GST-Smad4 融合蛋白的表达与纯化

生物技术通报 ›› 2013, Vol. 0 ›› Issue (1): 134-138.

GST-Smad4 融合蛋白的表达与纯化

梅竹 ,杨予涛,徐志卿

首都医科大学基础医学院，北京 100069

收稿日期:2012-07-12 修回日期:2013-01-31 出版日期:2013-01-30 发布日期:2013-01-30
作者简介:梅竹，女，硕士研究生，研究方向：神经生物学；E-mail: paganinihermione@126.com
基金资助:
国家“973”计划项目( 2010CB912003)，高等学校博士学科点专项科研基金项目（20101107120015），北京市属高等学校人才强教深化计划中青年骨干人才资助项目（PHR20110895），北京市优秀人才培养资助项目（2010D005018000010）

Prokaryotic Expression and Purification of GST-Smad4 Protein

Mei Zhu, Yang Yutao, Xu Zhiqing

School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069

Received:2012-07-12 Revised:2013-01-31 Published:2013-01-30 Online:2013-01-30

摘要/Abstract

摘要： 旨在原核表达Smad4 基因，纯化获得GST-Smad4 融合蛋白。以人表皮HaCaT 细胞的cDNA 为模板，利用PCR 扩增含有BamH I 和Sal I 酶切位点的Smad4 基因；然后将其克隆到pGEX-4T-1 原核表达载体中，将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21（DE3）；用IPTG 诱导表达，再利用MagneGST particles 亲和纯化GST-Smad4 融合蛋白；最后通过Western blot 鉴定此融合蛋白。结果显示，成功构建pGEX-4T-1-Smad4 原核表达载体；30℃条件下，0.2 mmol/L 的IPTG 能诱导出大量的可溶性GST-Smad4 蛋白；经MagneGST particles 纯化的GST-Smad4 蛋白可被Smad4 的抗体特异识别。纯化的GST-Smad4 蛋白可用于后续的生物学研究。

关键词: Smad4 , 原核表达 , 蛋白纯化

Abstract: It was to express human Smad4 gene in prokaryotic cells and purify the GST-Smad4 fusion protein. The full-length Smad4 genewas amplified by PCR and cloned into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1. The recombinant plasmid pGEX-4T-1-Smad4 was transformedinto E.coli BL21(DE3)and exogenous protein was induced by IPTG. After purification using MagneGST particles, the GST-Smad4 fusionprotein was further identified by Western blot. Results showed that the recombinant plasmid pGEX-4T-1-Smad4 was constructed successfully.When BL21(DE3)cells transformed with pGEX-4T-1-Smad4 were cultured at 30℃ and induced with 0.2 mmol/L IPTG, GST-Smad4 proteinwas obtained in a large quantity in supernatant. The purified GST-Smad4 was further identified specifically by Smad4 antibody. Therefore, itproved that GST-Smad4 fusion protein was successfully expressed and purified, and could be used for further study of the function of Smad4.

Key words: Smad4 , Prokaryotic expression , Protein purification

梅竹, 杨予涛, 徐志卿. GST-Smad4 融合蛋白的表达与纯化[J]. 生物技术通报, 2013, 0(1): 134-138.

Mei Zhu, Yang Yutao, Xu Zhiqing. Prokaryotic Expression and Purification of GST-Smad4 Protein[J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 0(1): 134-138.

参考文献

[1] Liu F, Pouponnot C, Massague J. Dual role of the Smad4/DPC4 tumorsuppressor in TGFβ-inducible transcriptional complex[J]. GenesDev, 1997, 11（23）：3157-3167.
[2] Elliott RL, Blobe GC. Role of transforming growth factor β in humancancer[J]. Journal of Clinical Oncology, 2005, 23（9）：2078-2093.
[3] Shi Y, Massagué J. Mechanisms of TGF-β signaling from cellmembrane to the nucleus[J]. Cell, 2003, 113（6）：685-700.
[4] Ikushima HK. Miyazono K. TGF-β singalling ：a complex web incancer progression[J]. Nature Reviews Cancer, 2010, 10（6）：415-424.
[5] Heldin CH, Landstr?m M, Moustakas A. Mechanism of TGF-betasignaling to growth arrest, apoptosis, and epithelial-mesenchymaltransition[J]. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21（2）：166-176.
[6] Lee DK, Park SH, Yi Y, et al. The hepatitis B virus encodedoncoprotein pX amplifies TGF-beta family signaling through directinteraction with Smad4 ：potential mechanism of hepatitis B virusinducedliver fibrosi[J]. Genes Dev, 2001, 15（4）：455-466.
[7] Rozenblum E, Weinstein CL, Fischer A, et al. DPC4, a candidatetumor suppressor gene at human chromosome18q21.1[J]. Science,1996, 271（5247）：350-353.
[8] Yang G, Yang X. Smad4-mediated TGF-β signaling in tumorigenesis[J]. Int J Biol Sci, 2010, 6（1）：1-8.
[9] Hu J, Zhang YQ, Liu XP, et al. Expression and localization ofSmad1, Smad2 and Smad4 proteins in rat testis during post nataldevelopment[J]. Asian J Androl, 2003, 5（1）：51-55.
[10] Fernandes M, Antoine M, Hébert JM. SMAD4 is essential for generatingsubtypes of neurons during cerebellar development[J].Dev Biol, 2012, 365（1）：82-90.
[11] Moskowitz IP, Wang J, Peterson MA, et al. Transcription factor genesSmad4 and Gata4 cooperatively regulate cardiac valve development[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108（10）：4006-4011.
[12] Chu GC, Dunn NR, Anderson DC, et al. Differential requirementsfor Smad4 in TGFbeta-dependent patterning of the early mouseembryo[J]. Development, 2004, 131（15）：3501-3512.
[13] Wang DG, Long JY, Dai FY, et al. BCL6 represses Smad signalingin transforming growth factor-beta resistance[J]. Cancer Res,2008, 68（3）：783-789.
[14] Erickson RA, Liu X. Association of v-ErbA with Smad4 disruptsTGF-beta signaling[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20（5）：1509-1519.

[1]	梅欢, 李玥, 刘可蒙, 刘吉华. 小檗碱桥酶高效原核表达及生物合成l-SLR的研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 277-287.
[2]	索青青, 吴楠, 杨慧, 李莉, 王锡锋. 水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的原核表达、抗体制备和应用[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 135-141.
[3]	覃雪晶, 王雨涵, 曹一博, 张凌云. 青杄PwHAP5基因原核表达及多克隆抗体制备[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 142-149.
[4]	王光丽, 范婵, 王辉, 卢惠芳, 夏灵尹, 黄健, 闵迅. 霍乱弧菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定[J]. 生物技术通报, 2022, 38(7): 269-277.
[5]	汪巧菊, 胡雨萌, 温亚亚, 宋丽, 孟闯, 潘志明, 焦新安. 新型冠状病毒S1蛋白的表达及活性鉴定[J]. 生物技术通报, 2022, 38(3): 157-163.
[6]	沈俊强, 张莉萍, 于瑞明, 王永录, 潘丽, 刘霞, 刘新生. 猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 生物技术通报, 2022, 38(10): 243-253.
[7]	山草梅, 叶蕾, 张连虎, 况卫刚, 孙晓棠, 马建, 崔汝强. 水稻抗潜根线虫基因OsRAI1的克隆及功能分析[J]. 生物技术通报, 2021, 37(7): 146-155.
[8]	曾福源, 苏泽辉, 周诗慧, 谢妙, 庞欢瑛. 溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 84-91.
[9]	张西西, 张怡青, 李玉林, 韩笑, 王国强, 王晓军, 王旭东, 王云龙. 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白C端重组蛋白的原核表达、纯化及应用[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 92-97.
[10]	白福美, 李至敏, 王小琴, 胡紫微, 鲍玲玲, 李志敏. 集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 98-107.
[11]	瞿欢, 李成, 陈汭, 廖艺杰, 曹三杰, 文翼平, 颜其贵, 黄小波. 猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 273-280.
[12]	彭利忠, 张鹏, 周雯雯, 曾旭辉, 张小宁. 精子特异性蛋白Cabs1多克隆抗体的制备及多用途验证[J]. 生物技术通报, 2021, 37(3): 261-270.
[13]	贺扬, 余巧玲, 王均, 覃川杰, 李华涛. 罗非鱼原核表达基因研究进展[J]. 生物技术通报, 2021, 37(2): 195-202.
[14]	唐禄, 董丽平, 尹茉莉, 刘磊, 董媛, 王会岩. 成纤维细胞生长因子20单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 生物技术通报, 2021, 37(10): 179-185.
[15]	段应策, 胡姿仪, 杨帆, 李金涛, 邬向丽, 张瑞颖. 香菇草酰乙酸水解酶基因LeOAH1克隆及表达分析[J]. 生物技术通报, 2020, 36(9): 227-234.