基因组DNA去甲基化法改良蛹虫草菌株高产虫草素及性状稳定性评价

生物技术通报 ›› 2016, Vol. 32 ›› Issue (12): 47-52.

基因组DNA去甲基化法改良蛹虫草菌株高产虫草素及性状稳定性评价

朱巍巍¹，²,李莉²,陈飞²,李杨²,王艳华²,包永明¹

1. 大连理工大学生命科学与技术学院，大连 116024；
2. 辽宁省微生物科学研究院，朝阳 122000

收稿日期:2016-04-11 出版日期:2016-12-25 发布日期:2016-12-07
作者简介:朱巍巍，男，博士研究生，研究方向：食用菌育种及标准化栽培；E-mail：zhuweiwei@vip.163.com
基金资助:
辽宁省农业公关及产业化项目（2015209002），辽宁省农业领域重点培养青年人才项目（2014034）

Enhanced Cordycepin Production of Cordyceps militaris by Genomic DNA Demethylation and the Evaluation of Its Stability

ZHU Wei-wei¹，²,LI Li²,CHEN Fei²,LI Yang²,WANG Yan-hua²,BAO Yong-ming¹

1. School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024；
2. Liaoning Research Institute of Microbiology，Chaoyang 122000

Received:2016-04-11 Published:2016-12-25 Online:2016-12-07

摘要/Abstract

摘要：

基因组DNA去甲基化能够激活沉默基因，改变次级代谢产物谱，是一种全新的菌种改良途径。利用不同浓度的DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-azaC）处理蛹虫草菌株CM-L1，降低基因组DNA甲基化水平，高效液相色谱筛检得到改良株LB-C3和LD-A7，菌丝体中虫草素含量分别提升127%和144.3%。LD-A7不能形成子实体，推测与关键的DNA甲基化修饰作用被改变有关。经5次继代培养后，以虫草素含量为指标考察性状稳定性。随传代次数增加，基因组中甲基化的DNA含量增加，液体发酵菌丝体中的虫草素含量均显著降低，但是子实体中虫草素含量非常稳定，改良的菌株更适合栽培生产而非工业发酵。

关键词: DNA去甲基化, 5-氮杂胞苷, 蛹虫草, 虫草素

Abstract:

Genomic DNA demethylation may activate silenced gene，which alters secondary metabolite spectrum，and therefore it is a completely novel approach for strain improvement. Using different concentrations of DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidine（5-azaC）to treat the Cordyceps militaris CM-L1，then the genomic DNA methylation level reduced. Further，the improved strains LB-C3 and LD-A7 were acquired by screening with high performance liquid chromatography，and in which the contents of cordycepin in mycelium increased by 127% and 144.3% respectively. LD-A7 could not form a fruiting body，which was speculated to be related to the role of DNA methylation changed. The stability was investigated after 5 times subculture using the content of cordycepin as an indicator. With the subculture times increased，the methylated DNA in the genome increased，and the cordycepin in mycelium of liquid fermentation significantly decreased；however，the content of cordycepin in fruiting bodies was very stable，indicating that improved strains were better suited to the cultivation rather than production in industrial fermentation.

Key words: DNA demethylation, 5-azaC, Cordyceps militaris, Cordycepin

中图分类号:

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.009

朱巍巍，李莉,陈飞,李杨,王艳华,包永明. 基因组DNA去甲基化法改良蛹虫草菌株高产虫草素及性状稳定性评价[J]. 生物技术通报, 2016, 32(12): 47-52.

ZHU Wei-wei，LI Li,CHEN Fei,LI Yang,WANG Yan-hua,BAO Yong-ming. Enhanced Cordycepin Production of Cordyceps militaris by Genomic DNA Demethylation and the Evaluation of Its Stability[J]. Biotechnology Bulletin, 2016, 32(12): 47-52.

参考文献

[1] 黄年来, 林志彬, 陈国良, 等. 中国食药用菌学[M] . 上海：上海科学技术文献出版社, 2010：1763.
[2] 王志兵, 张洪玉, 刘洋, 等. 基质固相分散-高效液相色谱法同时测定冬虫夏草和蛹虫草中的9种核苷及碱基[J] . 食品工业科技, 2014, 35（4）：83-87.
[3] 王晓彤, 孙淑军, 房军伟. 简述蛹虫草与冬虫夏草异同[J] . 辽宁中医药大学学报, 2014（4）：165-169.
[4] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 卫生部关于批准蛹虫草为新资源食品的公告（2009年第3号）[Z/OL] . http://www.moh.gov.cn/zhuzhan/gonggao/201304/e44ed1e230a244528faf8181fc5c0b1c.shtml, 2009-03-18.
[5] 刘桂君, 周思静, 杨素玲, 等. 蛹虫草中虫草素的研究进展[J] . 食品科学, 2013, 34（21）：408-413.
[6] Kaczka EA, Trenner NR, Arison B, et al. Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’-deoxyadenosine[J] . Biochemical and Biophysical Research Communications, 1964, 14：456-457.
[7] 曾宏彬, 宋斌, 李泰辉. 蛹虫草研究进展及其产业化前景[J] . 食用菌学报, 2011, 18（2）：70-74.
[8] Zhu SJ, Pan J, Zhao B, et al. Comparisons on enhancing the immunity of fresh and dry Cordyceps militaris in vivo and in vitro[J] . Journal of Ethnopharmacology, 2013, 149（3）：713-719.
[9] 杨涛, 董彩虹. 虫草素的研究开发现状与思考[J] . 菌物学报, 2011, 30（2）：180-190.
[10] Das SK, Masuda M, Hatashita M, et al. A new approach for improving cordycepin productivity in surface liquid culture of Cordyceps militaris using high-energy ion beam irradiation[J] . Letters in Applied Microbiology, 2009, 47（6）：534-538.
[11] 孟泽彬, 文庭池, 康冀川, 等. 蛹虫草高产胞外虫草素和虫草多糖的诱变育种[J] . 中国酿造, 2012, 31（7）：57-61.
[12] 周洪英, 边银丙. 蛹虫草虫草素高产原生质体融合子鉴定与筛选[J] . 食用菌学报, 2007, 14（2）：65-70.
[13] 赵文婷, 邹懿, 胡昌华. 微生物菌种改良的新方法新策略[J] . 生物工程学报, 2009, 25（6）：801-805.
[14] Williams RB, Henrikson JC, Hoover AR, et al. Epigenetic remodeling of the fungal secondary metabolome. [J] . Organic & Biomolecular Chemistry, 2008, 6（11）：1895-1897.
[15] 朱巍巍, 李莉, 池景良, 等. 一种大型真菌去甲基化育种方法及装置：中国, ZL 2013 1 0377815. 7[P] . 2015-04-01.
[16] 黄丽俊, 李利东, 宓晓黎. 高效液相色谱法同时检测虫草制品中腺苷和虫草素含量的研究[J] . 农学学报, 2015（5）：25-28.
[17] 罗巍, 刘东波, 吴郑武, 等. 蛹虫草液态发酵过程中有效成分的动态积累变化[J] . 食品与发酵工业, 2011, 37（10）：96-99.
[18] 王瑞娴, 徐建红. 基因组DNA甲基化及组蛋白甲基化[J] . 遗传, 2014, 36（3）：191-199.
[19] 徐青, 余云舟, 赵萌, 等. DNA甲基化在动植物遗传育种中的研究进展[J] . 生物技术通讯, 2011, 22（1）：113-117.
[20] Zhang TY, Meaney MJ. Epigenetics and the environmental regulation of the genome and its function[J] . Annual Review of Psychology, 2010, 61（1）：439-466.