薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建

生物技术通报 ›› 2014, Vol. 0 ›› Issue (9): 84-88.

薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建

于盱,梁呈元,刘艳,李维林

江苏省中国科学院植物研究所，南京 210014

收稿日期:2014-03-18 出版日期:2014-09-15 发布日期:2014-09-07
作者简介:于盱，女，博士研究生，研究方向：药用植物资源和育种；E-mail：yuxu84@163.com
基金资助:
江苏省自然科学基金项目（BK2010475），江苏省农业科技自主创新资金项目［CX（11）1021］

Prokaryotic Expreesion and RNA Interference Vector Construction for Geranyl Diphosphate Synthase of Mentha haplocalyx Briq.

Yu Xu,Liang Chengyuan, Liu Yan, Li Weilin

Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014

Received:2014-03-18 Published:2014-09-15 Online:2014-09-07

摘要/Abstract

摘要： 利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶（GPPS）基因特异引物，扩增得到GPPS基因开放式阅读框（1131bp），并将其插入到原核表达载体pET-28a中，经酶切测序验证的重组质粒pET-28a-GPPS转入Rosetta（DE3），利用IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示，终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导后6h，SDS-PAGE显示薄荷GPPS基因在Rosetta（DE3）中获得高效表达。目前利用RNA干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟，以GPPS大亚基基因为靶目标，成功构建了薄荷GPPS大亚基基因的pBI121-RNAi-GPPS干扰载体。

关键词: 薄荷, GPPS, 原核表达, RNAi, 载体构建

Abstract: Geranyl diphosphate synthase（GPPS）gene total ORF（1 131 bp）was amplified with specific primers and linked to expression vector pET-28a. Verified by double restriction enzyme digestion and sequencing, recombined vector pET-28a-GPPS was transferred to Rosetta（DE3）and the recombined protein was overexpressed after 6 h induced by 1 mmol/L IPTG. Using RNA interference method to research gene function is matured gradually. In our research, the expression vector pBI121-RNAi-GPPS targeting to GPPS gene was structured successfully.

Key words: Mentha haplocalyx Briq, GPPS , Prokaryotic expreesion , RNAi , Vector construction

于盱,梁呈元,刘艳,李维林. 薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建[J]. 生物技术通报, 2014, 0(9): 84-88.

Yu Xu,Liang Chengyuan, Liu Yan, Li Weilin. Prokaryotic Expreesion and RNA Interference Vector Construction for Geranyl Diphosphate Synthase of Mentha haplocalyx Briq.[J]. Biotechnology Bulletin, 2014, 0(9): 84-88.

参考文献

［1］Dudareva N, Negre F, Nagegowda DA, Orlova I. Plant volatiles：recent advances and future perspectives［J］. Crit Rev Plant Sci, 2006（25）：417-440.
［2］Serna L, Marin C. Trichomes：different regulatory networks lead to convergent structures［J］. Trends Plant Sci, 2006, 11：274-280.
［3］中华人民共和国卫生部国家药典委员会.中华人民共和国药典：（2010年版一部）［M］.北京：化学工业出版社人民卫生出版社, 2010.
［4］彭蕴茹, 钱士辉, 石磊, 等. 薄荷非挥发性提取部位的药理活性研究［J］. 中药材, 2008, 31（1）：104-107.
［5］王晖, 许卫铭, 王宗锐.薄荷醇对柴胡镇痛成分表观生物利用度的影响［J］.中成药, 1996, 18（6）：4-6.
［6］Lee MY, Lee JA, Seo CS, et al. Protective effect of Mentha haplocalyx ethanol extract（MH）in a mouse model of allergic asthma［J］. Phytotherapy Research, 2011, 25：863-869.
［7］Chan BC, Hong KL, Leung PC, et al. Traditional Chinese medicine for a topic eczema：PentaHerbs formula suppresses inflammatory mediators release from mast cells［J］. Journal of Ethnopharmacol-ogy, 2008, 120：85-91.
［8］Croteau R. Biosynthesis and catabolism of monoterpenoids［J］. Chem Rev, 1987, 87：929-954.
［9］Burke C, Wildung MR, Croteau R. Geranyl diphosphate synthase：cloning expression and characterization of this prenyltransferase as a heterodimer［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 1999（96）：13062-13067.
［10］Burke C, Klettke K, Croteau R. Heteromeric geranyl diphosphate synthase from mint：construction of a functional fusion protein and inhibition by bisphosphonate substrate analogs［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 422：52-60.
［11］Gong D, Zhang C, Chen X, et al. Constitutive activation and transgenic evaluation of the function of an Arabidopsis PKS protein kinase［J］. J Biol Chem, 2002, 277（44）：42088-42096.
［12］Xu M, Zhu L, Shou H, et al. A PIN1 family gene, OsPIN1, involved in auxin-dependent adventitious root emergence and tillering in rice［J］. Plant & Cell Physiology, 2005, 4（610）：1674-1681.
［13］Mahmoud SS, Croteau RB. Menthofuran regulates essential oil biosynthesis in peppermint by controlling a downstream monoterpene reductase［J］. PNAS, 2003, 100（24）：14481-14486.
［14］Rodney BC, Edward MD, Kerry L, et al. Menthol biosynthesis and molecular genetic［J］. Naturwissenschaften, 2005, 92：562-577.
［15］Burke C, Croteau R. Geranyl diphosphate synthase from Abies grandis：cDNA isolation, functional expression, and characteriza-tion［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2002, 405：130-136.
［16］Bass BL. Double-stranded RNA as a template for gene silencing［J］. Cell, 2000, 101：235-238.
［17］王永佳, 陈永胜, 李国瑞. RNAi在植物中的作用机理及其应用研究进展［J］.内蒙古民族大学学报：自然科学版, 2010, 25（1）：54-57.

[1]	梅欢, 李玥, 刘可蒙, 刘吉华. 小檗碱桥酶高效原核表达及生物合成l-SLR的研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 277-287.
[2]	周家燕, 邹建, 陈卫英, 吴一超, 陈奚潼, 王倩, 曾文静, 胡楠, 杨军. 植物多基因干扰载体体系构建与效用分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(1): 115-126.
[3]	罗皓天, 王龙, 王禹茜, 王月, 李佳祯, 杨梦珂, 张杰, 邓欣, 王红艳. 青狗尾草RNAi途径相关基因的全基因组鉴定和表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(1): 175-186.
[4]	索青青, 吴楠, 杨慧, 李莉, 王锡锋. 水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的原核表达、抗体制备和应用[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 135-141.
[5]	覃雪晶, 王雨涵, 曹一博, 张凌云. 青杄PwHAP5基因原核表达及多克隆抗体制备[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 142-149.
[6]	赵忠娟, 杨凯, 扈进冬, 魏艳丽, 李玲, 徐维生, 李纪顺. 盐胁迫条件下哈茨木霉ST02对椒样薄荷生长及根区土壤理化性质的影响[J]. 生物技术通报, 2022, 38(7): 224-235.
[7]	王光丽, 范婵, 王辉, 卢惠芳, 夏灵尹, 黄健, 闵迅. 霍乱弧菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定[J]. 生物技术通报, 2022, 38(7): 269-277.
[8]	汪巧菊, 胡雨萌, 温亚亚, 宋丽, 孟闯, 潘志明, 焦新安. 新型冠状病毒S1蛋白的表达及活性鉴定[J]. 生物技术通报, 2022, 38(3): 157-163.
[9]	刘萌萌, 韩立军, 刘宝玲, 薛金爱, 李润植. 陆地棉GhSDP1及其启动子的克隆与表达分析[J]. 生物技术通报, 2022, 38(2): 34-43.
[10]	沈俊强, 张莉萍, 于瑞明, 王永录, 潘丽, 刘霞, 刘新生. 猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 生物技术通报, 2022, 38(10): 243-253.
[11]	胡子曜, 代培红, 刘超, 玛迪娜·木拉提, 王倩, 吾尕力汗·阿不都维力, 赵燚, 孙玲, 徐诗佳, 李月. 陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP3的克隆、表达及VIGS载体的构建[J]. 生物技术通报, 2021, 37(9): 106-113.
[12]	山草梅, 叶蕾, 张连虎, 况卫刚, 孙晓棠, 马建, 崔汝强. 水稻抗潜根线虫基因OsRAI1的克隆及功能分析[J]. 生物技术通报, 2021, 37(7): 146-155.
[13]	曾福源, 苏泽辉, 周诗慧, 谢妙, 庞欢瑛. 溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 84-91.
[14]	张西西, 张怡青, 李玉林, 韩笑, 王国强, 王晓军, 王旭东, 王云龙. 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白C端重组蛋白的原核表达、纯化及应用[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 92-97.
[15]	白福美, 李至敏, 王小琴, 胡紫微, 鲍玲玲, 李志敏. 集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 98-107.