采用正交设计法优化梨SSR-PCR体系

生物技术通报 ›› 2013, Vol. 0 ›› Issue (5): 111-115.

采用正交设计法优化梨SSR-PCR体系

毕红园^{1, 2}, 王长彪², 段永红³, 郭黄萍⁴, 孙毅^{2, 5}

(1.山西大学生物工程学院，太原 030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031；3.山西农业大学农学院，太谷 030801；4.山西农科院果树研究所，太谷 030815；5.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，太原 030031)

收稿日期:2012-01-10 修回日期:2013-05-24 出版日期:2013-05-24 发布日期:2013-05-24
作者简介:毕红园，女，硕士研究生，研究方向：作物遗传育种；E-mail：543876529@qq.com
基金资助:
国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08003-017B)，山西省财政支农项目基金项目(2011NYGX-05)

Establishment and Optimization of the Pear SSR System of by Orthogonal Design

Bi Hongyuan^{1, 2}, Wang Changbiao², Duan Yonghong³, Guo Huangping⁴, Sun Yi^{2, 5}

(1. Biological Engineering Institute，Shanxi University，Taiyuan 030006；2. Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031；3. College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801；4. Pomology Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taigu 030815；5. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of  Agriculture，P.R.China，Taiyuan 030031)

Received:2012-01-10 Revised:2013-05-24 Published:2013-05-24 Online:2013-05-24
About author: 孙毅，男，博士，研究方向：植物基因工程和分子生物学; E-mail：sunyi692003@yahoo.com.cn

摘要/Abstract

摘要： 为了建立适宜梨树SSR-PCR的反应体系和扩增程序，采用正交设计L₁₆(4⁵)对影响梨树SSR-PCR反应体系的5个因素(Taq 酶、Mg²+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化，PCR结果用DPS数据处理软件分析，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了适用于梨树的SSR反应体系。在10 μL的反应体系中，模板DNA的用量为50.0 ng，Taq DNA 聚合酶的用量为1.4 U，Mg²+的浓度为2.0 mmol/L，dNTPs浓度为0.1 mmol/L，引物的浓度为0.5 μmol/L。扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，57℃(依引物不同而改变)退火45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min。4℃保存。选用24个梨品种对该体系进行稳定性验证，结果证明该体系可用于梨树SSR 标记的研究。

关键词: 梨, SSR, 正交设计, PCR

Abstract: In order to establish and optimize the SSR-PCR amplification system for pear total DNA, an orthogonal design experiment of 5 elements (Taq enzyme, Mg²⁺, template DNA, dNTP, primers)with 4 levels L₁₆(4⁵) was conducted. The PCR result was analyzed by the software DPS to select the best levels of responsive factors and established the optimal SSR reaction system. The optimal SSR-PCR system of 10 μL volumes consists of template DNA 30.0 ng, Taq DNA polymerase 1.0 U, each primer 0.2 μmol/L, Mg²⁺ 2.0 mmol/L, and dNTPs 0.4 mmol/L. PCR amplification procedures was：pre-denaturation for 4 min at 94℃, followed by 30 cycles of denaturation for 45 s at 94℃, anneal for 30 s at 48℃, extension for 30 s at 72℃, the amplification was completed after extension for 10 min at 72℃, then stored at 4℃. Total DNA of 24 pear varieties was tested to amplify SSR markers, which verified the robustness of the system.

Key words: Pear, SSR, Orthogonal design, PCR

毕红园, 王长彪, 段永红, 郭黄萍, 孙毅. 采用正交设计法优化梨SSR-PCR体系[J]. 生物技术通报, 2013, 0(5): 111-115.

Bi Hongyuan, Wang Changbiao, Duan Yonghong, Guo Huangping⁴, Sun Yi. Establishment and Optimization of the Pear SSR System of by Orthogonal Design[J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 0(5): 111-115.

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(责任编辑李楠)