生物技术通报

植物逆境胁迫相关miRNA研究进展

王维,张玉娟,陈洁,刘聚波,夏民旋,沈法富

2015, 31(1): 1-10. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.001

摘要 ( 450 )

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MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性小分子的非编码RNA，它通过对其靶基因mRNA的降解或抑制翻译来调控基因表达，进而参与调控植物相关生理活动。在逆境胁迫下，植物中的一些miRNA通过迅速表达并作用于某些与逆境相关的基因，以启动植物的某些抗逆信号系统，进而提高植物对不良环境的适应能力。就miRNA的产生、作用方式、研究方法及其在植物在逆境胁迫中的抗逆作用机制研究进行了综述，并对植物miRNA的研究发展趋势进行了展望。

泛素连接酶-底物选择关系的研究进展

李杨,李栋

2015, 31(1): 11-20. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.002

摘要 ( 505 )

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泛素是一种包含76个氨基酸的小分子蛋白。泛素共价结合到底物的过程称为泛素化修饰。泛素化修饰过程是一个由级联的泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶所介导的复杂过程，泛素化修饰具有高效、ATP依赖、高度特异的特点。泛素化修饰与细胞周期调控、细胞凋亡、转录调控、DNA损伤修复等一系列生物学过程密切相关。在泛素化修饰过程中，泛素连接酶对底物的识别，是决定泛素化修饰特异性的关键环节。泛素连接酶底物识别的相关机制研究不断被报道，鉴定泛素连接酶底物的高通量方法也在不断的改进和发展。随着实验研究的不断深入，实验数据的不断产出，利用生物信息学进行泛素连接酶底物的研究也开始受到关注。对泛素连接酶识别底物的相关机制、高通量泛素连接酶底物的鉴定方法、泛素连接酶底物的生物信息学研究和生物信息学在泛素连接酶底物研究中的发展方向进行讨论。

原核细胞精氨酸生物合成途径的研究进展

闫洪波,王威,李令娣,安万昌

2015, 31(1): 21-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.003

摘要 ( 429 )

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原核生物的精氨酸生物合成包含8个酶系，起始于乙酰谷氨酸激酶催化的谷氨酸的乙酰化。到第五步乙酰基团脱离，乙酰谷氨酸通过3个酶的作用，进一步合成乙酰化中间产物。鸟氨酸被氨甲酰基化生成瓜氨酸，天冬氨酸介入后形成精氨琥珀酸，最后形成终产物精氨酸。主要就精氨酸生物合成途径、合成过程中主要酶系及反馈抑制蛋白的作用机制进行了概述。此外，提出了目前精氨酸代谢研究中存在的问题及未来的研究方向。

EZH2作为抗肿瘤免疫治疗靶点研究进展

李倩,王艳林,

2015, 31(1): 29-32. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.004

摘要 ( 376 )

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多梳蛋白复合体（PcG）的核心亚基zeste基因增强子同源物2（Enhancer of zeste homolog2，EZH2）是一种组蛋白甲基转移酶，参与维持细胞密度、干细胞多能性、细胞周期调节等重要的生理作用。研究发现，EZH2在多种肿瘤组织中高表达，是促进肿瘤发生和发展的致癌因子。由于EZH2在正常组织中低表达或者不表达，使其新近被鉴定为一种肿瘤相关抗原。已经在EZH2蛋白分子中鉴定出多条特异性抗原肽，这些抗原肽能激发机体免疫细胞对EZH2表达异常增高肿瘤细胞的杀伤活性。上述研究提示，EZH2可能是一种新的抗肿瘤治疗分子靶点，并在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值。就该领域的最新研究进展作一简要综述。

细菌群体感应及其在病原菌防治中的应用

梁心琰,阮海华

2015, 31(1): 33-38. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.005

摘要 ( 435 )

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细菌分泌一种或多种化学信号分子，这些化学信号分子作为诱导因子感知和判断菌群密度和周围环境的变化。当菌群达到一定阈值时会启动一系列相关基因的表达以调控菌体的群体行为，细菌的这种生理行为称为群体感应。大量的研究表明，不同类型的细菌具有不同的群体感应系统。群体感应机制广泛存在于病原菌中，并与其侵染过程、毒力基因表达及致病性密切相关。利用这种群体感应机制作为靶点进行病原菌的防治是医学领域广泛关注的问题。在此就细菌群体感应及其在病原菌防治中的应用进行阐述。

固相反硝化系统中微生物群落结构的研究进展

张兰河,左正艳,王旭明

2015, 31(1): 39-45. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.006

摘要 ( 374 )

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固相反硝化是一种新型的异养反硝化工艺，采用固体有机物同时作为反硝化微生物的碳源和生物膜载体，可用于地下水和低C/N比污水的脱氮处理。固相反硝化系统生物膜的微生物群落结构决定固体碳源的降解效率，进而决定反硝化脱氮的速率和系统的稳定运行。因此，微生物群落结构的研究对于固相反硝化工艺的优化以及反应机理的解析具有重要意义。对不同固相反硝化系统微生物群落结构的研究现状和进展进行了综述，并探讨了当前研究中存在的问题和发展趋势。

哺乳动物基因组印记的研究进展

陈秀莉,马利兵

2015, 31(1): 46-50. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.007

摘要 ( 467 )

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基因组印记是由亲本来源不同而导致等位基因表达差异的一种遗传现象。基因组印记产生的原因及过程是现代遗传学的一个热点问题。哺乳动物的许多基因组印记特征都使其成为后基因组时代的一个热点生物学问题。进化的基因组印记在哺乳动物生殖、发育中起到了特定的作用。综述了基因组印记的特点、印记基因的印记机理、基因印记与克隆动物的发育、印记基因与疾病的研究进展。

植物非生物胁迫相关转录因子研究方法

宿明星,孙颖颢,施鹤,李秋莉

2015, 31(1): 51-60. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.008

摘要 ( 425 )

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转录因子是一类能够与启动子区域顺式作用元件特异性结合的蛋白质，是一大类转录调控因子，也是植物中最大的基因家族之一。转录因子可以调节众多下游基因的表达，对植物的生长发育、形态建成、激素调节，以及抵抗多种生物和非生物胁迫具有重要作用。结合近年来转录因子的研究进展，归纳总结了植物非生物胁迫相关转录因子研究的主要策略和方法，包括转录因子结构域、亚细胞定位、转录激活作用、转录因子复合体以及转录因子功能的研究，为植物转录因子的相关研究提供理论和方法的参考。

蛋白质胶内酶切技术研究进展

姜超,张学文,潘映红

2015, 31(1): 61-66. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.009

摘要 ( 566 )

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胶内酶切是蛋白质组研究中衔接电泳分离和质谱鉴定的重要环节，对最终的蛋白质定性和定量分析结果有显著的影响。该技术自1992年初步建立以来，一直处于不断完善中，出现了种类繁多的改进方案。为了更有效地利用胶内酶切技术，从凝胶脱色、杂质去除、蛋白酶切、肽段提取4个方面归纳整理了近年来蛋白质胶内酶切技术的主要研究进展。

基于信号放大技术的适体生物传感器研究进展

薛茗月,覃英凤,李健,叶高杰,湛志华

2015, 31(1): 67-72. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.010

摘要 ( 338 )

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信号放大技术因其能实现低浓度分子检测，灵敏度高而在多个研究领域发展非常迅速。而适体作为识别分子已成功应用于多种生物传感器平台，在医疗诊断、环境检测、生化分析中显示出良好的应用前景。近年来，以适体为识别元件的生物传感器越来越受到人们的关注。综述了近3年来基于信号放大技术的适体生物传感器研究新发展。

鹌鹑肠道微生物PCR-DGGE方法的优化

张振华,鲍王波,余冉,王长永,刘燕

2015, 31(1): 73-78. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.011

摘要 ( 359 )

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通过对鹌鹑肠道微生物总DNA不同提取方法的效率进行比较，探讨DNA质量以及PCR-DGGE反应条件对研究鹌鹑肠道微生物多样性的影响。本试验利用常规的饱和苯酚/氯仿法和3种试剂盒（QIAGEN试剂盒、上海生工试剂盒、天根试剂盒）方法提取鹌鹑肠道微生物总DNA，分别以细菌V3可变区引物和V6-V8可变区引物以及不同退火温度进行PCR-DGGE分析。QIAGEN试剂盒法提取的肠道微生物总DNA的 A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8-1.9之间，浓度约200 ng/μL，DGGE微生物多样性条带均匀度均高于其他3种提取方法。此外，利用不同引物扩增的DGGE图谱发现，以V6-V8可变区引物扩增的DGGE图谱条带均匀，分离充分，较V3可变区更能反映鹌鹑肠道微生物种群的多样性；同时，随PCR退火温度的升高，V6-V8可变区的微生物多样性指数下降，V3可变区的微生物多样性则无明显变化。

响应面法优化香菇多糖的超声辅助提取工艺

万阅,齐计英,曾红,韩阳,韩静

2015, 31(1): 79-85. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.012

摘要 ( 415 )

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为了开发利用香菇资源，采用超声辅助法提取香菇中的多糖，利用响应面法优化超声辅助提取法提取香菇多糖的工艺条件。首先进行单因素试验考察，在单因素试验的基础上，选择超声波功率、超声时间及料液比为自变量，以多糖得率为响应值，采用Box-Benhnken法设计3因素3水平响应面设计试验。结果表明，响应面模型与实际情况拟合良好，能较好地预测香菇多糖得率。最佳工艺：超声波功率300 W、超声波处理时间25 min、料液比1: 30，多糖得率25.71%，与理论值（25.55%）相比，相对误差较小，为0.63%。与传统热水浸提法比较，超声波提取法多糖得率较高，且耗时少，是理想的香菇多糖提取方法。

茶树芽叶紫化的生理生化分析及其关键酶基因的表达

周琼琼,孙威江

2015, 31(1): 86-91. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.013

摘要 ( 379 )

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从生理生化和分子水平方面比较了茶树紫化芽叶与成熟绿色叶片的差异。结果表明，紫色幼嫩新梢中茶多酚、儿茶素总量、咖啡碱含量高于成熟绿色叶片，差异达到极显著。光合色素中，成熟绿叶样品中叶绿素及叶绿素a、b的含量、类胡萝卜素的含量极显著高于幼嫩紫叶样品，花青素含量极显著低于幼嫩紫叶；在研究的9个花青素合成途径关键酶基因中，实时荧光定量PCR分析表明，PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS在幼嫩紫叶中均呈上调表达，从而促进花青素的合成，使芽叶呈现紫色。

甘蔗转基因甘露糖筛选系统的建立

王文治,杨本鹏,蔡文伟,冯翠莲,王俊刚,熊国如,张树珍

2015, 31(1): 92-97. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.014

摘要 ( 389 )

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以甘露糖作为筛选底物，对甘蔗品种新台糖22号进行临界筛选浓度测定，获得愈伤组织的继代、分化、生根的临界筛选浓度。而后应用含有甘露糖筛选标记基因pmi及绿色荧光蛋白报告基因GFP的植物表达载体，通过农杆菌介导法对新台糖22号的愈伤组织进行遗传转化。用所测定的临界筛选浓度先后进行继代、分化、生根筛选培养，获得抗性植株。对获得的抗性植株分别进行pmi基因和GFP基因的PCR检测，以及GFP显微镜荧光检测，结果证实已成功建立了高效的甘蔗转基因甘露糖筛选系统。

乌腺金丝桃愈伤组织中总黄酮及金丝桃素含量测定

刘晓丹,张克勤,刘连,李文昌,

2015, 31(1): 98-103. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.015

摘要 ( 352 )

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以乌腺金丝桃新鲜叶片为材料，建立稳定的乌腺金丝桃愈伤组织的培养体系，进一步对愈伤组织总黄酮与金丝桃素的含量进行测定。以MS为基础培养基，考察不同激素组合对愈伤组织诱导的影响。结果表明，乌腺金丝桃诱导愈伤组织的最佳培养基为MS + 2，4-D 4.0 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L；采用超声波法提取乌腺金丝桃愈伤组织中的总黄酮和金丝桃素，分别采用紫外分光光度法和HPLC 法测定乌腺金丝桃愈伤组织中总黄酮及金丝桃素的含量，结果表明，干燥乌腺金丝桃愈伤组织中总黄酮含量为 27.99 mg/g，金丝桃素的含量为 0.515 mg/g。

鹰嘴豆蛋白降解产物的抗氧化作用

陈晓飞,孙玉飞,冯菲,王雪妍,周伏忠

2015, 31(1): 104-108. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.016

摘要 ( 433 )

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旨在分析鹰嘴豆分离蛋白（CPI）及其不同分子量短肽的抗氧化活性。用碱性蛋白酶（Alcalase）处理CPI，得到其降解产物，该降解产物经超滤离心，得到分子量分别为<3 kD、3-5 kD、5-10 kD及>10 kD的短肽。结果表明，与其它大分子肽段相比，<3 kD的短肽具有较强的自由基清除活性；与谷胱甘肽（GSH）相比，CPI及其不同分子量短肽具有显著的金属离子螯合活性；CPI及其肽段具有一定的三价铁离子还原能力。上述结果表明，CPI及其肽段的显著抗氧化活性，使得其具有制备抗氧化功能食品和保健品的应用前景。

观叶福禄桐遗传多样性的ISSR分析

张国武,刘学锋,周兴华,黄涛

2015, 31(1): 109-114. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.017

摘要 ( 425 )

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利用ISSR分子标记对9个观叶福禄桐品种进行遗传多样性和亲缘关系分析，从100条引物中筛选出9条稳定、多态性高的引物用于PCR扩增，共获得70条带，其中多态性条带61条，多态百分率为87.14%。聚类结果显示，品种间相似性系数为0.346 9-0.816 3，聚类结果与品种间的地理来源紧密相关，从外观形态上比较，亲缘性较近的叶形和株型相似性较高；观叶福禄桐各品种间基因型差异较小，亲缘关系较近，遗传基础相对较窄。

烟草远缘杂种合子中父本特异表达基因EB30的克隆与分析

,罗岸

2015, 31(1): 115-121. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.018

摘要 ( 310 )

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已知烟草远缘杂种的合子中EB30基因（EST序列号EB426694）的表达具有父本特异性。参考NCBI的EST序列设计引物，克隆得到该基因的CDS序列，并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。使用染色体步移和hiTAIR-PCR技术获取EB30基因的5'侧翼序列（启动子和5' UTR）。构建由该基因5'侧翼序列驱动的EB30-EGFP融合蛋白表达载体并转化烟草。结果表明，EB30蛋白由211个氨基酸组成，蛋白分子量为22.616 2 kD，等电点pI 为5.63。该蛋白具有亲水性，可能定位于线粒体中。烟草EB30蛋白与同属茄科的番茄和马铃薯的蛋白序列相似度最高，约为73%。不同物种的同源蛋白的N端和C端都具有一段较为保守的序列区段。观察转基因植株合子和二胞原胚能检测到较强荧光，证实所获EB30基因的5'侧翼序列在早期胚胎发生时期具有启动子活性。

cryIAc基因在转基因玉米中的遗传规律及对抗虫性影响

王建军,杨慧珍,刘佼

2015, 31(1): 122-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.019

摘要 ( 343 )

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旨在研究目的基因在转基因植株和后代植株（株系）中的遗传规律及其对转化植株抗虫性的影响。以花粉介导法将cryIAc基因导入玉米自交系‘郑58’和‘昌7-2’，对转化植株及其后代株系进行分子检测和田间抗虫鉴定。结果表明：（1）转化‘郑58’和‘昌7-2’，T₁代分别获得转基因植株24和41个，转化率高达20%以上；（2）转基因T₂代、杂交F₂代及回交1代（B₁）的分子检测结果证明，外源基因的遗传符合孟德尔的3: 1、3: 1和1: 1的遗传分离规律；（3）连续多带的分子检测结果还表明，外源基因可稳定遗传并有效表达，表达水平在9.8-14.3 ng/g叶片鲜重之间；（4）抗虫鉴定结果显示，在阴性对照全部感虫情形下，转基因纯合株系仍表现出较高抗虫活性；（5）此外，回交试验结果还证明外源基因通过杂交可传递给下一代；（6）最终经筛选得到SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007五个高抗虫转基因株系。结果表明,花粉介导法是一种高效、快捷的转化方法，cryIAc基因导入玉米自交系植株后赋予和提高了转基因植株的抗虫活性。

绿色木霉TvALP-linker-TvRBL融合基因的构建与原核表达

徐杨玉,温世杰,李海芬,李玲,梁炫强,

2015, 31(1): 131-137. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.020

摘要 ( 341 )

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在TvALP基因和TvRBL基因间加入一段柔性链接头（linker）基因序列，构建融合基因。生物信息学分析表明该融合基因含有一段信号肽序列。利用RT-PCR技术从绿色木霉菌丝体总RNA中扩增出TvRBL基因、TvALP基因和去除信号肽的?TvALP基因，分别克隆到原核表达载体pET30a，构建重组质粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL和pET30a-?TvALP-linker-TvRBL，转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明，去除信号肽的表达质粒pET30a-?TvALP-linker-TvRBL在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中获得了表达，在60 kD处有一条蛋白质特异条带，与预测的目的产物蛋白条带大小一致。

一株拮抗链霉菌的鉴定及其多相分类特征

焦林培金,黄运红,李素珍,龙中儿

2015, 31(1): 138-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.021

摘要 ( 352 )

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通过16S rRNA基因序列分析一株拮抗放线菌JXNU03的系统发育关系，通过生理生化试验分析其生理生化特征，利用菌丝生长率法和杯碟法测定其拮抗活性。结果发现，放线菌JXNU03在高氏一号培养基上培养时，基内菌丝发达，分支多且不断裂，气生菌丝发育良好，孢子丝直形或螺旋状，孢子表面带刺，细胞水解液中检测到葡萄糖，未检测出特征性糖，糖类型属于C型，细胞壁氨基酸中含有L，L-DAP，属于细胞壁Ⅰ型，16S rRNA基因序列与灭癌素链霉菌的同源性高达98%，其发酵液对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母菌和霉菌等都具有较强的拮抗作用。因此放线菌JXNU03被鉴定为灭癌素链霉菌，记为灭癌素链霉菌JXNU03（Streptomyes gancidicus JXNU03），是一株对细菌、酵母菌和霉菌均有较强拮抗活性的链霉菌，具有潜在开发价值。

高产耐高温脂肪酶生产菌的筛选与鉴定

李杨,蔡海莺,赵敏洁,张辉,冯凤琴

2015, 31(1): 144-150. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.022

摘要 ( 420 )

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从小笼包蒸屉垫中筛选得到了两株脂肪酶高产菌株J2和J3，经形态观察以及26S rRNA基因（26S rDNA）序列比对鉴定，两株菌分别属于Aureobasidium 属的两个变体。200 r/min、30℃下摇瓶发酵3-5 d后，以对硝基苯酚棕榈酸酯（p-NPP）作为底物，用分光光度法测得J2和J3发酵上清液中的脂肪酶酶活分别为10.61 U/mL和14.43 U/mL。对两株菌所产脂肪酶的耐热特性研究显示，菌株J2产脂肪酶的最适反应温度为50℃，并且酶液在50℃保温5 h无酶活损失；另一株菌J3所产脂肪酶的最适反应温度为60℃，酶液在50℃保温5 h后酶活剩余42.19%，在40℃保温5 h没有酶活损失。这表明J2和J3菌株所产脂肪酶具有较好的热稳定性和较高的最适反应温度。

耐盐碱石油烃降解菌的筛选、鉴定及其耐盐碱性研究

张海荣,唐景春,孙克静,张清敏

2015, 31(1): 151-159. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.023

摘要 ( 345 )

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从大港油田区石油污染盐碱化土壤和油泥中筛选得到10株耐盐碱石油烃降解菌，通过形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析确定这些菌株为苍白杆菌属、葡萄球菌属、迪茨菌属、棒状杆菌属、无色杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属。通过液体培养试验，研究了10株菌的耐盐碱能力。结果表明，除B07仅能耐受3%盐度外，其他菌株均能耐受5%或者更高的盐度环境，其中B02和B05在盐度高达11%时仍具有较高的生长活性；10株菌均能耐受pH为9的碱度环境，B01、B03、B04、B06、B09能耐受pH为10的环境，其中，B03和B04在pH为11时仍具有较高的生长活性。研究表明石油烃降解菌在不同微生物种属中广泛存在，并具有较好的耐盐碱特性，有望在石油污染盐碱化土壤修复中广泛应用。

海洋细菌 Agarivorans sp.HZ105的琼胶降解酶系

林伯坤,陆国永,宋燕,谢锐权,陈鸿霖,胡忠

2015, 31(1): 160-166. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.024

摘要 ( 336 )

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通过克隆得到菌株Agarivorans sp. HZ105中3个琼胶酶基因，长度分别为2 988 bp、1 437 bp和1 362 bp，分别编码琼胶酶HZ1、HZ3和HZ4，分别属于糖苷水解酶GH50、GH118和GH16家族。将这些琼胶酶基因与质粒pET-32（a）构建重组表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），实现了琼胶酶基因的重组原核表达，制备了重组酶，研究了琼胶酶的酶解产物。琼胶酶HZ1降解琼脂糖以及高聚合度新琼寡糖（聚合度为8、10、12和14）得到新琼二糖和新琼四糖；琼胶酶HZ3降解琼脂糖的终产物是高聚合度新琼寡糖；琼胶酶HZ4降解琼脂糖和高聚合度新琼寡糖为新琼四糖和新琼六糖。因此推测菌株HZ105主要先用琼胶酶HZ3和HZ4降解琼脂糖为较高聚合度的新琼寡糖，随后这些寡糖被琼胶酶HZ1和HZ2（课题组先前报道的另一个琼胶酶）降解为低聚合度新琼寡糖。首次研究报道了Agarivorans属中能产生4个琼胶酶的细菌菌株及其琼胶降解酶系，丰富了有关细菌降解琼胶酶体系及其中各琼胶酶作用的研究和认识，也有利于菌株HZ105琼胶酶的有效开发应用。

丹参根腐病生防芽孢杆菌2-1海藻菌剂的研制

周莹,袁孟娟,韩军,陈芳

2015, 31(1): 167-172. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.025

摘要 ( 331 )

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以海藻渣为载体，菌种为丹参根腐病生防菌：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis2-1（已保存CGMCC No.9256），研制成的海藻菌剂兼具营养及生物防治功能，同时菌剂的基本指标符合农用微生物菌剂产品的技术指标。用物理方法选择菌种发酵液与海藻渣混合的最佳配比，结合农用微生物菌剂产品质量检测方法对菌剂中有效活菌数、含水量、pH值及有效期进行测定，并进行大田试验，测试生防效果。菌剂有效活菌数为2.32×10⁹/g，含水量为6.75%，pH值为6.7，常温下有效期约为11.6个月，均符合颗粒菌剂的技术指标，大田试验中根腐病的发病率比空白对照组降低37.6%，生防效果较为显著。

一株高效四环素降解菌的分离鉴定及其降解性能研究

张欣阳,蔡婷静,许旭萍

2015, 31(1): 173-180. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.026

摘要 ( 484 )

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四环素类抗生素在畜牧养殖业中广泛使用，但其结构复杂，难降解，容易在水环境中积蓄，进而对生态环境产生深远影响，许多国家已将抗生素污染列为重要的环境问题展开了相关的基础研究。近年来利用微生物降解环境中的抗生素污染物成为研究热点。采用选择性培养基，从某制药厂排污口的水样中分离筛选到1株具有较高降解四环素能力的菌株4002，经形态观察、生理生化测定和16S rDNA序列分析，将该菌初步鉴定为Advenella sp.。从pH、溶氧量、无机盐等方面对菌株降解四环素的性能进行研究。结果表明，该菌株降解四环素的适宜pH为7.0，在有氧条件下，30℃，150 r/min振荡培养6 d，可使初始浓度为50 μg/mL四环素降解率达57.8%。无机盐对降解率有显著影响，添加FeSO₄和MnSO₄对四环素降解有促进作用，MgSO₄影响不大，CaSO₄则有抑制作用。在培养至第8天时，培养液经HPLC检测显示6.022 min处出现新的吸收峰，推测为降解产物。

敏捷食酸菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达

管启旺,马江锋,贺爱永,姜岷,宫长斌,

2015, 31(1): 181-185. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.027

摘要 ( 357 )

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以含有敏捷食酸菌的腈水解酶基因的克隆质粒为模板，通过PCR扩增获得长度为1 080 bp的腈水解酶（Nitrilase）基因片段。使用表达质粒pET-28-a构建表达载体，获得重组质粒pET-Nit。对所表达的基因进行测序对比发现与GenBank所公布的基因序列比较，相似性99%，读码框出现2 bp的突变，但并未引起相应氨基酸突变，故不影响酶的表达与特性。将重组质粒转化到表达宿主Escherichia coli Rosetta（DE3）感受态中，使用诱导剂IPTG对菌株进行诱导表达，获取菌液进行SDS-PAGE分析，得知目的蛋白分子量约为41.28 kD，与预期所想的一致。酶活力分析表明，上清的比活力为3 U/mg。进一步对诱导条件进行优化，包括诱导温度，IPTG浓度，诱导时间等一系列条件。在最优条件下，扩大培养体积，比活力可达15 U/mg，活力提高了5倍左右。

重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

郑娟,郭怀祖,李晶,段树燕,赵自叶,张大鹏,郭尚敬,王皓

2015, 31(1): 186-192. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.028

摘要 ( 622 )

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蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶，能选择性切割天冬氨酸的N端肽键，广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌，产量低，制备困难，成本高，极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶AspN所对应的基因克隆入表达载体pET32a，导入E.coli BL21（DE3），首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达，亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe（NO2）-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶AspN具有与标准品基本一致的酶切活性，能够较好地应用于生物和制药领域。

甲胎蛋白的原核表达及复性优化

才蕾,矫丽媛,王继华,唐时幸

2015, 31(1): 193-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.029

摘要 ( 399 )

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构建甲胎蛋白的原核表达载体pET32a-AFP，对包涵体形式表达的甲胎蛋白进行复性优化。将构建的重组质粒pET32a-AFP转化入E.coli，IPTG诱导表达后，经亲和层析纯化获得AFP包涵体，通过对复性过程、pH、添加剂等的研究摸索，获得最佳复性条件。当采用添加0.5 mol/L L-精氨酸的一步法透析复性方法，且透析液pH值为8.5，重组人AFP包涵体蛋白起始浓度为1.0 mg/mL时，复性效率最高。该复性方法获得蛋白质具有较高的回收率且操作简便。

脑心肌炎病毒VP1蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

谢晶莹,冯若飞,徐雷,张海霞,李向茸,侯兰新,马忠仁,

2015, 31(1): 198-202. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.030

摘要 ( 442 )

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为筛选与脑心肌炎病毒VP1蛋白相互作用的靶细胞cDNA文库蛋白，构建VP1蛋白的诱饵载体pDHB1-VP1。扩增EMCV的VP1基因并克隆至pMD18-T载体中，经测序验证正确后定向克隆至酵母双杂交诱饵载体pDHB1。将重组pDHB1-VP1载体进行酶切验证和测序分析，并转化酵母报告菌株NMY51，检测其在酵母细胞中有无表达和自激活作用。结果表明，构建的pDHB1-VP1基因可以在酵母细胞中正确表达，产物大小约66 kD，而且可以与兔抗EMCV血清发生特异性结合，有较好免疫原性。成功构建了诱饵载体pDHB1-VP1，可以在酵母细胞中表达且其对报告基因无自激活作用，可以应用于酵母双杂交筛选试验中。

细胞密度和营养供给对H1N1流感病毒产率的影响

孔文刚,黄锭,罗剑,周琳婷,陈则,刘旭平,谭文松,邓献存,

2015, 31(1): 203-208. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.031

摘要 ( 333 )

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探究细胞培养生产流感病毒过程中，高细胞密度引起低单位细胞病毒产率（Svy）的原因及找到解决方法。通过增加微载体浓度以及换液操作获得较高的细胞密度；考察了感染时细胞密度（CCI）和病毒感染用维持培养基对病毒产量和单位细胞病毒产率的影响。在12.6 g/L微载体培养过程中，通过换液操作，可获得高细胞密度，达到1.47×10⁷cells/mL。在CCI为1×10⁷cells/mL条件时，选择合适的维持培养基，其Svy最高达到5.14×10³ virions/cell，比同等条件下用DMEM维持培养基的Svy值提高了近一倍。高密度培养MDCK细胞生产流感病毒时，充分考虑不同阶段的培养条件和营养需求，可以提高细胞密度和单位细胞病毒产率，进而提高流感病毒的产量。该研究结果为工业化生产流感病毒疫苗提供了基础数据。

停乳链球菌对日本沼虾总超氧化物歧化酶活性的影响

赵卫红,,张凤英,,於叶兵,,王资生,,齐志涛

2015, 31(1): 209-213. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.032

摘要 ( 295 )

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对健康的日本沼虾（1.40 ± 0.12）g分别肌肉注射0.6 × 10⁶、2 × 10⁶、4 × 10⁶、6 × 10⁶ CFU/mL的停乳链球菌菌液10 μL，注射后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、5 d、10 d分别采集肝胰腺、肌肉和鳃组织，测定其中的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性，研究停乳链球菌对日本沼虾T-SOD活性的影响。研究结果显示，肝胰腺中T-SOD活性于注射5 d后达到最大值（P < 0.05），10 d后0.6 × 10⁶、2 × 10⁶和4 × 10⁶CFU/mL组T-SOD活性下降并接近对照组水平，而最高浓度组（6 × 10⁶ CFU/mL）T-SOD酶活性仅有对照组的46%。肌肉和鳃中T-SOD活性均在注射6 h后达到最大值，注射10 d后，4 × 10⁶和6 × 10⁶ CFU/mL组的肌肉和6 × 10⁶ CFU/mL组的鳃组织中T-SOD活性均仅有对照组的50%左右。另外，肌肉组织中T-SOD的峰值远高于鳃和肝胰腺组织中的峰值。上述结果表明，停乳链球菌不仅影响日本沼虾机体T-SOD酶的活性，而且肌肉、鳃和肝胰腺组织中酶的活性应答时间不同，且组织内酶活性的应答与菌的感染方式有关，另外，注射高浓度停乳链球菌长时间后会降低其组织中T-SOD酶活性。

Xist基因抑制对牛SCNT早期胚胎发育的影响

刘黎明,,孙伟,,张金吨,,赵丽霞,,李树裕,,,王标,,陈杨林,,胡树香,,吴宝江,,李喜和

2015, 31(1): 214-219. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.033

摘要 ( 351 )

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Xist是与X染色体失活相关的非编码基因，它在合子期基因组开始表达，是胚胎发育早期表达的第一个印记基因。探讨了特异性抑制Xist的TALER-REPRESSOR（TALER）载体转染到胎牛成纤维细胞对Xist基因的抑制作用，并以抑制Xist基因表达的细胞作为核供体制作克隆胚胎，研究Xist基因抑制对牛克隆胚早期发育的影响。结果显示，与对照组细胞相比，TALER载体将Xist相对表达量下调了93.85%，说明本试验设计的载体转染系统能够有效抑制Xist基因的表达。选取Xist抑制表达阳性的转染细胞用于体细胞核移植试验，克隆胚胎发育结果显示，试验组和对照组的卵裂率、8细胞发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率分别为78.8% vs 75.1%（P>0.05，无显著差异）、54.4% vs 50.6%（P>0.05，无显著差异）、12.3% vs 27.8%（P<0.01，差异极显著）、0 vs 26.6%（P<0.01，差异极显著）。综上所述，试实验设计的特异性抑制Xist表达的TALER载体可有效抑制雌性胎牛成纤维细胞中Xist的表达。供体细胞Xist这种基因下调可使克隆胚胎2-8细胞率略有提升，但囊胚期和桑葚胚率明显降低。因此，其机制尚待于进一步探讨。

嗜吞噬细胞无形体msp4蛋白的生物信息学分析及表达鉴定

赵庆亮,杨素芳,梁田,张殿卿,杨霞,盛金良

2015, 31(1): 220-224. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.034

摘要 ( 344 )

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分析预测嗜吞噬细胞无形体msp4蛋白的抗原性，对嗜吞噬细胞无形体的msp4蛋白采用生物信息学对其进行分析二级结构，亲水性，疏水性，B细胞线性表位；根据分析的优势抗原表位区，进行基因合成并亚克隆至pET32a表达载体，在大肠埃希菌中获得重组蛋白。生物信息学分析结果显示msp4蛋白由283个氨基酸组成，分子量为29.8 ku，理论等电点为6.05，不稳定系数为32.79，总平均疏水性为0.063；二级结构预测msp4蛋白主要以无规卷曲、延伸链、α-螺旋为主；B细胞表位预测msp4蛋白有14个线性表位；根据分析的结果选取msp4蛋白亲水性高的膜外区的28-158位序列克隆至pET32a进行原核表达，在34 ku出有目的蛋白的表达。成功对嗜吞噬细胞无形体的msp4蛋白原核表达及纯化，为无形体病血清学检测方法的建立奠定了物质基础。

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