生物技术通报

宏基因组样本数据的分析比较与分类

程福东, 丁啸, 李晟, 孙啸

2016, 32(5): 1-10. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.001

摘要 ( 348 )

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宏基因组学研究试图通过测序并分析微生物群落的DNA序列，以理解环境微生物的组成及其与环境的交互作用。宏基因组学革命性地改变了微生物学，使得以免培养的方式研究复杂生物系统中的微生物群落成为可能。第二代测序技术的不断进步和生物信息学的高速发展促进了高通量宏基因组研究的发展，大批高质量的宏基因组数据不断产生并对科学界开放，宏基因组学的重要作用被科学界广泛认可。与此同时，对应个体不同健康状态和人体不同部位的大量宏基因组样本数据不断产生，使得比较和分类宏基因组样本在微生物学研究上变得更加重要，比较宏基因组学成为宏基因组学的重要分支。主要介绍了宏基因组数据的分析比较，以及样本分类的相关研究和算法。

垃圾填埋场甲烷氧化菌及甲烷减排的研究进展

王晓琳, 曹爱新, 周传斌, 赵恺凝, 赵国柱

2016, 32(5): 16-25. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.003

摘要 ( 260 )

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垃圾填埋场是全球最重要的人为甲烷排放源之一，其全球年甲烷释放量为35-69 Tg，垃圾填埋场甲烷减排是目前全球温室气体研究的热点。甲烷氧化菌能够氧化分解甲烷，作为减少大气甲烷排放的重要生物汇，对保持大气中甲烷浓度的平衡具有重要意义。从甲烷氧化菌的类型及其特征、甲烷氧化机理着手，介绍了多样性研究方法、填埋场中甲烷氧化菌的活性影响因素及甲烷生物减排应用等最新研究进展。在综述前人研究的基础上，探讨了目前研究的不足，提出了利用甲烷氧化菌复合微生物菌剂等综合处理措施，旨为垃圾填埋场甲烷减排的研究和应用提供新的思路。

纳他霉素在纳塔尔链霉菌中的合成及其调控机制的研究进展

卢诗瑶, 孙立洁, 袁丽霞, 朱薇薇, 姚建铭

2016, 32(5): 26-33. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.004

摘要 ( 313 )

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纳他霉素作为一种多烯大环内酯类抗生素，是纳塔尔链霉菌的次级代谢产物。它不仅能够有效地抑制真菌的生长，还能够抑制黄曲霉毒素的形成，因而广泛应用于食品防腐剂和真菌角膜炎的治疗等领域。纳他霉素首先由乙酸激活聚酮合酶（PKS）催化合成纳他霉素的骨架环，再由系列相关合成酶对其进行加工修饰，此过程涉及系列基因簇的表达调控机制，如转录调节子的调节、途径特异性调节、总体调控、交叉调节及胞内ROS调节等。完整的纳他霉素分子形成后由胞内转运子运出胞外。结合纳他霉素的研究进展，对其未来的研究方向进行了展望。

渔用药物防耐药策略研究进展

潘浩, 王荻, 卢彤岩

2016, 32(5): 34-39. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.005

摘要 ( 236 )

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目前，药物治疗仍然是防治水产动物病害的主要方法，但其不合理应用也诱发了大量耐药细菌的产生。如何制定合理的渔用常用药物防耐药用药策略已成为目前研究的重点。系统的综述了耐药突变选择窗理论、中草药防耐药应用及养殖条件影响在防耐药用药策略方向的研究进展。

蛋白质微胶囊的研究进展

贺晓琳, 滕凯, 郭淑元

2016, 32(5): 40-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.006

摘要 ( 282 )

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蛋白质药物具有易降解和失活的特点，如何保持蛋白活性使其有效发挥作用成为蛋白质药物应用的一大难题。微胶囊技术致力于将蛋白质包封于囊内以与外界环境隔绝，达到保护蛋白质的作用。主要综述了几种装载蛋白质的微胶囊的制备方法，包括层层自组装法、乳化法、静电液滴生成法等，旨在为蛋白质微胶囊的广泛应用奠定基础。

CRISPR/Cas9技术的发展及在基因组编辑中的应用

张凯丽, 李瑞, 胡桐桐, 徐永杰

2016, 32(5): 47-60. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.007

摘要 ( 338 )

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CRISPR/Cas9是由细菌和古细菌等微生物中特有的获得性免疫系统发展起来的基因组编辑技术，可以被一段短的RNA引导到复杂基因组中的特定位置，从而对靶标识别切割。该技术可以很容易对几乎所有生物体中的内源基因组DNA序列及其表达产物进行有选择地被编辑或调控，已成为一种热门的基因组编辑工具，正积极推动着从基础生物学到生物技术和医学等方面的发展。介绍CRISPR/Cas9的研究历史、结构和功能以及、精确识别的分子基础，并就其在基因组编辑中的应用进行了较为详尽的综述，以期为从事该领域的科研人员提供参考。

基因枪转化法对抗旱基因导入玉米的研究

李志亮, 吴忠义, 杨清, 张希太, 叶嘉, 邢浩春, 陈建中, 黄丛林

2016, 32(5): 61-68. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.008

摘要 ( 284 )

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全球水资源短缺，干旱已是玉米生产发展的主要限制因素。通过培育抗旱能力提高的转P5CS基因玉米株系，为玉米抗旱遗传育种提供新材料。利用基因工程策略构建植物表达载体pBPC-P5CS-F129A，用基因枪法对玉米自交系京501幼胚愈伤组织进行遗传转化，在选择培养基中加入10 mg/L 的草丁膦进行筛选，对草丁膦抗性再生植株进行了PCR 检测和 Northern blot鉴定，对转P5CS基因玉米植株进行了抗旱性分析。结果表明，与对照相比，转基因植株的抗旱能力得到提高。干旱胁迫下，转P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比对照高，而丙二醛含量比对照低。

拟南芥IQM5.2的克隆、表达及其生物信息学分析

弓路平, 萧文慧, 周玉萍, 黄小玲, 田长恩

2016, 32(5): 69-74. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.009

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为了探究拟南芥IQM5基因是否存在不同的剪切方式及其器官特异性表达，利用RT-PCR技术和T-A克隆发现了IQM5基因的一种新的剪切方式，即IQM5.2。利用生物信息学方法、半定量和定量RT-PCR分析方法分别对新的CDS序列所编码蛋白的性质以及IQM5.1和IQM5.2在不同器官中的比例进行了分析。结果表明，IQM5.2编码1个由300个氨基酸组成的多肽，其N端与豌豆重金属诱导蛋白6A（HMIP6A）具有较高同源性，含有1个IQ基序，属于钙不依赖性钙调素结合蛋白；在幼苗、莲座叶、花序叶、茎和花蕾中都存在IQM5.1和IQM5.2的转录本，且二者的比例在不同的材料中不尽相同。因此，IQM5基因存在不同的剪切方式和器官特异性表达。

人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测

徐岚, 肖斌, 陈慧芹, 李晓荣, 郝文波

2016, 32(5): 75-81. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.010

摘要 ( 325 )

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旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。从HeLa细胞中提取总的RNA，通过RT-PCR获得Csk基因全长cDNA序列，并将其克隆至真核表达载体pENTER中，构建重组质粒pENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48 h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况，间接免疫荧光进行蛋白定位，通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白，his-pulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示，经双酶切及测序鉴定，真核表达载体pENTER-Csk-his正确没有突变，SDS-PAGE及Western blot均可检测到大小约为51 kD的目的蛋白，说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功，间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达，通过磁珠纯化得到Csk蛋白，最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用，说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列，并构建重组pENTER-Csk-his真核表达质粒，在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性。

新疆南部和田羊、卡拉库尔羊、多浪羊MSTN基因的真核表达

王海涛, 金波, 李树伟

2016, 32(5): 82-90. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.011

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旨在构建新疆南部4个地方品种（品系）绵羊，即平原型和田羊（HP）、山区型和田羊（HS）、卡拉库尔羊（KL）和多浪羊（DL）的肌生成抑制素（myostatin，MSTN）基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达质粒并在真核细胞中表达。从4种绵羊骨骼肌中提取总RNA，逆转录获得cDNA，PCR扩增MSTN后与pMD18-T载体连接构建重组质粒并测序分析，然后将MSTN（HP、HS、DL和KL）基因插入到融合表达载体pEGFP-N1中，构建真核融合表达重组质粒pEGFP-N1-MSTN，在细胞铺满80%时用脂质体法转染到CHO中，观察EGFP与MSTN蛋白在CHO细胞内融合表达的绿色荧光。结果显示，平原型和田羊、山区型和田羊、卡拉库尔羊和多浪羊MSTN的ORF序列都是1 125 bp（不含终止密码子），编码375个氨基酸；与GenBank中MSTN序列比较，与田羊（HS、HP）没有差异；卡拉库尔羊有2个碱基差异，造成2个氨基酸变异；多浪羊有6个碱基的差异，造成4个氨基酸变异。成功构建EFGP和MSTN共表达重组质粒并在真核细胞CHO中得以表达。

采用6个微卫星位点研究6个绵羊品种遗传多样性

陈李鹏, 黄勇富, 赵永聚, 俄广鑫, 娜日苏

2016, 32(5): 91-98. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.012

摘要 ( 305 )

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利用6个微卫星座位对中国乌珠穆沁羊、小尾寒羊、滩羊、昭通绵羊、呼伦贝尔羊和甘肃高山细毛羊6个绵羊品种，共计280个个体进行遗传多样性分析。计算了6个绵羊品种间的多态信息含量、杂合度和遗传距离，并进行了主成分分析和UPGMA聚类。发现了101个等位基因，平均杂合度0.599-0.691，平均多态信息含量0.609-0.680；甘肃高山细毛羊与其他绵羊品种遗传分歧最大，而呼伦贝尔羊与乌珠穆沁羊间的分歧最小。结果表明6个绵羊品种均具有较高的遗传多样性，品种间的遗传关系与其形成历史、分化及地理分布基本一致。

大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种NPY基因的DNA和cDNA克隆及序列分析

刘浩, 白俊杰, 李胜杰

2016, 32(5): 99-106. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.013

摘要 ( 258 )

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神经肽Y（Neuropeptide Y，NPY）在机体的摄食活动中发挥重要作用，是哺乳动物最重要的一种内源性促食欲因子。为了解大口黑鲈（Micropterus salmoide）NPY基因的结构及进一步研究该基因在大口黑鲈中的功能作用，采用RT-PCR和RACE技术，克隆了大口黑鲈北方亚种（M. salmoides salmoides）和佛罗里达亚种（M. salmoides floridanus）NPY基因cDNA序列，结果表明两亚种NPY cDNA均包括一个编码99个氨基酸的ORF框和长度为52 bp的5'非编码区（5'-UTR）；采用PCR和基因组步移技术获得了长度分别为3 561 bp和3 565 bp的大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种NPY基因DNA序列。序列分析结果表明，大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种NPY基因由4个外显子和3个内含子组成。经MATINSPECTOR软件预测，在北方亚种和佛罗里达亚种启动子序列分布有TATA框、CAAT框、CCAAT-Box、GATA-Box等基本转录调控元件。实验在大口黑鲈两亚种NPY DNA序列间发现了6个单个位点碱基差异，与大口黑鲈北方亚种相比佛罗里达亚种启动子区域出现一个4个碱基的插入。不同物种间NPY基因的序列同源性分析表明大口黑鲈与鳜鱼和石斑鱼的NPY基因核苷酸同源性最高，达90%和88%，氨基酸同源性分别为93%和95%。

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）干扰素调节因子2基因的克隆及原核表达

孙赛红, 马普, 孙鹤, 孔德荣, 李慧, 仇雪梅, 姜志强, 刘海映, 刘洋, 刘圣聪, 孟雪松, 王秀利，

2016, 32(5): 107-113. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.014

摘要 ( 238 )

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干扰素调节因子（Interferon regulatory factor，IRF）是一种多功能的转录因子。采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了红鳍东方鲀干扰素调节因子2（Interferon regulatory factor 2，IRF2）基因的全长cDNA。该基因全长为1 552 bp，其中5'非编码区（5'-UTR）187 bp，3'非编码区（3'-UTR）429 bp，编码区（CDS）为936 bp，共编码311个氨基酸。将IRF2的编码区序列连接到原核表达载体pET32a（+），成功构建了重组体pET32a（+）-IRF2。将重组体pET32a（+）-IRF2转入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，获得了重组表达IRF2的基因工程菌。经IPTG诱导，pET32a（+）-IRF2在BL21中得到了融合表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测，结果显示红鳍东方鲀IRF2基因在大肠杆菌中的表达效果较高，目的蛋白准确。

泥鳅角蛋白18（K18）基因的克隆与表达分析

吴卫君, 刘士力, 李倩, 王雨辰, 练青平, 胡廷尖, 贾永义, 蒋文枰, 李喜莲

2016, 32(5): 114-123. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.015

摘要 ( 266 )

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角蛋白18（K18）是角蛋白的一种，为中间纤维蛋白，是细胞骨架的组成部分。为了解泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）K18序列特征及其在不同组织中的表达，研究采用3'-和5'-RACE法克隆K18基因cDNA全长序列，并运用实时荧光定量PCR技术探讨其在不同组织中的表达。结果表明，泥鳅K18基因cDNA全长序列1 694 bp，其中包含开放阅读框1 299 bp，编码432个氨基酸，其序列具有Ⅰ型角蛋白序列DGKVVS，以及非常相似序列DNA（R/K）LAADDF。相似度分析显示，泥鳅K18与大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）的相似度最高为98%，与其它物种K18也存在不同程度的相似度。系统进化分析表明，泥鳅与其他物种的K18系统发育同源，且同陆生脊椎动物和硬骨鱼类同源，并与大鳞副泥鳅的关系最为密切。通过定量分析，K18基因在泥鳅肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8种组织都有表达，其中，肠表达最高，心脏最低。统计学分析表明，K18基因的表达在不同组织间存在显著性差异。

三疣梭子蟹腺苷酸转移酶（ANT）基因的克隆与分析

李冰玥, 朱冬发, 邱锡尔, 周彦琦, 柳志业, 谢熙

2016, 32(5): 124-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.016

摘要 ( 281 )

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腺苷酸转移酶（Adenine nucleotide translocase，ANT）是线粒体内膜上负责能量分子传导的转运蛋白，在能量代谢中起着关键作用。为了研究ANT基因在甲壳动物蜕皮中的作用，采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术（RACE技术）克隆得到三疣梭子蟹ANT基因的序列全长（GenBank登录号：KM921660），该序列全长1 414 bp，包括132 bp的5'端非编码区，352 bp的3'段非编码区，具有930 bp的完整开放阅读框（ORF），编码309个氨基酸。将该ANT基因序列推导的氨基酸序列与已公布的其他物种ANT序列进行系统进化树分析发现，三疣梭子蟹ANT基因与其他甲壳动物ANT基因聚为一支，其中与拟穴青蟹ANT一致性高达96%。通过氨基酸序列比对发现，三疣梭子蟹ANT序列具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域，是形成能量分子传导的转运通道，催化细胞质中ADP和线粒体内ATP间进行跨膜交换。采用实时荧光定量PCR技术，分析三疣梭子蟹ANT基因的组织差异表达，结果表明ANT基因在三疣梭子蟹肌肉（Ms）中的表达量最高，在其他组织中表达量均较低，具显著差异（P<0.05）；在三疣梭子蟹蜕皮周期中，肌肉中ANT基因的表达量A期最高（P<0.05），然后下降，至C期最低，随后又逐渐上升至D1期，在D1期出现第2个峰值后再逐渐下降。研究结果说明ANT基因与三疣梭子蟹肌肉活动密切相关，可能在蜕皮调控中发挥重要作用。

三疣梭子蟹Spook基因克隆及其表达分析

周彦琦, 朱冬发

2016, 32(5): 131-139. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.017

摘要 ( 281 )

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甲壳动物蜕皮激素（Ecdysteroids）主要在Y器官（YO）中合成与分泌，参与调控蜕皮、繁殖等多项生理活动。Spook基因编码的细胞色素P450（CYP）307a1是蜕皮激素合成通路早期的关键酶。为了研究其在三疣梭子蟹蜕皮过程中的调控作用，采用反转录PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术，克隆得到了三疣梭子蟹Spook基因的全长cDNA序列（Gen-Bank 登录号：KM030021）。该序列全长为2 200 bp，包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框，编码520个氨基酸；比对分析显示该氨基酸序列含helix-C、helix-K、helix-I、PERF、heme-binding 5个P450特征保守区域；系统进化树分析发现推导的三疣梭子蟹Spook蛋白与其他物种Spook聚为一支，而其他Halloween基因则分别聚为一支，表明推导的氨基酸确实是三疣梭子蟹Spook的蛋白序列。采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析了其在不同组织中的表达情况，结果显示Spook基因主要在三疣梭子蟹的YO中表达。在三疣梭子蟹的蜕皮周期中，Spook基因的表达水平自蜕皮后期（A、B期）逐渐上升，并在蜕皮间期（C期）上升至最大，随后在蜕皮前期逐渐下降至D3、D4亚期最低。研究结果表明Spook基因可能参与调控三疣梭子蟹的蜕皮过程。

猪圆环病毒衣壳蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达研究

陈灵艳, 陈先进, 蒋烨, 吕暾

2016, 32(5): 140-145. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.018

摘要 ( 268 )

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研究猪圆病毒衣壳蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况。以3个不同的质粒为基础，构建不同类型的猪圆环病毒衣壳蛋白基因（PCV2-ORF2）重组表达载体，并分别转化进入枯草芽孢杆菌168和WB800中。利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达，并通过实时荧光定量PCR检测目的基因的转录水平上的表达情况。结果显示，ORF2基因原序列在枯草芽孢杆菌中难以表达，经过密码子优化后，构建的截短ORF2基因表达载体在枯草芽孢杆菌内表达系统中成功表达目的蛋白。密码子优化促进了目的基因的表达。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表达载体的构建及在细胞中的表达

程华, 方向东, 崔硕, 吴萌, 张昭军, 李泽夏

2016, 32(5): 146-150. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.019

摘要 ( 269 )

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构建载体表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）蛋白，用以获得抗GPC3单克隆抗体。用PCR技术扩增GPC3基因，利用酶切位点将该序列插入p3XFLAG-CMV-14载体，构建pCMV-gpc3表达载体。通过脂质体将该载体转染至HEK293细胞中，利用Western blot技术检测最终结果。收集稳定表达的细胞，破碎，通过亲和层析柱，获得纯度较高的GPC3蛋白。成功构建pCMV-gpc3真核表达载体，转染至HEK293细胞后，经G418筛选获得稳定表达的单克隆细胞系；Western blot分析结果表明目的蛋白高效表达。

一株碱蓬内生真菌的鉴定及促生活性产物的初步研究

于飞, 谷玥, 张奇, 卜宁

2016, 32(5): 151-157. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.020

摘要 ( 243 )

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对辽宁盘锦红海滩的盐生碱蓬内生真菌JP4-1进行鉴定并研究其促生活性产物成分。根据形态学特征及18S rDNA序列分析对菌种进行鉴定，运用过滤离心、超声破碎、萃取、旋蒸等技术提取活性成分，并采用水培法研究该菌株发酵液对水稻幼苗的促生长活性。结果显示，经鉴定，JP4-1菌株为小丛壳属（Glomerella sp.），菌丝分枝，有隔，产孢；以正丁醇处理的JP4-1菌株胞外发酵液的小分子萃取物可使水稻幼苗的株高和叶片干重分别提高10.84%和14.67%，叶绿素含量提高44.22%，促生长效果明显。碱蓬内生真菌JP4-1的胞外发酵产物对水稻幼苗具有明显的促生长作用，其中以正丁醇萃取得到的小分子活性产物促生效果最为显著。

一株中性嗜盐菌Halobacillus dabanensis N522的分离鉴定及其抗菌活性研究

倪志华, 张玉明, 周艳芬，

2016, 32(5): 158-164. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.021

摘要 ( 262 )

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从广东省徐闻盐场沉积物中分离嗜盐菌，鉴定目标菌株、考察培养条件，并对发酵液中抗菌活性物质进行理化性质研究。用稀释涂布法分离嗜盐菌，通过生理生化实验和16S rRNA基因序列分析鉴定分离得到的菌株；采用管碟法考察嗜盐菌发酵液的抗菌活性，并对其抗菌活性物质进行理化分析。结果显示，分离得到一株嗜盐菌，经生理生化实验和16S rRNA序列分析鉴定后命名为达坂喜盐芽胞杆菌（Halobacillus dabanensis）N522，其最适生长pH值和NaCl浓度分别为7.0和100 g/L，属于中度嗜盐菌类群。菌株N522的发酵液对多种细菌和真菌具有抑制作用，其中，对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强。经硫酸铵盐析和蛋白酶实验分析，初步确定菌株N522所产抗菌活性物质为多肽，分子量在3-5 kD之间，并且该抗菌活性物质对pH和温度稳定性良好。晒盐场沉积物中分离得到的中度嗜盐菌H. dabanensis N522可作为开发抗菌药物的潜在新来源。

产胞外多糖菌株的筛选及胞外多糖结构分析

李彬, 陈向楠, 张建法, 王世明

2016, 32(5): 165-171. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.022

摘要 ( 313 )

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筛选产胞外多糖菌株，探究胞外多糖流变学特性，并分析其结构。从土壤中筛选产胞外多糖菌株，通过形态特征观察及16S rDNA序列鉴定菌株。使用黏度计测定不同条件下胞外多糖溶液黏度变化，研究其流变学特性。通过乙醇沉淀、Sevag法和透析分离纯化多糖，再利用气相色谱、红外光谱和核磁共振等手段分析多糖结构。结果显示，筛选到一株产胞外多糖菌株，鉴定为肠杆菌WL113（Enterobacter sp.WL113）。所产胞外多糖黏度随质量浓度升高呈指数增大，浓度为10 g/L时黏度比1 g/L时提高约33倍；该多糖对温度敏感，100℃时黏度比25℃时降低了89.8%；但此多糖在酸性、中性和弱碱性条件下黏度相对稳定，对Na+、K+、Mg2+和Ca2+等金属盐离子耐受性能良好。结构分析表明，该多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔比阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖=1.63∶3.16∶2.38，含有α型和β型吡喃糖，存在糖醛酸。

噻吩磺隆降解菌Bacillus subtilis LXL-7的分离与应用

李晓楼

2016, 32(5): 172-179. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.023

摘要 ( 230 )

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从土壤中分离到一株能高效降解噻吩磺隆的细菌LXL-7，经鉴定LXL-7为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。在含100 mg/L噻吩磺隆的培养基中，菌株LXL-7降解噻吩磺隆的72 h降解率可达99.6%以上。菌株LXL-7的最适pH为7.5，适宜温度为30-35℃，该菌还对噻吩磺隆和盐有很好的耐受性，至少能耐受400 mg/L的噻吩磺隆和4.0%的NaCl。另外，还通过在商品化的土壤微生物改良剂中添加菌株LXL-7开发了多功能微生物制剂，新制剂除原有功能外还增加了降解噻吩磺隆的新功能，故认为菌株LXL-7能够被用于噻吩磺隆污染的处理以及相关微生物制剂的开发。

简单节杆菌groEL基因表达对大肠杆菌抗逆性能的影响

王艳霞, 王红玲, 王敏, 骆健美,

2016, 32(5): 180-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.024

摘要 ( 255 )

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以简单节杆菌（Arthrobacter simplex）TCCC 11037基因组为模板，通过PCR方法进行groEL基因克隆，结果表明，该菌株中GroEL的核苷酸和氨基酸序列与Nocardioides sp. JS614来源的GroEL同源性最高，分别为89%和95%。通过pET-22b（+）将其在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达，结果表明，重组菌株在甲醇、高渗和强酸这3种压力高浓度冲击条件下的存活能力和适当压力条件下的生长性能均明显提高。

溶磷菌对铅胁迫下杏鲍菇氧化应激反应的影响

何难, 徐恒

2016, 32(5): 187-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.025

摘要 ( 275 )

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选择使用杏鲍菇菌丝富集重金属Pb2+，从本实验室菌种库中筛选出了8株能抗800 mg/L Pb2+的菌株。通过对其溶磷能力的检测，从中筛选到了2株溶磷能力较强的菌株CG8、FFT1以及2株溶磷能力较弱的菌株FFC6、FFC11，经16S rDNA序列分析鉴定，CG8为克雷伯菌（Klebsiella sp.），FFT1为假单胞菌（Pseudomonas sp.），FFC6和FFC11为芽孢杆菌（Bacillus sp.），其序列相似度均达99%。随后，研究了4株溶磷菌株对液体培养（Pb）条件下杏鲍菇（Pleurotus eryngii）菌丝的生物量、Pb富集量、脂质过氧化、巯基蛋白含量和抗氧化酶的影响。结果显示，在Pb胁迫条件下，具溶磷能力的菌株能在一定程度上增加菌丝生物量，促进菌丝对重金属的富集，同时，使菌丝的丙二醛（MDA）含量降低，菌丝抗氧化酶（SOD）和氧化物酶（POD）活性显著降低，菌丝巯基蛋白含量升高。实验证明，微生物溶磷能力可有效减轻重金属对杏鲍菇菌丝的毒害和重金属诱导的氧化胁迫。并且溶磷能力较强的菌株（CG8）对杏鲍菇菌丝富集与抵抗重金属诱导的氧化胁迫有更为明显的作用，重金属富集量增加96.1%，巯基蛋白增加量为91.3%。

两种水杨酸代谢相关酶在逆境龙须菜中的活性研究

邹同雷, 汪芳俊, 侯赛男, 孙雪, 徐年军

2016, 32(5): 194-199. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.026

摘要 ( 262 )

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旨在探索水杨酸（Salicylic acid，SA）信号通路相关的两种酶——苯丙氨酸解氨酶（PAL）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-GA）在病烂、盐度、温度逆境和添加SA条件下在龙须菜中的活性变化。结果表明，3组病烂龙须菜中PAL和β-1，3-GA活性分别增加为对照组的1.27-1.42倍和1.26-1.35倍；高盐条件下PAL活性与对照组无显著差别，而β-1，3-GA活性在24 h和48 h分别增加为对照组的1.90倍和1.42倍；高温组PAL和β-1，3-GA活性在24 h均显著升高，分别是对照组的1.25倍和1.27倍；100 μmol/L SA添加后PAL和β-1，3-GA的活性升高，但高浓度SA却抑制了两种酶的活性。结果表明，在逆境胁迫下龙须菜中PAL和β-1，3-GA的活性增加与水杨酸的抗逆作用有关，而100 μmol/L SA诱导两种酶的效果最显著。

生长温度对不同生育期烟草淀粉代谢的影响

张建波, 金云峰, 王莎莎, 杨慧芹, 逄涛, 李军营, 崔明昆, 龚明

2016, 32(5): 200-211. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.027

摘要 ( 405 )

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旨在明确不同温度对烟草不同生育期淀粉代谢的影响，以云烟87为材料，通过人工气候室模拟云南江川、贵州遵义和河南襄县的气温条件，在烟草移栽-团棵、团棵-现蕾和成熟期进行温度处理，研究了不同温度下不同时期烟草叶片中淀粉含量、酶活性的变化，并通过实时荧光定量PCR技术研究淀粉代谢相关基因表达的变化。结果表明，随烟株生长发育阶段的推进，淀粉含量不断增多，在成熟期含量达到最高。贵州遵义地区的温度条件有利于移栽-团棵期淀粉的积累和AGPase活性的升高；云南江川地区的温度条件有利于团棵-现蕾和成熟期淀粉含量的积累及AGPase、SSs活性的升高；河南襄县的温度条件淀粉积累较少。以上结果表明，温度通过影响淀粉代谢相关基因的表达，进而影响相关酶活性的升降和淀粉的代谢和运输，最终影响烟叶风格的形成。

GC夹对三种食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE图谱的影响

廖超, 张昭寰, 姚鑫, 谢晶, 张炜佳, 潘迎捷, 赵勇,

2016, 32(5): 212-219. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.028

摘要 ( 242 )

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旨在探讨不同的GC夹以及GC夹连接引物的不同位置对3种食源性致病菌的DGGE图谱结果的影响，合成6对RNA聚合酶β亚基编码基因rpoB引物（rpoB 1-6），含3种不同GC夹（GC-1，GC-2，GC-3），且每种GC夹分别连接于正反引物5'端。应用rpoB-PCR-DGGE 对副溶血性弧菌（5株），单增李斯特菌（5株）和沙门氏菌（3株）进行分析，并与V3-PCR-DGGE和ERIC-PCR的图谱及聚类分析结果进行比较。结果显示，GC-3夹连接于反引物上的rpoB-PCR-DGGE分辨效果最好，分辨力指数达0.9，与ERIC-PCR相同，高于V3-PCR-DGGE。GC夹序列和连接引物位置均对rpoB-PCR-DGGE图谱结果产生影响。选择或设计无连续鸟嘌呤（G）排列的GC夹序列且将其连接于反引物5'端，均能有效提高rpoB-PCR-DGGE对食源性致病菌检测与分型的效果。

马铃薯块茎特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化研究

杨加伟, 程小玲, 龙朝康

2016, 32(5): 220-225. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.029

摘要 ( 245 )

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为获得高效表达人白细胞介素-12（hIL-12）蛋白的转基因马铃薯植株，利用根瘤农杆菌侵染法将前期构建的马铃薯块茎特异性启动子Ppatatin驱动的hIL-12植物表达载体导入马铃薯，通过共培养、筛选、分化等过程获得转基因植株，并结合PCR、RT-PCR、GUS染色及ELISA分析对转基因植株进行鉴定。结果显示，获得12个马铃薯转基因株系，PCR检测表明其中的10个株系目的基因已导入马铃薯基因组，转基因阳性率为83%；RT-PCR分析表明其中的7个株系外源基因在转录水平成功获得表达，ELISA分析表明其中的5个株系有明显的蛋白水平表达。对这7个株系后代的检测表明外源基因成功表达且具有良好的遗传稳定性。

正常培养条件下绵羊卵母细胞减数分裂从中期I至中期III的动态变化过程

李欣欣, 白春玲, 魏著英, 李光鹏

2016, 32(5): 226-233. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.030

摘要 ( 259 )

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以绵羊卵母细胞为研究对象，通过免疫组织化学的方法研究其染色体和纺锤体微管及微丝在体外成熟、孤雌激活过程中的动态变化。结果表明：（1）纺锤体的形态由中期的桶形，变成早后期的圆柱形及后期和末期细长而扁平的三角锥形，与椎体底面连接的染色质将来进入极体并最终被排出。（2）染色体形态从中期单个的清晰可见的状态，变为后期和末期凝缩的染色质状态，随后在下一个中期再次呈现出清晰可见的形态。（3）第一次减数分裂中期（MI）纺锤体比第二次减数分裂中期（MII）和第三次减数分裂中期（MIII）大，但MII期纺锤体形态比MI期更接近桶形。（4）几乎所有组成纺锤体的微管和微丝都被分配到极体中。

小反刍兽疫病毒F基因缺失体的克隆、表达及鉴定

邓瑞雪, 蒙学莲, 曾巧英, 才学鹏

2016, 32(5): 234-239. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.031

摘要 ( 260 )

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旨在研究小反刍兽疫病毒（PPRV）囊膜与宿主细胞的融合机制，构建F基因缺失体，并且在原核细胞内表达。鉴于F基因中包含的两段保守序列HR1和HR2在融合过程中具有关键性作用，分别构建pET30a-HR1和pET30a-HR2原核表达载体，将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞内进行IPTG诱导表达，在最优表达条件下大量表达，并利用镍琼脂糖凝胶纯化蛋白。结果显示，获得的重组蛋白与预期大小一致且以可溶性方式表达，纯化的蛋白纯度大于90%；重组蛋白与抗His标签抗体和抗PPRV Nigeria 75/1株阳性血清均能发生反应，证明重组蛋白具有反应原性。

戊型肝炎病毒长爪沙鼠感染模型的初步研究

朱光泽, 屈勇刚, 李一权, 兰添, 范园园, 胡宁宁, 张诺娜, 李霄, 金宁一

2016, 32(5): 240-245. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.032

摘要 ( 254 )

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旨在探索应用长爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）构建戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）动物模型的可行性，从猪粪便稀释悬液中提取HEV RNA并鉴定，经腹腔和口服接种HEV于长爪沙鼠，并每周采集血液、相关器官（心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、脾脏）及粪便。用反转录PCR（RT-PCR）和免疫组化等检测方法分析各个样品。结果表明，感染后第7天开始，可从血液、肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏、肺、粪便中检测到HEV RNA；通过免疫组化和组织病理学观察，发现HEV可在肝脏中进行表达，并且能引起肝组织病理变化，但感染HEV后长爪沙鼠均缺乏较明显的临床表现症状。结果提示，长爪沙鼠对 HEV具有易感性，感染后肝脏出现小叶性肝炎的病理变化，具有作为HEV感染动物模型的潜在价值。

AAV-ITR基因表达微载体在小鼠体内表达

李泰明, 许麒麟, 潘俊杰, 刘晓玫, 张春

2016, 32(5): 246-254. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.033

摘要 ( 271 )

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旨在比较AAV-ITR基因表达微载体及其单体在小鼠不同部位的表达差异，将相同拷贝数的AAV-ITR基因表达微载体和pUC57-minivector-EGFP分别转入小鼠脑组织，另外将相同拷贝数的AAV-ITR基因表达微载体单体，AAV-ITR基因表达微载体和pUC57-minivector-EGFP转入小鼠骨骼肌中，比较不同时期组织中的残余分子数量。荧光定量PCR、显微荧光观察以及荧光平均光密度和荧光灰度值分析表明，相同拷贝数的AAV-ITR基因表达微载体单体比AAV-ITR基因表达微载体和pUC57-minivector-EGFP具有更高的转染效率，其稳定性也优于AAV-ITR基因表达微载体。结果显示，AAV-ITR基因表达微载体单体在动物体内具有高效表达安全稳定的特点，有望成为基因治疗中一种安全可靠，稳定高效的新型载体。

ML00253764拯救MC4R缺陷型突变体的特性研究

王小花, 曹小红, 樊振川

2016, 32(5): 255-259. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.034

摘要 ( 197 )

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旨在探究非肽类小分子ML00253764对致肥胖MC4R突变体拯救的特异性及经其拯救后受体的内化动力学特性，构建了黑皮质素受体及其突变体稳定表达的细胞模型。流式细胞术结果显示，ML00253764使MC4R缺陷型变受体N62S与P78L的膜表面表达分别提高了43%与34%，但对其他黑皮质素受体及其突变体几乎无影响，说明ML00253764的拯救效果具有MC4R受体特异性及突变受体特异性特征。内化动力学研究结果证明经拯救的突变受体与野生型受体的内化特性相同，内化速率参数t1/2无显著性差异。内源性配体α-MSH及AgRP对MC4R缺陷型受体膜表面表达无拯救性功效，进一步从侧面证明ML00253764的作用方式与二者不同，而突变受体被拯救是细胞膜渗透性药学伴侣分子特定作用的结果。

重组天花粉蛋白与YH-16联合用药抑制黑色素瘤细胞增殖及成瘤

郭会灿

2016, 32(5): 260-264. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.035

摘要 ( 235 )

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获得人源天花粉蛋白并研究其与YH-16联合用药对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10增殖及成瘤的作用。以大肠杆菌BL21重组表达天花粉蛋白rTCS并以亲和层析法纯化rTCS；以MTT法检测rTCS、YH-16、rTCS+YH-16对B16-F10细胞生长的影响；体内实验检测rTCS、rTCS+YH-16对瘤体生长的作用。结果表明，获得了电泳纯重组天花粉蛋白rTCS；rTCS可显著抑制B16-F10细胞增殖，并且抑制率显著高于YH-16组，但是rTCS与YH-16联合处理组并未比rTCS组有显著差异；rTCS与YH-16联合用药明显抑制B16-F10细胞在小鼠体内成瘤。重组天花粉蛋白rTCS联合YH-16用药对黑色素瘤细胞B16-F10的增殖及成瘤有显著抑制作用。联合策略将为治疗黑色素瘤患者提供新的契机。

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2016, 32(5): 300.

摘要 ( 148 )

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