测应用进行展望。

关键词: 核酸适体, 配体指数富集系统进化技术, 制备, 分析应用

Abstract: Aptamer is a kind of synthetic oligonucleotides by in vitro screening of systematic evolution of ligands by exponential enrichment（SELEX）, which can bind to different targets, such as small organic molecules, proteins, drugs or antibiotics etc., with high affinity and specificity. Due to their special characteristics of a wide range of targets, good stability, simple preparation and easy modification in vitro, aptamers have been widely used in disease diagnosis, clinical therapy, bioanalysis, drug development and other fields. The SELEX method using pesticides as targets has been preliminarily applied in the determination of pesticide residues. Based on recent literatures, this paper describes the finding history and merits of aptamers, the principle as well as separation methods in aptamers sieving process by use of SELEX. Applications of aptamers in pesticides, antibiotics, metal ions, biotoxins, pathogenic microorganism and proteins were also summarized. Furthermore, the prospect of aptamers based detection techniques were proposed.

Key words: Aptamer, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, Preparation, Analytical application

刘腾飞, 杨代凤, 邓金花, 董明辉, 邓青青. 核酸适体的筛选制备及分析应用[J]. 生物技术通报, 2013, 0(4): 39-48.

Liu Tengfei, Yang Daifeng, Deng Jinhua, Dong Minghui, Deng Qingqing. Screening and Preparation of Aptamer and Its Analytical Application[J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 0(4): 39-48.

参考文献

［1］ Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment ：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].
Science, 1990, 249（4968）：505-510.
［2］ Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J]. Nature, 1990, 346 ：818-822.
［3］ Song SP, Wang LH, Li J, et al. Aptamer-based biosensors[J].
TrAC Trends Anal Chem, 2008, 27（2）：108-117.
［4］徐敦明, 吴敏, 邹远, 等. 核酸适体技术在食品安全分析中的应用[J]. 分析化学, 2011, 39（6）：925-933.
［5］ Stoltenburg R, Reinemann C, Strehlitz B. SELEX-a（r）evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands[J]. Biomol Eng, 2007, 24（4）：381-403.
［6］徐发良, 肖觉. SELEX 技术的靶标范围拓展[J]. 第二军医大学学报, 2012, 33（4）：432-435.
［7］ Burgstaller P, Girod A, Blind M. Aptamers as tools for target prioritization and lead identification[J]. Drug Discovery Today, 2002, 7 （4）：1221-1228.
［8］ Ruckman J, Green LS, Beeson J, et al. 2’-Fluoropyrimidine RNAbased aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor（VEGF165）[J]. J Biol Chem, 1998, 273（32）: 20556-20567.
［9］ Jenison RD, Gill SC, Pardi A, et al. High resolution molecular discrimination by RNA[J]. Science, 1994, 263（5152）：1425-1429.
［10］ Geiger A, Burgstaller P, von der Eltz H, et al. RNA aptamers that bind L-arginine with sub-micromolar dissociation constants and high enantioselectivity[J]. Nucleic Acids Res, 1996, 24（6）: 1029-1036.
［11］ Yang Q, Goldstein IJ, Mei HY. DNA ligands that bind tightly and selectively to cellobiose[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 1998, 95 （10）：5462-5467.
［12］王国庆, 陈兆鹏, 陈令新. 基于核酸适配体和纳米粒子的光学探针[J]. 化学进展, 2010, 22（2/3）：489-499.
［13］刘涛, 缪有盼, 吴可柱, 等. 核酸适配体类抗 HIV-1 药物的研究进展[J]. 药学进展, 2009, 33（1）：1-6.
［14］ Lee D, Mcclain WH. Aptamer redesigned tRNA is nonfunctional and degraded in cells. RNA, 2004, 10（1）：7-11.
［15］刘晓静, 刘韧, 顾长国, 等. 核酸适体的研究进展[J]. 生理科学进展, 2004, 35（4）：374-378.
［16］ Drabovich AP, Berezovski M, Okhonin V, et al. Selection of smart aptamers by methods of kinetic capillary electrophoresis[J].
Anal Chem, 2006, 78（9）：3171-3178.
［17］ Proske D, Blank M, Buhmann R, et al. Aptamers-basic research, drug development, and clinical applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69（4）：367-374.
［18］王丽, 贺江, 王耘, 等. 适体 SELEX 筛选中单链 DNA 的制备[J]. 江苏农业学报, 2011, 4 ：1133-1136.
［19］王巍, 贾凌云. 适配体筛选方法研究进展[J]. 分析化学, 2009, 37（3）：454-460.
［20］雷兆静, 张存政, 刘媛, 等. SELEX 技术筛选毒死蜱单链 DNA 适体[J]. 江苏农业学报, 2012, 28（1）：198-203.
［21］谢琳, 刘韧, 朱旭东, 等. 人重组TGF-β R Ⅱ亲和核酸筛选方法的建立[J]. 第三军医大学学报, 2008, 30（23）：2168- 2171.
［22］张焜和, 邬芳玉, 张贝, 等. SELEX 筛选AFP-L3 核酸适配子方法的建立［C］. 中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（下册）, 2007.
［23］ Smith D, Kirschenheuter GP, Charltonl J, et al. Selection of RNAbased irreversible inhibitors of human neutrophil elastase[J].
Chem Biol, 1995, 2（11）：741-750.
［24］ Vianini E, Palumbo M, Gatto B. In vitro selection of DNA aptamers that bind L-tyrosinamide[J]. Bioorgan Med Chem, 2001, 9（10）: 2543-2548.
［25］ Wang LF, Liu BR, Yin HT, et al. Selection of DNA aptamer that specific binding human carcinoembryonic antigen in vitro[J].
Journal of Nanjing Medical University, 2007, 21（5）：277-281.
［26］郭磊. SELEX 技术及寡核苷酸适配体的近期研究进展[J].
国际药学研究杂志, 2010, 37（4）：249-256.
［27］ Mosing RK, Mendonsa SD, Bowser MT. Capillary electrophoresis- SELEX selection of aptamers with affinity for HIV-1 reverse transcriptase[J]. Anal Chem, 2005, 77（19）：6107-6112.
［28］ Mendonsa SD, Bowser MT. In vitro selection of aptamers with affinity for neuropeptide Y using capillary electrophoresis[J]. J Am Chem Soc, 2005, 127（26）：9382-9383.
［29］ Mendonsa SD, Bowser MT. In vitro selection of high-affinity DNA ligands for human IgE using capillary electrophoresis[J]. Anal Chem, 2004, 76（18）：5387-5392.
［30］ Berezovski M, Drabovich A, Krylova SM, et al. Nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures ：a universal tool for development of aptamers[J]. J Am Chem Soc, 2005, 127（9）: 3165-3171.
［31］ Misono TS, Kumar PKR. Selection of RNA aptamers against human influenza virus hemagglutinin using surface plasmon resonance[J]. Anal Biochem, 2005, 342（2）：312-317.
［32］ Davis JH, Szostak JW. Isolation of high-affinity GTP aptamers from partially structured RNA libraries[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2002, 99（18）：11616-11621.
［33］ Tsai RYL, Reed RR. Identification of DNA recognition sequences and protein interaction domains of the multiple-Zn-finger protein Roaz[J]. Mol Cell Biol, 1998, 18（11）：6447-6456.
［34］ He J, Liu Y, Fan MT, et al. Isolation and identification of the DNA aptamer target to acetamiprid[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59 （5）：1582-1586.
［35］ Wang L, Liu XJ, Zhang Q, et al. Selection of DNA aptamers that bind to four organophosphorus pesticides[J]. Biotechnol Lett, 2012, 34（5）：869-874.
［36］ Nutiu R, Li YF. In vitro selection of structure-switching signaling aptamers[J]. Angew Chem, 2005, 117 ：1085-1089.
［37］王耘, 贺江, 王丽, 等. 氨基甲酸酯类农药适体筛选技术的建立[J]. 南京农业大学学报, 2011, 34（3）：131-134.
［38］ Kim YS, Niazi JH, Gu MB. Specific detection of oxytetracycline using DNA aptamer-immobilized interdigitated array electrode chip[J]. Anal Chim Acta, 2009, 634（2）：250-254.
［39］ de-los-Santos-álvarez N, Lobo-Casta?ón MJ. SPR sensing of small molecules with modified RNA aptamers ：Detection of neomycin B[J]. Biosens Bioelectron, 2009, 24（8）：2547-2553.
［40］吴艳, 张娟琨, 范婷, 等. 核酸适体生物传感器快速检测牛奶中抗生素[J]. 生物加工过程, 2010, 8（3）：48-52.
［41］周翠松, 江雅新, 汪俊, 等. 信号核酸识体用于药物托普霉素的高灵敏度检测[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27（5）: 826-829.
［42］ Burke DH, Hoffman DC, Brown A, et al. RNA aptamers to the peptidyl transferase inhibitor chloramphenicol[J]. Chem Biol, 1997, 4（11）：833-843.
［43］ Lato SM, Boles AR, Ellington AD. In vitro selection of RNA lectins ：using combinatorial chemistry to interpret ribozyme evolution[J]. Chem Biol, 1995, 2（5）：291-303.
［44］ Kwon M, Chun SM, Jeong S. In vitro selection of RNA against kanamycin B[J]. Mol Cells, 2001, 11（3）：303-311.
［45］ Wang Y, Rando RR. Specific binding of aminoglycoside antibiotics to RNA[J]. Chem Biol, 1995, 2（5）：281-290.
［46］ Windbichler N, Schroeder R. Isolation of specific RNA-binding proteins using the streptomycin-binding RNA aptamer[J]. Nat Protoc, 2006, 1 ：637-640.
［47］范婷, 张娟琨, 李敏, 等. 适配子生物传感器对青霉素的快速检测[J]. 生物加工过程, 2011, 9（3）：41-46.
［48］高淑丽, 徐慧, 鞠婧, 等. 基于荧光探针噻唑橙与核酸适体构象变化的钾离子检测[J]. 分析测试学报, 2011, 30（2）: 115-120.
［49］曾燕丽, 兰小鹏. 适体酶的筛选及应用[J]. 生物技术通讯, 2007, 118（5）：866-868.
［50］ Xiao Y, Rowe AA, Plaxco KW. Electrochemical detection of partsper- billion lead via an electrode-bound DNAzyme assembly[J].
J Am Chem Soc, 2007, 129（2）：262-263.
［51］ Li D, Wieckowska A, Willner I. Optical analysis of Hg2+ ions by oligonucleotide-gold-nanoparticle hybrids and DNA-based machines[J]. Angew Chem, 2008, 120（21）：3991-3995.
［52］ Lee JH, Wang ZD, Liu JW, et al. Highly sensitive and selective colorimetric sensors for uranyl（UO2 2+）：development and comparison of labeled and label-free DNAzyme-gold nanoparticle systems[J]. J Am Chem Soc, 2008, 130（43）：14217-14226.
［53］蒋治良, 张轶, 覃惠敏, 等. 适配体修饰金硒纳米合金共振散射光谱法检测痕量Hg2+[J]. 光谱学与光谱分析, 2011, 31（5）: 1371-1374.
［54］ Wrzesinski J, Ciesiolka J. Characterization of structure and metal ions specificity of Co2+-binding RNA aptamers[J]. Biochemistry, 2005, 44（16）：6257-6268.
［55］ Cuenoud B, Szostak JW. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity[J]. Nature, 1995, 375 ：611-614.
［56］ Li J, Zheng W, Kwon AH, et al. In vitro selection and characterization of a highly efficient Zn（II）-dependent RNA-cleaving deoxyribozyme[J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28（2）：481-488.
［57］ Hofmann HP, Limmer S, Hornung V, et al. Ni2+-binding RNA motifs with an asymmetric purine-rich internal loop and a GA base pair[J]. RNA, 1997, 3（11）：1289-1300.
［58］ Carlson MA, Bargeron CB, Benson RC, et al. An automated, hand held biosensor for aflatoxin[J]. Biosens Bioelectron, 2000, 14 （10-11）：841-848.
［59］段诺, 吴世嘉, 王周平. 核酸适配体识别荧光法检测赭曲霉素 A[J]. 分析化学, 2011, 39（3）：300-304.
［60］ Cruz-Aguado JA, Penner G. Determination of ochratoxin A with a DNA aptamer[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56（22）：10456- 10461.
［61］ Nakamura C, Kobayashi T, Miyake M, et al. Usage of a DNA aptamer as a Ligand targeting microcystin[J]. Mol Cryst Liq Cryst Sci Technol, Sect A, 2001, 371（1）：369-374.
［62］ Torres-Chavolla E, Alocilja EC. Aptasensors for detection of microbial and viral pathogens[J]. Biosens Bioelectron, 2009, 24 （11）：3175-3182.
［63］文晓棠, 李华, 邓乐. 适配体传感器在微生物检测中的应用[J]. 生命科学研究, 2011, 15（5）：455-459.
［64］王一娴, 叶尊忠, 斯城燕, 等. 适配体生物传感器在病原微生物检测中的应用[J]. 分析化学, 2012, 40（4）：634-642.
［65］ Vivekananda J, Kiel JL. Anti-Francisella tularensis DNA aptamers detect tularemia antigen from different subspecies by aptamerlinked immobilized sorbent assay[J]. Lab Invest, 2006, 86 : 610-618.
［66］ Bruno JG, Phillips T, Carrillo MP, et al. Plastic-adherent DNA aptamer-magnetic bead and quantum dot sandwich assay for Campylobacter detection[J]. J Fluoresc, 2009, 19（3）：427- 435.
［67］ Zelada-Guille?n GA, Bhosale SV, Riu J, et al. Real-time potentiometric detection of bacteria in complex samples[J]. Anal Chem, 2010, 82（22）：9254-9260.
［68］ Zelada-Guille?n GA, Riu J, Düzgün A, et al. Immediate detection of living bacteria at ultralow concentrations using a carbon nanotube based potentiometric aptasensor[J]. Angew Chem, 2009, 48（40）: 7334-7337.
［69］吴文鹤, 陈勇, 蒋璐茜, 等. 肠致病性大肠埃希菌比色检测的适配体生物传感器研究[J]. 中华检验医学杂志, 2010, 33（7）: 587-593.
［70］ Yang L, Li Y, Erl GF. Interdigitated array microelectrode-based electrochemical impedance immunosensor for detection of Escherichia coli O157 ：H7[J]. Anal Chem, 2004, 76（4）：1107-1113.
［71］ Ohk SH, Koo OK, Sen T, et al. Antibody-aptamer functionalized fibre-optic biosensor for specific detection of Listeria monocytogenes from food[J]. J Appl Microbiol, 2010, 109（3）：808-817.
［72］ Joshi R, Janagama H, Dwivedi HP, et al. Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars[J]. Mol Cell Probe, 2009, 23（1）: 20-28.
［73］ Wu ZS, Hu P, Zhou H, et al. Fluorescent oligonucleotide probe based on G-quadruplex scaffold for signal-on ultrasensitive protein assay[J]. Biomaterials, 2010, 31（7）：1918-1924.
［74］ Jiang YX, Fang XH, Bai CL. Signaling Aptamer/protein binding by a molecular light switch complex[J]. Anal Chem, 2004, 76（17）: 5230-5235.
［75］ Maehashi K, Katsura T, Kerman K, et al. Label-free protein biosensor based on aptamer-modified carbon nanotube field-effect transistors[J]. Anal Chem, 2007, 79（2）：782-787.
［76］ McCauley TG, Hamaguchi N, Stanton M. Aptamer-Based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules [J]. Anal Biochem, 2003, 319（2）：244-250.
［77］ Ahn DG, Jeon IJ, Kim JD, et al. RNA aptamer-based sensitive detection of SARS coronavirus nucleocapsid protein[J]. Analyst, 2009, 134 ：1896-1901.

[1]	李怡君, 吴晨晨, 李睿, 王喆, 何山文, 韦善君, 张晓霞. 水稻内生细菌新资源分离培养方案探究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 201-211.
[2]	王智博, 王道平, 苗兰, 李瑛, 潘映红, 刘建勋. 血液样本蛋白质组分析方法的比较研究[J]. 生物技术通报, 2021, 37(8): 307-318.
[3]	潘志文, 陈伟庭, 高洁儿, 周峰, 姚涓, 王声斌, 姜大刚. 转基因番木瓜基因组DNA的快速制备和PCR检测方法[J]. 生物技术通报, 2021, 37(6): 286-294.
[4]	牟永莹, 王道平, 陈明, 邱丽娟, 潘映红. 大豆种子蛋白质组样品制备与数据分析方法[J]. 生物技术通报, 2020, 36(12): 247-255.
[5]	王蒙, 李澜鹏, 张全, 彭绍忠, 曹长海. 生物法制备甲壳素/壳聚糖的研究进展[J]. 生物技术通报, 2019, 35(4): 213-222.
[6]	赵小强, 陈志荣, 何芳, 沈楠, 高峰, 黄家风. 大丽轮枝菌原生质体的制备及再生[J]. 生物技术通报, 2018, 34(7): 166-173.
[7]	王伟伟, 肖燕, 张艺夕, 刘晶, 唐唯, 李灿辉. 马铃薯晚疫病菌原生质体制备及再生体系的研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(4): 77-82.
[8]	尹思远,白佳珂,李锂,马小来. 食神鞘氨醇杆菌（Sphingo spiritivorum）肝素酶的制备和性质研究[J]. 生物技术通报, 2017, 33(9): 244-251.
[9]	林艳梅, 李瑞杰, 张慧杰, 秦秀林, 冯家勋. 纤维素酶高产菌株Trichoderma atroviride HP35-3原生质体制备及转化[J]. 生物技术通报, 2016, 32(9): 225-231.
[10]	靳亮, 许翠萍, 王金昌, 关丽梅, 张稳超, 黄朝, 高学梅, 王洪秀. 马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位[J]. 生物技术通报, 2016, 32(11): 208-214.
[11]	杨国翠, 崔峥, 邱高峰. 中华绒螯蟹性腺特异表达蛋白EsSOX21b-like的原核表达与抗体制备[J]. 生物技术通报, 2015, 31(6): 189-194.
[12]	呼吉雅, 卢萍, 牛艳芳. 小花棘豆Embellisia内生真菌原生质体的制备与再生研究[J]. 生物技术通报, 2015, 31(5): 134-139.
[13]	姜超,张学文,潘映红. 蛋白质胶内酶切技术研究进展[J]. 生物技术通报, 2015, 31(1): 61-66.
[14]	周莹,袁孟娟,韩军,陈芳. 丹参根腐病生防芽孢杆菌2-1海藻菌剂的研制[J]. 生物技术通报, 2015, 31(1): 167-172.
[15]	乔广军,张保奎,杨荣,焦毅,季大林. 紫杉醇脂质体制备方法优化比较[J]. 生物技术通报, 2014, 0(9): 45-50.