敏捷食酸菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.027

生物技术通报 ›› 2015, Vol. 31 ›› Issue (1): 181-185.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.027

敏捷食酸菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达

管启旺马江锋贺爱永姜岷宫长斌

（南京工业大学生物与制药工程学院材料与化学工程国家重点实验室，南京 211816）

收稿日期:2014-06-12 出版日期:2015-01-09 发布日期:2015-01-10
作者简介:管启旺，男，硕士，研究方向：工业微生物；E-mail：819468208@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金项目（21076105），国家重点基础研究发展计划（“973”计划）（2009CB724701），江苏高校优势学科建设工程项目

Expression of Nitrilase Gene from Acidovorax facilis in Escherichia coli

Guan Qiwang, Ma Jiangfeng, He Aiyong, Jiang Min, Gong Changbin

（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816）

Received:2014-06-12 Published:2015-01-09 Online:2015-01-10

摘要/Abstract

摘要： 以含有敏捷食酸菌的腈水解酶基因的克隆质粒为模板，通过PCR扩增获得长度为1 080 bp的腈水解酶（Nitrilase）基因片段。使用表达质粒pET-28-a构建表达载体，获得重组质粒pET-Nit。对所表达的基因进行测序对比发现与GenBank所公布的基因序列比较，相似性99%，读码框出现2 bp的突变，但并未引起相应氨基酸突变，故不影响酶的表达与特性。将重组质粒转化到表达宿主Escherichia coli Rosetta（DE3）感受态中，使用诱导剂IPTG对菌株进行诱导表达，获取菌液进行SDS-PAGE分析，得知目的蛋白分子量约为41.28 kD，与预期所想的一致。酶活力分析表明，上清的比活力为3 U/mg。进一步对诱导条件进行优化，包括诱导温度，IPTG浓度，诱导时间等一系列条件。在最优条件下，扩大培养体积，比活力可达15 U/mg，活力提高了5倍左右。

关键词: 腈水解酶, 敏捷食酸菌, 大肠杆菌, 克隆

Abstract: Plasmid containing Acidovorax facilis gene, was used as a template, and length of 1 080 bp nitrilase（Nitrilase）gene fragment was obtained by PCR. Expressed genes were sequenced and compared to gene sequences found in GenBank. There are 2 bp mutation was found, which can not affect the expression and characterization of the enzyme. The recombinant plasmid was transformed into the Escherichia coli Rosetta（DE3）competent cell, which was induced IPTG for strain- expression. SDS-PAGE analysis was used and showed that the protein molecular weight was about 41.28 kD. Enzyme activity analysis showed that the specific activity of the supernatant was 3 U/mg. Induction conditions were optimized, including induction temperature, IPTG concentration, induction time and a series of conditions. Under optimal conditions and with the expansion of the culture volume, the specific activity can up to 15 U/mg, and activity increased by about five times.

Key words: nitrilase, Acidovorax facilis, Escherichia coli, clone

管启旺,马江锋,贺爱永,姜岷,宫长斌,. 敏捷食酸菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达[J]. 生物技术通报, 2015, 31(1): 181-185.

Guan Qiwang, Ma Jiangfeng, He Aiyong, Jiang Min, Gong Changbin. Expression of Nitrilase Gene from Acidovorax facilis in Escherichia coli[J]. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(1): 181-185.

参考文献

[1] 徐建妙, 郑裕国, 沈寅初. 腈水解酶的来源, 结构, 作用机制及其应用[J]. 微生物学通报, 2005, 32（5）：141-146.
[2] Pace HC, Brenner C. The nitrilase superfamily：classification, stru-cture and function[J]. Genome Biol, 2001, 2（1）：1-9.
[3] Gong JS, Lu ZM, Li H, et al. Nitrilases in nitrile biocatalysis: recent progress and forthcoming research[J]. Microb Cell Fact, 2012, 11: 142.
[4] Brenner C. Catalysis in the nitrilase superfamily[J]. Current Opinion in Structural Biology, 2002, 12（6）：775-782.
[5] 何玉财, 许建和. 腈水解酶在羧酸合成中的研究进展[J]. 生物加工过程, 2009, 7（1）：7-12.
[6] Panova A, Mersinger LJ, Liu Q, et al. Chemoenzymatic synthesis of glycolic acid[J]. Advanced Synthesis & Catalysis, 2007, 349（8-9）：1462-1474.
[7] 许建和, 何玉财, 张志钧. 一种产碱杆菌的培养及其于腈水解制备羟基乙酸的方法：中国, CN1011386933A[P] . 2008.
[8] Baum S, van Rantwijk F, Stolz A. Application of a Recombinant Esc-herichia coli whole-cell catalyst expressing hydroxynitrile lyase and nitrilase activities in ionic liquids for the production of（S）-mande-lic acid and（S）-mandeloamide[J]. Advanced Synthesis and Catalysis, 2012, 354（1）：113-122.
[9] 王学东, 李桂南, 李明阳. 浑球红细菌 Rhodobacter sphaeroides LHS-305 腈水解酶基因的克隆及表达[J]. 重庆理工大学学报：自然科学版, 2012, 26（6）：24-28.
[10] Xie Z, Feng J, Garcia E, et al. Cloning and optimization of a nitrilase for the synthesis of（3-S-3-cyano-5-methyl hexanoic acid[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic, 2006, 41（3）：75-80.
[11] 吴中柳, 李祖义. 氰基水解酶在有机合成中的应用[J]. 有机化学, 2001, 21（1）：25-32.
[12] Gavagan JE, DiCosimo R, Eisenberg A, et al. A Gram-negative bacterium producing a heat-stable nitrilase highly active on aliphatic dinitriles[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1999, 52（5）：654-659.
[13] 李宝齐, 邓英杰, 杨静文. 苯酚-次氯酸盐法测定空白脂质体透析液中铵离子浓度[J]. 中国药剂学杂志, 2006（4）：181-185.
[14] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72（1）：248-254.
[15] 罗惠霞, 李敏, 王玉炯. 包涵体蛋白复性的几种方法[J]. 生物技术通报, 2007（5）：96-98.
[16] 李永仙, 郑飞云, 李崎, 等. 重组大肠杆菌 BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl 诱导表达 β-葡聚糖酶的条件优化[J]. 食品与生物技术学报, 2009, 28（2）：250-255.
[17] 何玉财, 周琼, 张跃, 等. 一株烟腈水解酶菌株的筛选及其催化特性初步研究[J]. 化工进展, 2012, 30（12）：2714-2718.
[18] Schmidt RC, Müller A, Hain R, et al. Transgenic tobacco plants expressing the Arabidopsis thaliana nitrilase II enzyme[J]. The Plant Journal, 1996, 9（5）：683-691.
[19] 陈卫, 葛佳佳, 张灏, 等. 半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及 IPTG 诱导条件[J]. 无锡轻工大学学报, 2002, 21（5）：492-495.
[20] 吴一凡, 张双全. 乳糖诱导 pET 载体表达重组蛋白的研究[J]. 南京师大学报：自然科学版, 2002, 25（1）：89-93.
[21] Chauhan S, Wu S, Blumerman S, et al. Purification, cloning, seque-ncing and over-expression in Escherichia coli of a regioselective aliphatic nitrilase from Acidovorax facilis 72W[J]. Applied Micro-biology and Biotechnology, 2003, 61（2）：118-122.

敏捷食酸菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达

Expression of Nitrilase Gene from Acidovorax facilis in Escherichia coli

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	吕秋谕, 孙培媛, 冉彬, 王佳蕊, 陈庆富, 李洪有. 苦荞转录因子基因FtbHLH3的克隆、亚细胞定位及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 194-203.
[2]	王佳蕊, 孙培媛, 柯瑾, 冉彬, 李洪有. 苦荞糖基转移酶基因FtUGT143的克隆及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 204-212.
[3]	孙明慧, 吴琼, 刘丹丹, 焦小雨, 王文杰. 茶树CsTMFs的克隆与表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 151-159.
[4]	陈彩萍, 任昊, 龙腾飞, 何冰, 鲁兆祥, 孙坚. 大肠杆菌Nissle 1917对炎症性肠病治疗作用的研究进展[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 109-118.
[5]	郭三保, 宋美玲, 李灵心, 尧子钊, 桂明明, 黄胜和. 斑地锦查尔酮合酶基因及启动子的克隆与分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 148-156.
[6]	杨俊钊, 张新蕊, 赵国柱, 郑菲. 新型GH5家族多结构域纤维素酶的结构与功能研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 71-80.
[7]	刘思佳, 王浩楠, 付宇辰, 闫文欣, 胡增辉, 冷平生. ‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(3): 196-205.
[8]	陈楚雯, 李洁, 赵瑞鹏, 刘媛, 吴锦波, 李志雄. 藏鸡GPX3基因的克隆、组织表达谱研究及功能预测[J]. 生物技术通报, 2023, 39(3): 311-320.
[9]	唐瑞琪, 赵心清, 朱笃, 汪涯. 大肠杆菌对木质纤维素水解液抑制物的胁迫耐受性[J]. 生物技术通报, 2023, 39(11): 205-216.
[10]	杨旭妍, 赵爽, 马天意, 白玉, 王玉书. 三个甘蓝WRKY基因的克隆及其对非生物胁迫的表达[J]. 生物技术通报, 2023, 39(11): 261-269.
[11]	侯瑞泽, 鲍悦, 陈启亮, 毛桂玲, 韦博霖, 侯雷平, 李梅兰. 普通白菜PRR5的克隆、表达及功能验证[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 128-135.
[12]	杨敏, 龙雨青, 曾娟, 曾梅, 周新茹, 王玲, 付学森, 周日宝, 刘湘丹. 灰毡毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因克隆及功能研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 256-267.
[13]	郭文博, 路杨, 隋丽, 赵宇, 邹晓威, 张正坤, 李启云. 球孢白僵菌真菌病毒BbPmV-4外壳蛋白多克隆抗体制备及应用[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 58-67.
[14]	李仁瀚, 张乐乐, 刘春立, 刘秀霞, 白仲虎, 杨艳坤, 李业. 基于紫色杆菌素生物合成途径的L-色氨酸生物传感器的构建[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 80-92.
[15]	陈光, 李佳, 杜瑞英, 王旭. 水稻盐敏感突变体ss2的鉴定与基因功能分析[J]. 生物技术通报, 2022, 38(9): 158-166.