EB病毒融合蛋白Zta-P54在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

生物技术通报 ›› 2014, Vol. 0 ›› Issue (7): 173-178.

EB病毒融合蛋白Zta-P54在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

王云龙^{1, 3}, 张春艳¹, 李玉林³, 程蕾³, 王继创³, 邓黎黎², 米海³, 白晓静²

1.郑州大学生物工程系, 郑州 450001；
2.郑州职业技术学院, 郑州450046；
3.河南省生物工程技术研究中心, 郑州 450001

收稿日期:2013-12-24 出版日期:2014-07-15 发布日期:2014-07-16
作者简介:王云龙, 男, 教授, 研究方向：生物制药；E-mail：biowyl@126.com
基金资助:
河南科技攻关资助项目（132201310001）

Expression, Purification and Identification of Zta-P54 Fusion Protein in Escherichia coli of Epstein-Barr Virus

Wang Yunlong^{1, 3}, Zhang Chunyan¹, Li Yulin³, Cheng Lei³, Wang Jichuang³, Deng Lili², Mi Hai³, Bai Xiaojing²

1. Bioengineering Department, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001；2. Zhengzhou Technical College, Zhengzhou 450046；3. Henan Biotechnology Research Center, Zhengzhou 450001

Received:2013-12-24 Published:2014-07-15 Online:2014-07-16

摘要/Abstract

摘要： 为获得能用于检测试剂盒的高纯度具有活性的EB病毒融合蛋白, 以pGEX5T-BZLF1-BMRF1质粒为模板进行PCR扩增得到BZLF1-BMRF1融合基因, 将其插入pET32a中, 构建表达质粒pET32a/BZLF1-BMRF1。将该质粒转入大肠杆菌培养, 经IPTG诱导获得Zta-P54融合蛋白。用DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA亲和层析纯化, 并通过SDS-PAGE和Western blot对Zta-P54融合蛋白进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果显示成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒, SDS-PAGE显示该蛋白相对分子量约为60 kD, 与预期结果一致。纯化后获得纯度为96.5 %的Zta-P54融合蛋白。Western blot检测该蛋白有良好的生物活性和反应特异性。因此, 成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒, 在大肠杆菌中可溶性表达。最终获得纯度高、生物活性好的融合蛋白。

关键词: EB病毒, Zta-P54融合蛋白, 原核表达, 蛋白纯化

Abstract: It was to obtain high purity and active epstein-barr virus fusion protein and use for detection kit. The fragments of BZLF1-BMRF1 amplified by PCR from pGEX5T-BZLF1-BMRF1 was inserted into expression vector pET32a, and the recombinant plasmid pET32a-BZLF1-BMRF1 was transformed into E. coli, which was induced to express by IPTG. The expression protein Zta-P54 was purificated by DEAE Sepharose CL-6 B and Ni -NTA affinity chromatography then analysed by SDS-PAGE and immunoreactivity was proved by western blotting.Double endonuclease digestion and DNA sequencing results showed that sequencing results constructed successfully. SDS-PAGE showed that the protein was soluble expressing. The expression product Zta-P54 with the moleculor weight 60 kD was located in the cytoplasm and soluble.Expression Protein, s purity was 96.5%. Western blotting showed that frusion protein Zta-P54 possessed a well bioactivity and specificity.Therefore, It proved that the pET32a/BZLF1-BMRF1 plasmid can effectively express in E. coli.

Key words: EB virus, Zta-P54 fusion protein, Prokaryotic expression, Protein purification

王云龙, 张春艳, 李玉林, 程蕾, 王继创, 邓黎黎, 米海, 白晓静. EB病毒融合蛋白Zta-P54在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定[J]. 生物技术通报, 2014, 0(7): 173-178.

Wang Yunlong, Zhang Chunyan, Li Yulin, Cheng Lei, Wang Jichuang, Deng Lili, Mi Hai, Bai Xiaojing. Expression, Purification and Identification of Zta-P54 Fusion Protein in Escherichia coli of Epstein-Barr Virus[J]. Biotechnology Bulletin, 2014, 0(7): 173-178.

参考文献

[1] Feederle R, Kost M, Baumann M, et al. The Epstein-Barr virus lytic program is controlled by the co-operative functions of two transactivators[J]. EMBO J, 2000, 19（12）：3080-3089.
[2] 顾耀亮, 张昌卿, 吴子柏, 等．抗重组EB病毒双重抗体鼻咽癌血清学研究[J]．癌症, 2003, 22（9）：903-906．
[3] Islam MS, Anoop P, Gordon-Smith EC, et al. Epstein-Barr virus infections after allogeneic stem cell transplantation A comparison between nonmalignant and malignant hematological disorder[J]. Hematology, 2010, 15（5）：344-350.
[4] Chan KH, Gu YL, Ng F, et al. EBV specific antibody-based and DNA-based assays in serologic diagnosis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer, 2003, 105（5）：706-709.
[5] Paramita DK, Fachiroh J, Artama WT, et al. Native early antigen of Epstein-Barr virus a promissing antigen for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma[J]. J Med Virol, 2007, 79（11）：1710-1721.
[6] Dardari R, Hinderer W, Lang D, et al. Antibody responses to recombinant Epstein-Barr virus antigens in nasopharyngeal carcinoma patients：Complementary test of ZEBRA protein and early antigens p54 and p138[J]. J Clin Micro, 2001, 39（9）：3164-3169.
[7] Chan KH, Gu YL, Ng F, et al. EBV specific antibody-based and DNA-based assays in serologic diagnosis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Int J Cancer, 2003, 105（4）：706-709.
[8] Chan JKC, Pilch BZ, Bray F, et al. Nasopharyngeal carcinoma［M] //Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D. World Health Orga-nization Classification of Tumours. Pathology&Genetics. Head and Neck Tumours. Lyon France：IARC-Press, 2005：85-97.
[9] Allen MD, Young LS, Dawson CW. The Epstein-virus encoded LMP2A and LMP2B proteins promote epithelial cell spreading and motility[J]. Virol, 2005, 79（6）：1789-1802.
[10] 伊强, 王文华, 陈丹, 等．以合成肽为抗原建立ELISA试验检测鼻咽癌患者EB病毒抗体的研究[J]．中华肿瘤防治杂志, 2008, 15（8）：610-611．
[11] Hoebe EK, hutajulu SH, VanBeek J, et al. Purified hexameric Epstein-virus encoded BARF1 protein for measuring anti-BARF1 antibody responses in nasopharyngeal carcinoma patients[J]. Clin Vaccine Immunol, 2011, 18（2）：298-304.
[12] Fachiroh J, Stevens SJ, Haryana SM, et al. Combination of Epstein-virus scaffold（BDRF1/VCA-p40）and small capsid protein（BFRF3/VCA-p18）into a single molecule for imprived serodiagnosis of acute and malignant EBV-driven disease[J]. J Virol Methods, 2010, 169（1）, 79-86.
[13] 张毅, 周淑艳, 孙业红, 等．EB病毒融合蛋白 ztaN-p23 在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定[J]．细胞与分子免疫学杂志, 2012, 28（2）：120-123．
[14] 伊强.以原核表达的EB病毒融合蛋白p54-ztaN为抗原建立ELISA方法及其在鼻咽癌诊断中的应用［D] .福建：福建医科大学, 2008．

[1]	梅欢, 李玥, 刘可蒙, 刘吉华. 小檗碱桥酶高效原核表达及生物合成l-SLR的研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 277-287.
[2]	索青青, 吴楠, 杨慧, 李莉, 王锡锋. 水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的原核表达、抗体制备和应用[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 135-141.
[3]	覃雪晶, 王雨涵, 曹一博, 张凌云. 青杄PwHAP5基因原核表达及多克隆抗体制备[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 142-149.
[4]	王光丽, 范婵, 王辉, 卢惠芳, 夏灵尹, 黄健, 闵迅. 霍乱弧菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定[J]. 生物技术通报, 2022, 38(7): 269-277.
[5]	汪巧菊, 胡雨萌, 温亚亚, 宋丽, 孟闯, 潘志明, 焦新安. 新型冠状病毒S1蛋白的表达及活性鉴定[J]. 生物技术通报, 2022, 38(3): 157-163.
[6]	沈俊强, 张莉萍, 于瑞明, 王永录, 潘丽, 刘霞, 刘新生. 猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 生物技术通报, 2022, 38(10): 243-253.
[7]	山草梅, 叶蕾, 张连虎, 况卫刚, 孙晓棠, 马建, 崔汝强. 水稻抗潜根线虫基因OsRAI1的克隆及功能分析[J]. 生物技术通报, 2021, 37(7): 146-155.
[8]	曾福源, 苏泽辉, 周诗慧, 谢妙, 庞欢瑛. 溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 84-91.
[9]	张西西, 张怡青, 李玉林, 韩笑, 王国强, 王晓军, 王旭东, 王云龙. 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白C端重组蛋白的原核表达、纯化及应用[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 92-97.
[10]	白福美, 李至敏, 王小琴, 胡紫微, 鲍玲玲, 李志敏. 集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 98-107.
[11]	瞿欢, 李成, 陈汭, 廖艺杰, 曹三杰, 文翼平, 颜其贵, 黄小波. 猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 273-280.
[12]	彭利忠, 张鹏, 周雯雯, 曾旭辉, 张小宁. 精子特异性蛋白Cabs1多克隆抗体的制备及多用途验证[J]. 生物技术通报, 2021, 37(3): 261-270.
[13]	贺扬, 余巧玲, 王均, 覃川杰, 李华涛. 罗非鱼原核表达基因研究进展[J]. 生物技术通报, 2021, 37(2): 195-202.
[14]	唐禄, 董丽平, 尹茉莉, 刘磊, 董媛, 王会岩. 成纤维细胞生长因子20单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 生物技术通报, 2021, 37(10): 179-185.
[15]	段应策, 胡姿仪, 杨帆, 李金涛, 邬向丽, 张瑞颖. 香菇草酰乙酸水解酶基因LeOAH1克隆及表达分析[J]. 生物技术通报, 2020, 36(9): 227-234.