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筛选dbat启动子顺式元件结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

姚瑞枫;张蒙;张鹏;李书涛;陈丽;付春华;余龙江;   

  1. 华中科技大学生命科学与技术学院;
  • 出版日期:2009-09-26 发布日期:2009-09-26
  • 基金资助:
    国家自然科学基金面上项目(NSFC20776058);; 2006年教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-06-0646);; 国家大学生创新性实验计划项目(2008055)

  • Published:2009-09-26 Online:2009-09-26

摘要: 旨在构建酵母单杂交文库用于筛选与dbat基因启动子顺式元件结合的转录因子。首先,分离dbat启动子上的顺式作用元件,并进行3个拷贝的重复后,和报告质粒pHis 2.1连接构建诱饵载体pHis 2.1-dp3。然后,从茉莉酸甲酯诱导的红豆杉细胞中提取总RNA,以纯化出的mRNA为模板,依次完成ss cDNA和ds cDNA的合成,并将纯化的ds cDNA、线性化载体pGADT7-Rec2和诱饵载体pHis 2.1-dp3共转化酵母细胞Y187,各取100μl分别涂布于SD/-leu和SD/-leu/-trp平板,用于计算重组效率和转化效率,剩余转化液涂布于SD/-leu/-trp/-his/20 mM3-AT平板,用于筛选阳性克隆。结果表明,重组效率为1.49×106CFU/μg,共转化效率为1.93×105CFU/μg;对阳性克隆质粒进行酶切、测序分析,得到6个可编码结合蛋白的基因。以上工作为筛选调控紫杉醇合成关键酶基因dbat表达的转录因子奠定了基础。

关键词: 红豆杉细胞, dbat基因, 酵母单杂交文库, 结合蛋白, 转录调控