生物技术通报

刘蓉蓉

2014, 30(9): 1-6.

摘要 ( 261 )

PDF (1036KB) ( 514 )

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作物基因工程是农业生物技术的重点领域之一，也是我国推进现代种业发展的战略选择。文章分析了我国作物转基因研发目前存在的主要差距与实现更大发展的可能性，提出今后加大支持的研发重点建议，旨在探讨加快推进我国转基因作物研发、提升研发投入成效的对策建议。

植物内生菌防治植物寄生线虫的研究进展

江绪文,李贺勤,

2014, 30(9): 7-12.

摘要 ( 292 )

PDF (1019KB) ( 830 )

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植物内生菌作为生物防治中的天然资源菌，已引起越来越多研究者的关注。从植物内生菌的分布和种类、分离培养、活性筛选、活性物质成分以及防治植物寄生线虫的作用机理几方面内容进行综述，并对植物内生菌防治植物寄生线虫的相关问题及发展趋势进行探讨，以期为今后深入开展相关研究提供参考。

甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用

刘戬丰,王艳丽,李相敢

2014, 30(9): 13-21.

摘要 ( 358 )

PDF (1744KB) ( 559 )

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甘露糖在己糖激酶的作用下形成6-磷酸甘露糖，进一步在磷酸甘露糖异构酶（Phosphomannoseisomerase，PMI）的催化下转化成植物可利用的6-磷酸果糖，从而使转化细胞在甘露糖作为主要碳源的培养基上正常生长，而非转化细胞生长受到抑制。这一筛选体系被认为是一种正向筛选（Positiveselection），已被成功地应用于重要的粮食作物和经济作物中。甘露糖筛选的植株可以通过多种方法检测，其中氯酚红检测法和试纸条检测法简单方便，适用于初步筛选。甘露糖筛选体系安全高效，已被应用于玉米商业化产品中。综述了甘露糖（mannose）筛选体系的原理、筛选特点、植株的鉴定、筛选方法的优缺点以及在商业化中的应用，列举了利用甘露糖筛选的玉米单性状转化系用于抗鳞翅目和抗鞘翅目昆虫及抗高温淀粉酶的范例及其在育种叠加中的应用。这种育种叠加使得甘露糖筛选的性状与其他性状重叠而得到更广谱的具有抗除草剂抗虫性状的商业化产品。

野生花卉大百合属植物繁殖技术研究进展

汪小飞,周志光,王玉义

2014, 30(9): 22-27.

摘要 ( 296 )

PDF (1009KB) ( 629 )

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大百合属（Cardiocrinum）植物是一类具有重要应用价值的野生花卉，对其繁殖技术体系的研究旨为推广应用奠定基础。从引种栽培、种子生理、组织培养等方面综述了大百合属繁殖技术的研究进展，认为利用种子和组培进行大量繁殖已成为可能，对其杂交育种还需进一步深入研究，今后也应对其进行现代生物技术的应用研究。

家畜诱导性多能干细胞研究进展

李嘉宁,刘鹏霞,

2014, 30(9): 28-33.

摘要 ( 319 )

PDF (1031KB) ( 652 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

目前，家畜胚胎干细胞（Embryonicstemcells，ESCs）建系技术还不完善，很多大型家畜都未能建立ESCs系，这在很大程度上限制了家畜相关研究的开展。诱导性多能干细胞（Inducedpluripotentstemcells，iPSCs）技术的建立，为迅速、高效的获得家畜多潜能干细胞提供了新方法。家畜iPSCs的建立，将推动家畜发育生物学、异种器官移植、人类疾病模型建立、家畜品种改良等研究。综述了家畜iPSCs技术的最新进展，并探讨了家畜iPSCs的应用前景。

miR-143在脂肪细胞分化和脂类代谢中的作用

李静,黄英,黄丽梅,杨明华,李琦华,贾俊静,赵素梅

2014, 30(9): 34-38.

摘要 ( 259 )

PDF (1226KB) ( 878 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

miR-143是内源性非编码的RNA，在细胞的分化、发育、增殖、脂肪代谢及疾病产生等许多生物学过程中具有重要作用。miR-143与脂类代谢密切相关，主要通过与靶基因的相互作用，影响脂肪的分化，甘油三酯的合成等。针对miR-143合成、预测的靶基因以及靶基因的调控机制方面进行综述，阐述miR-143在脂肪代谢中的作用，以便为相关疾病的诊断、治疗方面提供新思路。

食用菌漆酶生物学性质及其应用研究进展

张鹏,王延锋,潘春磊,盛春鸽,王金贺,史磊

2014, 30(9): 39-44.

摘要 ( 355 )

PDF (1056KB) ( 1368 )

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漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，对木质素有很强的降解能力，食用菌在生长发育过程能够分泌漆酶。目前，国内对于食用菌漆酶的报道不多。综述了食用菌漆酶的生物学性质、酶活性分析方法及最新应用研究进展。

紫杉醇脂质体制备方法优化比较

乔广军,张保奎,杨荣,焦毅,季大林

2014, 30(9): 45-50.

摘要 ( 262 )

PDF (1903KB) ( 1412 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

为了优化紫杉醇脂质体制备工艺，探究逆向蒸发法、高剪切法、薄膜分散法、注入法及复乳法等脂质体制备方法，对逆向蒸发法制备工艺及制剂处方进行单因素考察，由试验结果得出最优处方为药脂比为1∶25，磷脂含量为2.5%，胆固醇与磷脂比为1∶9，并对包封率以及粒径等指标进行初步评价，最终按照优化后的工艺制得的紫杉醇脂质体的包封率较高，粒径大小符合要求，质量稳定。

植物叶片基因组DNA快速提取方法

迟婧,耿丽丽,高继国,束长龙,张杰,

2014, 30(9): 51-57.

摘要 ( 484 )

PDF (1898KB) ( 2014 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

为了满足分子生物学研究中大量植株基因需要PCR检测的需求，建立了一种无需研磨、无需有机试剂抽提的快速提取植物叶片基因组DNA的方法。通过比较基因组DNA的浓度及PCR检测结果，获得了最佳提取条件，即约50mg叶片加入150μL含1%β-巯基乙醇的TE提取液，快速破碎1min。破碎后的样品4℃13500×g离心1min，上清于-20℃冷冻后室温融解，4℃、13500×g离心1min，离心后收集的上清溶液即可用于PCR检测。整个提取过程仅需10-12min，具有样品用量小、操作简单、廉价、高效等优点。使用此方法提取的烟草、水稻、大豆、玉米、油菜和花生的基因组DNA均可用于PCR扩增，并可成功扩增长度为3244bp的基因片段。此方法提取的基因组DNA也可用于对未知基因的扩增，获得4条新的花生actin基因序列。

改良的蛋白质电泳考马斯亮蓝染色方法研究

饶维桥,肖伟敏,张继远,饶媛,訾金

2014, 30(9): 58-64.

摘要 ( 345 )

PDF (1511KB) ( 3110 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

旨在建立简便、经济、灵敏以及质谱兼容的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳染色法，在胶体考染（BlueSilver）配方（0.12%的考马斯亮蓝G-250，10%的磷酸，10%的硫酸铵，和20%的甲醇）的基础上，通过优化凝胶固定时间与染色液中各物质用量，得到改良的染色液配方（0.1%的考马斯亮蓝G-250或R-250，5%的磷酸，5%的硫酸铵，10%的甲醇）及简便的操作步骤。试验对比结果显示，改良方法一与胶体考染相比仍保持了较高的染色灵敏度以及较好的质谱兼容性，且有机试剂使用量更少，染色深度与蛋白质量的线性关系也更好。

一种新的植物miRNA体内下调表达系统

姜锋,许硕,胡正,姜奇彦,张辉

2014, 30(9): 65-71.

摘要 ( 277 )

PDF (1523KB) ( 1114 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

MicroRNA（miRNA）是一种内源性的21到24个核苷酸长度的小分子RNA，在植物发育过程中起重要作用。旨在建立一种新的植物miRNA下调表达系统，为miRNA的功能研究提供有力的工具。不同于原有targetmimicry的构建方法，以miRNA核心序列为基础，通过设计特定DNA引物，利用聚合酶链式反应（PCR）获得多拷贝的靶基因类似序列（Targetmimicryortargetmimics），构建targetmimicry载体，转化拟南芥。通过qRT-PCR验证miRNA靶基因在转基因植株中的表达。以拟南芥6个保守miRNA为基础，获得了各个miRNA下调表达转基因株系，在转基因植株中检测miRNA靶基因的表达，与野生型相比差异明显，均发生了明显的上调。我们基于一种新的targetmimicry的载体构建方法，成功建立了一种在植物中具有普遍适用性的高效miRNA低表达系统。

白粉菌诱导下感病小麦京411中TCTP基因的表达分析

郑舒扬,王艳红,肖莹,刘晓颖,王振英

2014, 30(9): 72-77.

摘要 ( 222 )

PDF (1978KB) ( 555 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

TCTP广泛存在于动植物及微生物中，参与重要的生物过程。对小麦中克隆到的TCTP基因进行了白粉菌诱导下的表达模式分析，结果发现，在对白粉菌敏感的小麦京411中，白粉菌侵染后TCTP基因应答迅速，且基因表达水平较高。用病毒介导的基因沉默方法沉默京411中的TCTP基因，发现白粉菌成功侵染小麦叶片的比例下降，乳突等抗性结构特征比例上升，H2在细胞内的累积水平升高。试验结果表明，TCTP在小麦与白粉菌互作过程中起重要作用。

高粱EMS诱变及突变体筛选、鉴定

王春语,朱振兴,李丹,丛玲,张丽霞

2014, 30(9): 78-83.

摘要 ( 332 )

PDF (1599KB) ( 2110 )

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突变率和突变类型是突变体表型筛选和构建饱和突变体库的重要依据。采用不同时间和不同浓度甲基磺酸乙酯（EMS）处理高粱品种BTx623的种子，突变率和突变类型差异较大。突变类型可分为叶色、叶形、穗型、育性及生育期等，变异类型较丰富。根据处理后种子出苗率、结实率和突变率的情况，最终确定20h+EMS0.2%为最佳的诱变处理时间和浓度。但构建饱和突变体库，建议采用多浓度多时间处理方式。

薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建

于盱,梁呈元,刘艳,李维林

2014, 30(9): 84-88.

摘要 ( 301 )

PDF (1553KB) ( 720 )

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利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶（GPPS）基因特异引物，扩增得到GPPS基因开放式阅读框（1131bp），并将其插入到原核表达载体pET-28a中，经酶切测序验证的重组质粒pET-28a-GPPS转入Rosetta（DE3），利用IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示，终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导后6h，SDS-PAGE显示薄荷GPPS基因在Rosetta（DE3）中获得高效表达。目前利用RNA干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟，以GPPS大亚基基因为靶目标，成功构建了薄荷GPPS大亚基基因的pBI121-RNAi-GPPS干扰载体。

节瓜ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

赵芹,谢大森,罗少波,彭庆务,李明珠,李海达

2014, 30(9): 89-96.

摘要 ( 239 )

PDF (2264KB) ( 562 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

旨在开展节瓜种质资源分类鉴定与遗传多样性研究。通过正交试验设计与单因素分析相结合的方法，对节瓜ISSR-PCR反应体系5个因素（模板DNA浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度与Taq聚合酶浓度）在4个水平上进行优化分析，建立了节瓜稳定可靠且具丰富多态性的最佳反应体系，进而对引物退火温度进行梯度试验分析。结果表明，20μL节瓜ISSR-PCR最佳反应体系为70ng模板DNA、0.2mmol/LdNTP、1.2mmol/LMg2+浓度、0.96μmol/L引物、0.8UTaqDNA聚合酶和2.0μL10×buffer；引物IS807最佳退火温度为53℃。以此为基础，利用4条引物对4份节瓜种质进行最佳反应体系稳定性验证，证明该体系稳定可靠、扩增谱带清晰、多态性丰富且重复性较好。

辣椒杂交种纯度鉴定的SSR核心引物筛选

管俊娇,张建华,张惠,马芙蓉,杨晓洪,王江民

2014, 30(9): 97-101.

摘要 ( 335 )

PDF (1175KB) ( 525 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

旨在确定一套适于辣椒杂交种纯度鉴定的核心SSR引物，利用17对SSR引物对100份已知辣椒（Capsicum）杂交种进行DNA指纹分析。根据多态性和杂合率两个指标，确定Hpms1-214、Es395和Hpms1-5为辣椒杂交种纯度鉴定的首选核心引物，利用这3个引物进行筛选，97个品种（占97%）能够找到具有杂合带型的鉴定引物，确定5个引物Es330、Es363、Epms923、Es120和Es64为辣椒杂交种纯度鉴定的备选核心引物。筛选出14个品种的特异性引物，可进一步筛选每个辣椒杂交种的双亲互补型引物。

人参病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定

史册,韩梅,张一鸣,郭双双,杨利民

2014, 30(9): 102-108.

摘要 ( 243 )

PDF (1861KB) ( 749 )

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采用平板对峙法、生长速率测定法等对人参根际分离得到的4株放线菌的抑菌活性进行了研究，并通过形态学特征观察、生理生化测定和16SrDNA序列分析进行分类鉴定。结果表明，4株放线菌对人参常见病病原真菌的抑菌效果明显。其中，FX-10对毁灭柱孢菌、灰葡萄孢菌和FX-61对人参核盘菌的抑制率分别达到91.28%、91.8%和90.07%。FX-10、FX-61、FX-137对人参的5种病原菌和FX-139对人参的7种病原菌有抑制作用，并且抑菌效果稳定。通过形态、生理生化和分子生物学鉴定，FX-139为酒红土褐链霉菌（Streptomycesvinaceus-drappus），FX-10为黑浅灰链霉菌（Streptomycesnigrogriseolus），FX-137为酒红链霉菌（Streptomycesvinaceus），FX-61为链霉属的灰褐类群。

一株具有杀虫活性真菌的筛选及活性物质稳定性研究

何海波,钟娟,杨杰,周金燕,谭红

2014, 30(9): 109-113.

摘要 ( 212 )

PDF (1735KB) ( 581 )

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以卤虫为初筛指示虫，以蚜虫为复筛指示虫，从广西玉林土壤分离筛选出具有杀虫活性的菌株YLZ42。根据培养特征、形态特征及18SrDNA、ITS序列分析，菌株YLZ42被鉴定为淡色生赤壳菌（Bionectriaochroleuca）。生物测定结果表明，YLZ42发酵液的乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾具有明显的毒杀活性，其校正死亡率在78.9%以上。YLZ42发酵液稳定性研究表明，其活性成分在100℃处理60min，pH1-11条件下仍具有较强的杀虫活性。

三角褐指藻的诱变育种及产EPA的条件研究

刘红全,林小园,李洁琼,潘艺华

2014, 30(9): 114-119.

摘要 ( 242 )

PDF (2090KB) ( 586 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

旨在获得不饱和脂肪酯EPA产量更高的藻种，利用0.6%EMS对三角褐指藻进行诱变。通过单细胞分离技术得到1株突变株EP1，其EPA产量比出发藻株提高了19.81%。结果显示，突变藻株产EPA的最适条件为：NaNO375mg/L，pH7.5，昼夜温度17-15℃，接种量为12%。最适条件下培养7d，其EPA产量可达26.77mg/g。传代试验表明，突变藻株具有较好的遗传稳定性。

紫外、60Co复合诱变选育烟色烟管菌漆酶高产突变株

彭滟钞,曹福祥,董旭杰,彭继庆,胡双喜

2014, 30(9): 120-124.

摘要 ( 217 )

PDF (1631KB) ( 625 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

对烟色烟管菌（Bjerkanderafumosa5.0172）的孢子悬浮液进行紫外诱变筛选得到一株诱变株ZW-7，其产漆酶的活力是原始菌株的1.33倍，继代培养5代后，未见酶活下降。将诱变株ZW-7的孢子悬浮液用60Co-γ射线进行辐射诱变筛选得到一株诱变株Co-11，其产漆酶的活力是ZW-7的1.18倍，为380.5U/L，较原始菌株的250.6U/L提高了约58.1%，继代培养5代后，酶活稳定。

苏云金芽胞杆菌V4菌株cry杀虫基因的鉴定、表达及杀虫活性分析

何宝楠,李海涛,刘荣梅,王博,高继国

2014, 30(9): 125-130.

摘要 ( 217 )

PDF (2089KB) ( 551 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

旨在给生物防治提供更多的基因资源，以从本实验室分离的300株苏云金芽胞杆菌基因组为模板，利用cry1类全长通用引物进行PCRcry1类基因鉴定。经过PCR-RFLP鉴定出菌株V4含有cry1Ea基因，进一步研究发现该菌株还含有cry2Aa基因，并成功克隆到了这两个新基因，被Bt国际命名委员会正式命名为cry1Ea12和cry2Aa16。将两种基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达，表达蛋白进行杀虫活性测定，结果表明两种蛋白杀虫活性不理想，但对试虫存在明显的体重抑制，而V4菌株蛋白具有较高的杀虫活性。

斑玉蕈不同交配型的原生质体单核菌株差异分析

潘越,陈辉,冯志勇,赵静,

2014, 30(9): 131-135.

摘要 ( 230 )

PDF (1986KB) ( 417 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

对2个斑玉蕈菌株进行了原生质体分离与交配型鉴定，并对不同交配型单核体的代谢特性进行了研究。结果表明，2个斑玉蕈菌株均出现2种交配型，2种交配型比例不一致，且2个菌株的两种单核体的分离比例均不符合1∶1分离比，交配型比例上出现明显的偏差现象。2个菌株中，不同交配型单核菌株的菌丝形态有明显差别，代谢过程中的菌丝生物量及发酵液的pH、还原糖含量和电导率均存在差异，表明在这2个菌株中不同交配型单核菌株的菌丝形态及代谢特性与交配型因子相关。

激发子对桦褐孔菌多酚合成的诱导及其生化机制初探

魏志文,孙勇,王菲

2014, 30(9): 136-141.

摘要 ( 245 )

PDF (2166KB) ( 406 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

旨在研究真菌激发子对桦褐孔菌多酚合成的影响，采用液体摇瓶培养方式，将真菌激发子加入到桦褐孔菌液体培养物中，检测桦褐孔菌次级代谢产物的积累，以及真菌激发子对桦褐孔菌一氧化氮合酶（NOS）活性的影响。结果表明，适量添加真菌激发子能够提高桦褐孔菌的代谢速率，提高多酚类化合物的合成，胞内和胞外多酚最高可达102.15mg/L和311.91mg/L，并能显著提高桦褐孔菌NOS的活性，其活性最高可达151.93U/mgprot，发酵液一氧化氮（NO）含量最高可达256.28μmol/L。这表明，真菌激发子能够有效激活桦褐孔菌的次级代谢产物合成途径。

利用毕赤酵母发酵废液培养原始小球藻的研究

邓伟,桂小华,汪桂林,姚杰,闫云君

2014, 30(9): 142-148.

摘要 ( 301 )

PDF (2111KB) ( 644 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

以毕赤酵母发酵废液为水源并提供部分C源和N、P，在500mL摇瓶中，比较了发酵废液培养基与SE基础培养基对原始小球藻的生长影响，并通过单因素和正交优化发酵废液培养基。结果表明，发酵废液培养基适合于原始小球藻的培养。利用发酵废液培养小球藻，在添加葡萄糖0.05mol/L，硝酸钠0.01mol/L，磷酸二氢钾0.003mol/L，海绿素浓度300μL/L，培养7d后最高生物量达6.56g/L，油脂含量达33.68%，两者均高于SE基础培养基。油脂的脂肪酸组成分析表明，废液培养基培养下小球藻油脂的脂肪酸组成主要是C16∶0（25.12%）、C18∶0（4.69%）、C18∶1（50.46%）、C18∶2（6.78%）、C18∶3（8.58%），而SE培养基培养的小球藻油脂脂肪酸组成主要是C16∶0（24.56%）、C18∶0（20.36%）、C18∶1（16.66%）、C18∶2（14.32%）、C18∶3（30.98%），两种培养基培养所得藻油脂肪酸组成虽相差较大，但均适合作为生物柴油的原料。

重组粪肠球菌gshF基因对副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）L14抗逆性能的影响

于蕊,左芳雷,陈喜玲,魏艳杰,陈尚武

2014, 30(9): 149-156.

摘要 ( 269 )

PDF (2426KB) ( 804 )

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乳酸菌作为重要的食品工业微生物，其在工业生产应用过程中会受到多种非生物胁迫。已有研究表明部分乳酸菌可以吸收培养基中或是自身合成谷胱甘肽（Glutathione，GSH），提高对各种胁迫的抵抗作用。克隆了粪肠球菌（Enterococcus faecalis）中的谷胱甘肽合成酶基因gshF，通过构建乳杆菌重组表达质粒，实现了gshF在副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）L14菌株中的异源表达。通过对重组gshF-副干酪乳杆菌阳性菌株的抗逆性性测定，结果表明在过氧化氢、酸、冻干脱水和渗透等胁迫条件下，gshF重组菌株的存活率与对照菌株相比均有显著提高。

氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

李翎,许琳,魏淼,李艳,严明

2014, 30(9): 157-163.

摘要 ( 221 )

PDF (2553KB) ( 623 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

根据NCBI上的报道的基因序列设计引物，以氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）H24的基因组为模板，获得5-葡萄糖酸脱氢酶（Ga5DH）基因，将其与表达载体pET-28a连接，构建重组质粒pET-28a-Ga5DH，并转化大肠杆菌Rosetta进行表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达蛋白的分子大小为26.5kD，纯化后酶活达7.83U/mg。酶学性质分析表明，该酶的最适反应温度为40℃，最适pH为11。在pH9-11的缓冲中保温8h，酶活力仍有80%以上的残余。该酶对多种有机溶剂具有良好的耐受性。

产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件的优化

柴秀娟,李曹龙,孔德真,崔郑龙,王爱英

2014, 30(9): 164-170.

摘要 ( 272 )

PDF (1816KB) ( 647 )

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采集新疆吐鲁番地区土样，从中分离筛选1株产纤维素酶菌株C-8；经形态观察、生理生化及16SrRNA序列分析，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。该菌株所产纤维素酶的最适合作用pH和温度分别为9.0、40℃，且具有良好的pH稳定性和温度稳定性。为了提高C-8菌株产纤维素酶能力，利用响应面法对其发酵产酶条件进行优化。采用Plackett-Burman设计筛选出影响其产酶条件的3个主效应因素，最陡爬坡试验逼近最大响应值区域，利用Box-Behnken响应面分析法优化发酵产酶条件。结果表明，起始pH、CMC-Na%和培养温度为主要影响因素。通过三因素三水平的响应面分析得到最优条件为起始pH8.0、CMC-Na%2.5%、培养温度28℃。在此条件下纤维素酶活可达193.89U/mL，与优化前相比，酶活提高2.35倍。

利用λRed 重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

李晔,张西轩,郭梦征,王素英,张坤生,阮海华

2014, 30(9): 171-177.

摘要 ( 305 )

PDF (2086KB) ( 830 )

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摘要：利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的（SalmonellaentericaserovartyphimuriumLT2，S.typhimuriumLT2）sopB基因。以pKD4质粒为模板，扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段，将其转化至表达Red重组酶的S.typhimuriumLT2感受态细胞中；在抗生素压力和λRed重组系统帮助下，同源片段和菌体sopB基因发生同源重组，通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌；转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记，得到保留单一FRT位点的突变菌株；利用PCR技术鉴定重组菌，并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力，且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimuriumLT2的sopB基因缺失突变株，为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具，同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。

人源CD137L基因在不同表达系统中表达效率的比较

何东洋,马超,高振月,王淑珍,陈依军

2014, 30(9): 178-184.

摘要 ( 242 )

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比较分析人源CD137L在毕赤酵母、枯草杆菌及大肠杆菌中的表达差异，建立适合CD137L的表达系统并检测CD137L的生物学活性。设计PCR引物，以酵母表达质粒pPIC9K-CD137L为模板，扩增CD137L片段，分别构建枯草杆菌表达质粒及大肠杆菌表达质粒，再转化至相应的宿主菌并筛选阳性转化子；SDSPAGE电泳分析CD137L的表达情况并比较差异；稀释复性法复性CD137L包涵体，用离子交换层析纯化CD137L；T细胞激活试验检测CD137L的活性。CD137L在3个表达系统中均可以表达并且得到质谱鉴定，但是在毕赤酵母、枯草杆菌中的表达量微弱，而在大肠杆菌中CD137L以包涵体形式高效表达，平均1L培养液能得到0.8g包涵体沉淀，200mg变性蛋白。经复性纯化后得到的CD137L能有效激活T细胞增殖并且其刺激活性呈现浓度依赖效应。与毕赤酵母、枯草杆菌相比，大肠杆菌表达系统能高效表达CD137L蛋白，并且经稀释复性后CD137L保持了刺激小鼠T细胞增殖的活性。

麦洼牦牛TLR3基因编码区的克隆及生物信息学分析

陈亚冰,兰道亮,林宝山,黄偲,黄勇,李键

2014, 30(9): 184-188.

摘要 ( 257 )

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利用分子克隆技术成功获得麦洼牦牛TLR3编码区基因序列，采用相关分析及预测软件对基因及其编码的蛋白质进行基本理化性质、二级结构及结构域等分析预测。结果表明该基因包含了1个2715bp的开放阅读框，编码904个氨基酸；所编码的蛋白质二级结构主要由α螺旋及无规则卷曲为主；TLR3基因进化树及基因同源性比对结果表明TLR3基因及其保守，牦牛TLR3基因与黄牛、绵羊和马等哺乳动物遗传距离很近。

Leptin基因多态性与绵羊季节性发情的相关分析

李辉,卢守亮,万鹏程,代蓉,李良远,孟浩浩,石国庆

2014, 30(9): 189-194.

摘要 ( 249 )

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根据leptin基因在GenBank中的已知序列设计两对引物，采用PCR-SSCP技术在常年发情的湖羊和季节性发情的阿勒泰羊群体中进行单核苷酸多态性（SNPs）检测，对筛查到的SNP位点进行基因型与绵羊季节性发情的关联分析。结果表明，与湖羊相比，阿勒泰羊leptin基因第1内含子上有3个连续碱基TTG的插入和C/T碱基突变；第3外显子3上发生G/T碱基突变，编码氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸。Leptin外显子2扩增片段上检测到AA、AB、BB三种基因型，BB基因型在阿勒泰羊群体中属于优势基因型；对两个群体进行基因型频率独立性χ2检验，差异极显著（P<0.001），说明BB基因型是影响季节性发情的有利基因型。研究结果提示，绵羊品种中Leptin基因序列的差异性可能是造成绵羊季节性发情的原因之一，可作为常年发情绵羊品种选育的辅助标记。

松江鲈鱼体表黏液抑菌效果研究

邱进,潘连德,张帅

2014, 30(9): 195-200.

摘要 ( 352 )

PDF (1377KB) ( 592 )

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以松江鲈鱼（Trachidermusfasciatus）体表黏液作为试验材料，分别用水、酸、有机物3种不同的提取剂对其进行粗提取，采用滤纸片法和二倍稀释法确定其抑菌效果，只有酸的粗提物对所检测的6种病原菌有明显的抑制作用，且抑制作用由大到小的排列顺序是：维氏气单胞菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、沃氏葡萄球菌。用SDS-PAGE定量分析酸的粗提物蛋白质表达谱，其蛋白大小＜95kD，且在34-55kD之间含量最高。初步研究表明松江鲈鱼体表黏液酸的粗提物在抵抗上述病原菌入侵方面发挥了主要作用，其抗菌蛋白的确定还有待进一步分析。

一种检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的四重PCR法

凌空,丁诗华,金娟,吴兴镇,

2014, 30(9): 201-207.

摘要 ( 238 )

PDF (1524KB) ( 484 )

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建立一种快速诊断致病性嗜水气单胞菌的PCR法。根据嗜水气单胞菌的16SrDNA、外膜蛋白、溶血素及丝氨酸蛋白酶基因设计4对引物，经PCR反应条件优化后进行检测。结果表明，仅嗜水气单胞菌呈阳性，其检测敏感性高，可检测100fg的DNA模板。20株大鲵源嗜水气单胞菌经四重PCR法检测时，有18株呈阳性。其中，毒力基因种类较多的阳性菌株经人工感染试验和胞外产物活性检测时显示出较高的致病性。利用该PCR法进行的其他检测中，还发现33份人工感染样本全部呈阳性，34份疑似样本有21份呈阳性，说明四重PCR法可应用于临床检测。本研究建立的四重PCR法具有高度敏感性和特异性，可用于嗜水气单胞菌快速诊断。

中国沿海瘤背石磺不同地理群体遗传多样性的ISSR标记研究

王成暖,沈和定,郑培

2014, 30(9): 208-212.

摘要 ( 245 )

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研究以盐城（YC）、上海（SH）、温州（WZ）、厦门（XM）、深圳（SZ）、海南（HN）6个不同地理群体的瘤背石磺为试验材料，利用ISSR分子标记进行了遗传多样性研究。结果表明，6个地理群体的多态位点百分率在54.20%-70.99%之间，Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数分别在0.1564-0.2191和0.2421-0.3324之间。AMOVA分子变异分析表明，瘤背石磺47.25%的变异发生在群体间，52.75%的变异发生在群体内，居群内的遗传变异大于居群间的遗传变异。平均Fst值为0.4725，种间分化系数（Gst）为0.3705，基因流（Nm）为0.8497，表明6个地理群体间已经发生了较大程度的遗传分化，其中推断遗传漂变可能是影响群体分化的主要因素之一。

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