PDGF-GAL 真核表达载体的构建及细胞表达

生物技术通报 ›› 2013, Vol. 0 ›› Issue (2): 124-129.

PDGF-GAL 真核表达载体的构建及细胞表达

荣曼张锐虎刘田福

（山西医科大学实验动物中心，太原 030001）

收稿日期:2012-08-02 修回日期:2013-02-27 出版日期:2013-02-26 发布日期:2013-02-27
作者简介:刘田福，男，教授，研究方向：人类疾病动物模型；E-mail ：ykdltf@yahoo.com.cn
基金资助:
荣曼，女，硕士，研究方向：人类疾病动物模型；E-mail ：834182410@qq.com

Construction of GAL’s Eukaryotic Expression Vector and Targeting Expression of GAL in N-2a Cells

Rong Man Zhang Ruihu Liu Tianfu

（Laboratory Animal Center of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001）

Received:2012-08-02 Revised:2013-02-27 Published:2013-02-26 Online:2013-02-27

摘要/Abstract

摘要： 旨在构建真核表达载体pcDNA-PDGF-GAL，观察重组质粒转染N-2a 细胞后甘丙肽基因（galanin，GAL）的表达水平。采用PCR 方法，以重组质粒pUC18-PDGF-GAL 为模板，扩增PDGF-GAL 基因序列，最终定向克隆入载体pcDNA3.1 并替换该载体的CMV 启动子与增强子序列，从而构建具有神经细胞特异性的表达载体pcDNA-PDGF-GAL。然后利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠N-2a 细胞，分别在转染后24、48 和72 h 收集细胞及细胞培养物，采用RT-PCR 和ELISA 方法，鉴定GAL 基因在神经细胞中的过表达。结果显示，经PCR 和DNA 序列测定证实，目的基因已插入表达载体，RT-PCR 和ELISA 证明，脂质体法瞬时转染N-2a 细胞实现GAL 基因的过表达。成功构建pcDNA3.1-PDGF-GAL，实现GAL 基因在N-2a 细胞过表达，从而为制作过表达GAL 的稳转细胞及进一步研究GAL 在神经系统的生物学功能奠定基础。

关键词: GAL, 表达载体, N-2a, 细胞, 转染

Abstract: The study was designed to construct eukaryotic expression vector pcDNA-PDGF-GAL, and observe the specific expression of GAL in N-2a after transferction. Firstly, the 2.9 kb PDGF-GAL fragment was amplified by PCR, then directedly cloned into pcDNA 3.1 vector, replacing the vector’s CMV promoter and enhancer and finally forming the recombinant vector pcDNA-PDGF-GAL which is neuronspecific expressed. Secondly, pcDNA-PDGF-GAL is transient-transfected into N-2a and the expression of GAL protein is detected by RT-PCR and ELISA. Results showed the sequencings result of pcDNA-PDGF-GAL was blasted on NCBI with standard sequence, in which PDGF-GAL fragment has a high nucleotide sequence identity（99%）, and these results suggested that the construction of recombinant plasmid gets success. By RT-PCR and ELISA, it is confirmed that GAL protein is specifically over-expressed in N-2a. The neuron-specific eukaryotic expression vector was successfully constructed, and GAL protein is successfully over-expressed in N-2a, which established a basis for the preparation of stabletransfected cells over-expressing GAL and further exploring the biological functions of GAL on nervous system.

Key words: GAL, Expression vector, N-2a cell, Transfection

荣曼, 张锐虎, 刘田福. PDGF-GAL 真核表达载体的构建及细胞表达[J]. 生物技术通报, 2013, 0(2): 124-129.

Rong Man, Zhang Ruihu, Liu Tianfu . Construction of GAL’s Eukaryotic Expression Vector and Targeting Expression of GAL in N-2a Cells[J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 0(2): 124-129.

参考文献

［1] Kuteeva E, H?kfelt T, ?gren SO. Behavioural characterisation of transgenic mice overexpressing galanin under the PDGF-B promoter［J]. Neuropeptides, 2005, 39(3)：299-304.
[2] 雷小春, 刘田福, 司苏晋, 等. 甘丙肽重构基因GAL(intron II) 的克隆及其过表达转基因载体的构建［J]. 中国比较医学杂志, 2011, 21(1)：48-53.
[3] 程爽, 袁崇刚. 甘丙肽对PC12 细胞和B104 细胞增殖的不同影响［J]. 分子细胞生物学报, 2007, 40(5)：315-322.
[4] Costa A, Bini P, Hamze-Sinno M, et al. Galanin and α-MSH autoantibodies in cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease[J]. Neuroimmunol, 2011, 240-241:114-120.
[5] Yamamoto H, Arai T, Ben S, et al. Expression of galanin and galanin receptor mRNA in skin during the formation of granulation tissue[J]. Endocrine, 2011, 40(3)：400-407.
[6] Chong KWY, Lee AYW, Koay ESC, et al. pH dependent high transfection efficiency of mouse neuroblastomas using TransFectin［J]. Journal of Neuroscience Methods, 2006, 158(1)：56-63.
[7] 马骥. Galanin 在神经细胞发育过程中的作用研究［D]. 上海：华东师范大学, 2008.
[8] Thomas S, Erika P, Francesca G, et al. Dynorphin is expressed primarily by GABAergic neurons that contain galanin in the rat dorsal horn［J]. Mol Pain, 2011, 7(1)：76.
[9] Tremblay RG, Sikorska M, Sandhu JK, et al. Differentiation of mouse Neuro 2A cells into dopamine neurons［J]. Journal of Neuroscience Methods, 2010, 186:60-67.
[10] Lemons LL, Wiley RG. Galanin receptor-expressing dorsal horn neurons：Role in nociception［J]. Neuropeptides, 2011, 45(6)： 377-83.
[11] Kapur J. Galanin receptors modulate seizures［J]. Epilepsy Curr, 2011, 11(4)：125-127.
[12] 杜静. PDGF-CCK 转基因小鼠的建立及CCK 对摄食行为影响 A B A:空质粒pcDNA3.1 瞬时转染N-2a 细胞后72 h ；B:重组质粒pcDNAPDGF β-GAL 瞬时转染N-2a 细胞后72 h 图8 空质粒转染组与GAL 过表达试验组细胞图像(10×) 2013年第2期129 荣曼等：PDGF-GAL 真核表达载体的构建及细胞表达的初步研究［D]. 北京：中国协和医科大学, 2007.
[13] Yoshitake T, Yoshitake S, Savage S, et al. Galanin differentially regulates acetylcholine release in ventral and dorsal hippocampus: a microdialysis study in awake rat［J]. Neuroscience, 2011, 197: 172-180.
[14] 任凯, 丁岩, 崔云燕, 等. 神经特异性启动子PDGF-EGFP 载体的构建及组织表达特异性鉴定［J]. 山东大学学报, 2009, 47(5)：50-53.
[15] 张正达, 周盛年, 刘黎青, 等. 神经细胞特异性真核表达载体 TUBA1a- EGFP 的构建及鉴定［J]. 中国老年学杂志, 2011, 31:1002-1006.
[16] 常洋, 秦川, 琦祖和, 等. APP 基因真核表达载体的构建与鉴定［J]. 中国老年学杂志, 1999, 19(4)：239-241.
[17] 刘毕欧, 孙国勋, 赵明明, 等. Bikunin 的分子克隆及真核分泌型表达载体的构建和表达［J]. 哈尔滨医科大学学报, 2011, 45(3)：210-213.
[18] 张猛, 邓娟, 李静, 等. hVEGF121 基因真核表达载体的构建及其在神经干细胞中的表达［J]. 第三军医大学学报, 2011, 33(1)：36-39.
[19] 吕俊锋, 杜珍武, 张玉成, 等. 人核心蛋白聚糖基因靶向肺癌细胞特异性表达载体的构建及其表达［J]. 中国实验诊断学, 2011, 15(2)：191-194.
[20] Kuteeva E, Calza L, Holmberg K, et al. Distribution of galanin in the brain of a galanin-overexpressing transgenic mouse［J]. Neuropeptides, 2005, 39(3)：293-298.
[21] Pirondi S, D’Intino G, Gusciglio M, et al. Changes in brain cholinergic markers and spatial learning in old galanin-over expressing mice［J]. Brain Res, 2007, 1138:10-20.
[22] 秦怀洲, 张治国, 王举磊, 等. 真核表达载体pcDNA3.1-3a 的构建及其在神经母细胞瘤SK-N-SH 细胞中的表达［J]. 中国临床神经外科杂志, 2011, 16(9)：541-544.

[1]	张坤, 闫畅, 田新朋. 微生物单细胞分离方法研究进展[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 1-11.
[2]	林红妍, 郭晓蕊, 刘迪, 李慧, 陆海. 转录组分析转录因子AtbHLH68调控细胞壁发育的分子机制[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 105-116.
[3]	娄慧, 朱金成, 杨洋, 张薇. 抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 156-167.
[4]	刘浩, 马世杰, 周哲敏, 崔文璟. 杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 281-290.
[5]	陈中元, 王玉红, 代为俊, 张艳敏, 叶倩, 刘旭平, 谭文松, 赵亮. 柠檬酸铁铵对悬浮HEK293细胞转染的影响机制探究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 311-318.
[6]	程亚楠, 张文聪, 周圆, 孙雪, 李玉, 李庆刚. 乳酸乳球菌生产2'-岩藻糖基乳糖的途径构建及发酵培养基优化[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 84-96.
[7]	杨玉梅, 张坤晓. 应用CRISPR/Cas9技术建立ERK激酶相分离荧光探针定点整合的稳定细胞株[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 159-164.
[8]	吕秋谕, 孙培媛, 冉彬, 王佳蕊, 陈庆富, 李洪有. 苦荞转录因子基因FtbHLH3的克隆、亚细胞定位及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 194-203.
[9]	李博, 刘合霞, 陈宇玲, 周兴文, 朱宇林. 金花茶CnbHLH79转录因子的克隆、亚细胞定位及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 241-250.
[10]	张曼, 张叶卓, 何其邹洪, 鄂一岚, 李晔. 植物细胞壁结构及成像技术研究进展[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 113-122.
[11]	杜冬冬, 钱晶, 李思琪, 刘雯菲, 魏向利, 刘长勇, 罗瑞峰, 康立超. 单核细胞增生李斯特菌LMXJ15全基因组测序及分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 298-306.
[12]	施炜涛, 姚春鹏, 魏文康, 王蕾, 房元杰, 仝钰洁, 马晓姣, 蒋文, 张晓爱, 邵伟. 利用CRISPR/Cas9技术构建MDH2敲除细胞株及抗呕吐毒素效应研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 307-315.
[13]	周文汉, 郑康宁, 李永民. 瑞香狼毒降低YAP1表达抑制肝癌细胞增殖的作用[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 316-324.
[14]	吴昊, 刘紫微, 郑颖, 戴雅文, 时权. 单细胞水平解析人牙龈间充质干细胞异质性[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 325-332.
[15]	赵金玲, 安磊, 任晓亮. 单细胞转录组测序技术及其在秀丽隐杆线虫中的应用[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 158-170.