生物技术通报

复合性状转基因植物安全性评价的研究进展

柳晓丹, 许文涛, 黄昆仑, 梅晓宏

2016, 32(6): 1-6. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.002

摘要 ( 341 )

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随着转基因技术的不断发展，转基因作物实现了产业化。目前，单性状的转基因作物无法满足农业发展的需求，而复合性状转基因作物拓宽了转基因作物的功能，提高了资源的利用率，满足了农民多元化需求，具有广阔的应用前景，是转基因植物发展的新方向。由于转基因技术有一定的风险，因此对转基因作物的安全性监管较为重要，对于复合性状转基因作物，不同国家的安全性评价制度却不尽相同。综述了不同国家对复合性状转基因作物的安全性评价体制，旨为我国复合性状作物提供监管依据。

植物Rab蛋白家族的研究进展

齐慧杰, 秦晓惠, 刘凌云

2016, 32(6): 7-12. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.003

摘要 ( 454 )

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Rab家族是一类非常重要的小G蛋白，在多种细胞生理活动中都起着至关重要的作用。高等植物进化出了一组独特的Rab蛋白来满足各种细胞物质运输的特定需要。细胞内Rab蛋白感知上游信号通过自身活性的调节影响植物生长发育及对环境胁迫的反应。对植物Rab蛋白进化特点、结构特征及各成员在植物信号转导、生长发育和胁迫响应中的功能进行了综述。

拟南芥转录激活因子AtWRI1研究进展

杨先友, 黄有军, 张通, 黄春颖

2016, 32(6): 13-18. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.004

摘要 ( 233 )

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油脂具有较高的经济价值，研究植物油脂合成的调控过程具有重要意义。转录激活因子WRI1在油脂合成调控中起关键作用。综述了AtWRI1的发现及其结构特征、表达模式、功能和调控机制。AtWRI属于AP2/EREPB家族中的AP2亚族，具有7个外显子，在植物各器官的不同发育时期均有表达，但在种子的油脂合成时期表达量最高。它与相应的顺式作用元件结合，能够转录激活糖酵解和脂肪酸合成相关基因的表达，从而促进油脂的合成。AtWRI1是AtLEC1和AtLEC2的下游基因；在CRL3-BPM复合体介导下，AtWRI1通过泛素-26S蛋白酶体途径降解。

微流控芯片在植物细胞研究中的应用进展

王伟轩, 孙静弈, 刘伟娜, 厚凌宇, 玉王宁, 何湘伟, 谢响明

2016, 32(6): 19-29. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.005

摘要 ( 378 )

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植物细胞的传统分析方法是将植物细胞在土壤或者琼脂平板上生长，然后在温室或植物生长室内观察植物的表型。这种方法耗时耗力，且结果分辨率比较低。微流控芯片具有微型化、体积小和高通量等特点，且可在微米水平精确控制植物细胞生长的微环境。因此，能够降低实验成本，缩短实验时间，并且可以达到单细胞水平的分析和鉴定。首先介绍了微流控芯片的加工材料和制备方法，总结了用于植物细胞研究的微流控芯片，重点阐述了近年来微流控芯片在植物根、花粉管、原生质体和细胞壁动力学等植物细胞研究中的应用进展，并展望了微流控芯片在植物细胞研究的应用前景。

人胰高血糖素样肽-1的研究与应用进展

许芳芳, 王楠, 李刚强, 刘德虎

2016, 32(6): 30-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.006

摘要 ( 372 )

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糖尿病的成因非常复杂，迄今为止，人们仍没有找到根治糖尿病的有效方法。尽管市面上销售和治疗糖尿病的化药不断涌现，但这些化药在降糖的同时，不可避免带来许多毒副作用，同时也并不能延缓一些糖尿病并发症的发展。人体自身分泌的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种小分子的多肽，长度仅有30个氨基酸，它属于葡萄糖浓度依赖型的，既可以特异性有效降低血糖浓度，又不会产生任何不良反应，加上GLP-1多重功效的发挥，使其成为II型糖尿病治疗的一个研究热点。要将GLP-1应用于临床，亟待解决它在体内的半衰期非常短的难题。因此，综述国内外对GLP-1的研究探索与应用的最新进展情况，旨在为研究人员和医务工作者在GLP-1相关药物研发上提供借鉴。

高通量生物分析技术及应用研究进展

翟绪昭, 王广彬, 赵亮涛, 曾海娟, 李建武, 丁承超, 宋春美, 刘箐

2016, 32(6): 38-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.007

摘要 ( 296 )

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基因组学、蛋白组学、代谢组学等研究的兴起使得大量生物数据的快速获取和分析变得更加重要。传统的生物分析方法大多耗时、费力，已无法满足现代生命科学研究对海量生物信息的需要。高通量分析技术是快速获取大量生物信息的重要手段。对微阵列芯片、微流控芯片、焦磷酸测序、荧光偏振免疫分析、量子点荧光免疫分析等高通量生物分析技术进行了综述，简述了近几年高通量生物分析技术的研究重点和研究成果，并对其在食品安全、医学等方面的应用进行了简要介绍。

重组酶聚合酶扩增技术研究进展

景志刚, 董浩, 狄栋栋, 田莉莉, 范伟兴

2016, 32(6): 47-53. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.008

摘要 ( 504 )

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重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点。利用RPA技术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列，结合侧流层析试纸条或荧光信号监测装置等简易实验设备即可直接观察检测结果。就RPA技术的原理、发展、技术特点及其近年来在体外诊断、病原检测等领域的研究进展作一综述，旨在为该技术的深入研究和应用提供参考。

聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉菌代谢组学样品前处理方法的优化

范栩嘉, 边艳慧, 殷海松, 乔长晟

2016, 32(6): 54-59. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.009

摘要 ( 276 )

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为了得到更加准确和完整的胞内代谢物信息，从而更加真实的反映微生物胞内代谢情况，基于GC-MS平台，从淬灭剂、提取剂和溶解剂3个方面对代谢组学样品制备过程进行了系统性的优化。对比了不同淬灭剂对胞内代谢物的渗出及细胞损伤情况，结果表明60%甲醇/0.9% NaCl效果最佳。研究了不同提取剂、溶解剂的提取和溶解效果，结果显示60%甲醇提取效果显著，吡啶溶解效果突出。最终确定了出芽短梗霉菌代谢组样品最适前处理方法：预冷的60%甲醇/0.9% NaCl淬灭细胞，液氮研磨和反复冻融破碎细胞，预冷的60%甲醇提取，最后采用吡啶溶解提取物并采用MSTFA 40℃衍生90 min。采用该方法可以检测出300多种代谢组分，包括大量氨基酸、有机酸和糖类物质。本方法可以有效的应用于出芽短梗霉菌代谢组学样品的研究。

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测哈维氏弧菌的研究

程蝶, 柴方超, 蔡怡, 周前进, 陈炯

2016, 32(6): 60-68. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.010

摘要 ( 279 )

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以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为材料，利用环介导等温扩增技术(LAMP)进行核酸扩增，借助横向流动试纸条(LFD)完成产物检测，旨在建立一种可用于哈维氏弧菌快速检测的LAMP-LFD新技术。以哈维氏弧菌的溶血素基因(vhhA)为检测靶标设计了3对特异性引物(其中，上游内引物vhhA-FIP由生物素标记)，进行由生物素标记的LAMP反应；同时设计1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针，与获得的LAMP产物进行特异性杂交，杂交产物经LFD完成检测。经优化，LAMP的反应条件为63℃反应40 min，由LFD完成结果判读共需50 min。结果表明，LAMP-LFD方法能特异性地检出哈维氏弧菌，对创伤弧菌等其他9种水产养殖重要病原菌的检测结果呈阴性。利用该方法，针对细菌纯培养物的检测灵敏度为1.0×10² CFU/mL或2 CFU/反应，针对污染有该菌的大黄鱼组织的检测灵敏度为5×10² CFU/mL或20 CFU/反应，均是以LAMP外引物vhhA-F3/vhhA-B3的常规PCR方法的100倍。因此，该方法能够快速、准确地检出哈维氏弧菌，有望在海水养殖过程哈维氏弧菌的监测和即时检测中普及使用。

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对亚洲玉米螟、棉铃虫和黏虫的抗性评价

宋苗, 汪海, 张杰, 何康来, 梁革梅, 朱莉, 黄大昉, 郎志宏

2016, 32(6): 69-75. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.011

摘要 ( 344 )

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利用农杆菌介导法将Bt cry1Ah基因转入玉米自交系综31，获得对玉米螟有显著抗性的转基因玉米HGK60，为了研究其对鳞翅目害虫的杀虫活性，在室内和田间分别用亚洲玉米螟、棉铃虫和黏虫幼虫对HGK60玉米的杀虫效果进行检测。室内生物活性检测结果表明，取食HGK60玉米心叶的亚洲玉米螟幼虫在3 d后死亡率达100%；HGK60玉米对棉铃虫幼虫有毒杀作用，玉米不同部位对棉铃虫幼虫的杀虫效果存在差异；与非转基因玉米对照相比，取食HGK60玉米叶片一周后的黏虫幼虫体重增长明显受到抑制。田间生物活性检测结果表明，HGK60玉米对于亚洲玉米螟和棉铃虫有很强的杀虫活性，达到高抗级别，对于黏虫有一定的杀虫活性，为抗性级别。

结球甘蓝ARC1与Exo70A1编码区cDNA的克隆及进化分析

杨丹, 廉小平, 周燕, 张贺翠, 杜丹, 高启国, 任雪松, 朱利泉

2016, 32(6): 76-88. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.012

摘要 ( 252 )

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在甘蓝自交不亲和信号传导过程中，ARC1与Exo70A1的相互作用起着承上启下的关键作用。为了研究10种自交不亲和结球甘蓝材料ARC1和Exo70A1的进化关系，对其编码区cDNA进行了克隆和测序；在此基础上采用生物信息学方法，对这10种材料和前人已发表的83条ARC1和73条Exo70A1的相关序列的ARC1-Exo70A1的互作区和非互作区编码序列进行了变异和进化分析。结果发现：(1)所选育的10种结球甘蓝材料的ARC1与Exo70A1的编码区核酸序列存在平行进化关系，且均聚类于芸薹属分支下；(2)ARC1比Exo70A1编码区序列进化速率快；(3)ARC1和Exo70A1互作编码区核酸序列存在明显的协同进化，而ARC1和Exo70A1非互作编码区核酸序列则在进化上呈现明显分异；(4)ARC1和Exo70A1互作编码区cDNA的进化均快于非互作编码区。

过表达VHA-c3基因拟南芥对黑暗、ABA与糖的响应

苏杰, 郭荣起, 李国婧, 王瑞刚

2016, 32(6): 89-95. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.013

摘要 ( 292 )

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为研究液泡H⁺-ATPase c亚基基因(VHA-c3)在植物生长发育及非生物胁迫应答过程中的作用，构建了VHA-c3过表达载体转化拟南芥，获得过表达VHA-c3的转基因纯合体植株，采用半定量RT-PCR技术分析了转基因拟南芥中VHA-c3的表达量，然后对转基因拟南芥进行暗培养、ABA和糖处理。结果获得6个T2代株系转基因纯合体株系，其mRNA表达量均高于对照；黑暗条件下，5个VHA-c3转基因株系的根长变短；在正常光照下，3个转基因株系主根伸长和子叶的展开以及5个转基因株系的种子萌发对ABA的抑制不敏感；分别有5个和6个转基因株系的种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感。推测VHA-c3可能影响根细胞的扩展，并可能参与ABA和糖介导的信号转导途径。

油茶新炭疽病原Colletotrichum camelliae鉴定及致病性测定

李杨, 李河, 周国英, 刘君昂

2016, 32(6): 96-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.014

摘要 ( 268 )

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油茶炭疽病菌能够侵染油茶叶片、花及果实，造成严重落叶、落果，该病害是我国油茶最重要的病害之一。对采集于湖南、江西及海南的油茶炭疽病的病原菌进行了形态学观察及多基因序列分析，同时对分离到的病原菌进行不同品种油茶致病性测定，结果表明，分离到的5株病原菌为山茶刺盘孢Colletotrichum camelliae，这是国内首次在油茶上发现该病原菌。经C. camelliae对不同油茶品种致病性测定，发现C. camelliae对湘林1号、湘林69号、湘林89号、赣无1、赣无16、广西红花、长林3号、长林4号、长林23号、长林53号、长林148号、长林190号等品种的叶片致病，但是在不同品种叶片上出现症状的时间不同。

EMS诱变和NaCl胁迫的正交实验及耐盐纤维亚麻种质的筛选

王卫国, 邓倩, 计巧灵, 王伟

2016, 32(6): 103-110. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.015

摘要 ( 248 )

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旨为经愈伤组织诱导再生的耐盐性纤维亚麻植株奠定基础。以3种纤维亚麻无菌苗的下胚轴段为材，经EMS诱变和盐胁迫的正交实验，再经诱芽和愈伤组织培养，研究其理化特性。结果显示，‘范妮’、‘天鑫3号’和‘双亚5号’下胚轴段不定芽培养的最适处理组合均为0.025% EMS处理2 h(或4 h)，之后用100或150 mmol/L NaCl处理12 h；总产芽率由高到低分别为‘范妮’、‘天鑫3号’和‘双亚5号’下胚轴段；对3种亚麻不定芽生长影响的顺序为：NaCl浓度>EMS浓度>EMS处理时间；3种亚麻下胚轴段不定芽诱导的适宜培养基为MS + 0.000 2 mg/L TDZ + 0.02 mg/L KT + 0.005 mg/L NAA + 0.3%蔗糖+ 0.1 g/L肌醇+ 3.3 g/L植物凝胶。经0.025% EMS处理4 h + 150 mmol/L NaCl处理12 h后生长的愈伤组织，经过2次交替筛选后，其理化指标表明，与对照组的相比，3种亚麻处理组愈伤组织脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量、SOD和POD活性均显著提高(P<0.05)。经过0.025% EMS处理4 h+150 mmol/L NaCl处理12 h后生长的愈伤组织具有一定的耐盐性。

藤县药用野生稻内生固氮菌分离鉴定及系统发育分析

胡文哲, 谭泽文, 王勇, 徐羡微, 谭志远

2016, 32(6): 111-119. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.016

摘要 ( 256 )

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从广西梧州市藤县药用野生稻中筛选内生固氮菌，为微生物肥料生产收集菌种资源。采用3种无氮培养基经平板划线法筛选内生固氮菌；通过乙炔还原法测定其固氮酶活性；利用IS-PCR(Insertion sequence-based PCR)指纹图谱和全细胞蛋白电泳图谱对获得的内生固氮菌进行聚类分析；根据16S rRNA基因序列分析确定其进化关系；使用分光光度计比色法检测其产生长素能力、产铁载体能力、溶磷能力和ACC脱氨酶活性。结果显示，从野生稻中筛选获得34株内生固氮菌分为5个类群，类群I和II各有8株，类群III、IV、V分别有2株、5株和11株，其固氮酶活性介于5.0和1 036.7 nmol/(mL·h)之间。类群I代表菌株HU33与无乳固氮螺菌(Azospirillum amazonense ATCC 35119^T)相似性为97.13%；类群II代表菌株HU31与变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola DSM 15968^T)相似性为99.71%；类群III代表菌株HU17与蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii ATCC 700476^T)相似性为99.86%；类群IV代表菌株HU13与黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus ATCC 35867^T)相似性为100%；类群V代表菌株CM05与越南伯克霍尔德菌(Burkholderia vietnamiensis LMG 10929^T)相似性为99.86%。药用野生稻内生固氮菌资源具有遗传多样性；有些菌株有较强的产生长素、产铁载体、ACC脱氨酶活性和溶磷能力，在农业生产上具有一定的应用潜力；类群I可能是一个新类群。

蓖麻种子油脂累积与可溶性糖变化的关系

张洋, 刘爱忠

2016, 32(6): 120-129. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.017

摘要 ( 267 )

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通过高效液相色谱、RNA-seq测序和放射性碳同位素示踪等技术研究了蓖麻种子发育过程中可溶性糖代谢与油脂累积过程的关系。结果表明，蓖麻种子可溶性糖主要由葡萄糖、果糖和蔗糖构成。随着种子发育和油脂累积，可溶性糖含量呈现明显的下降趋势。其中蔗糖含量变化与油脂累积存在极显著的负相关性(r=0.980)。在种子发育早期，己糖/蔗糖比值较高，糖代谢相关基因大量表达，其中蔗糖合成酶在蔗糖代谢过程中起关键性作用；而在发育中后期，随着种子油脂快速累积，己糖/蔗糖比值和糖代谢水平下降，参与糖代谢的相关基因表达量下调，而脂肪酸合成与油脂累积相关基因表达量明显升高。通过¹⁴C蔗糖同位素示踪实验证实：降低种子蔗糖摄入量可以显著抑制糖类向油脂转化，限制蓖麻种子油脂累积。因此，可溶性糖代谢(主要是蔗糖)在蓖麻种子油脂累积过程中具有重要作用。

正庚烷代替二甲苯在拟南芥花药石蜡切片中的应用

涂磊, 张丽瑶,

2016, 32(6): 130-134. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.018

摘要 ( 301 )

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二甲苯是应用最广的一种透明剂，常用于石蜡切片中的脱蜡和透明，但由于其对人体危害大，广大科研工作者一直在探寻更加安全的二甲苯代替物。以不同时期的拟南芥花药为试材，脱蜡和透明均由正庚烷代替二甲苯完成，其余步骤与常规石蜡切片相同。结果显示，正庚烷透明力强而迅速，既能与乙醇、封藏树胶混合，又能溶解石蜡，可作为合适的透明剂和脱蜡剂；组织经正庚烷处理后物理性质良好，浸蜡充分，切片时软硬适中，容易连续切片，而且厚薄均匀，摊片时能在42℃水中自然展开，平整而无皱褶；经甲苯胺蓝染色，细胞着色好，核质分明，结构清晰，组织形态保持完好，与二甲苯作透明剂的切片效果无明显区别。因此，正庚烷可以作为一种新的、相对安全有效的二甲苯替代物，应用于植物组织切片中。

家蝇核糖体蛋白S18基因的克隆及表达模式研究

胡亚, 卢诚, 魏川川, 修江帆, 吴建伟

2016, 32(6): 135-142. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.019

摘要 ( 261 )

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旨为证实核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18，RPS18)基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫 cDNA 文库中筛选到核糖体蛋白S18基因，以cDNA为模板，通过 PCR 扩增，获得RPS18基因完整编码序列(登录号：KT006855)，运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建 pET28a/RPS18重组质粒，转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化，制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用RT-PCR、qPCR及Western-blot从转录、翻译水平上分析RPS18基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明，RPS18基因ORF全长459 bp，编码152个氨基酸，理论分子量为17 590.5 Da，等电点为10.48；将构建的重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中，纯化得到RPS18蛋白；将该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体，His单抗鉴定及抗血清特异性分析显示，其均可见单一条带；RT-PCR、qPCR及Western-blot分析表明，RPS18基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达；综合分析表明，该基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均保持较好的表达稳定性。

家蝇抗菌肽diptericin基因在大肠杆菌中的表达

卢敏, 白杰, 魏凤仙, 王琳燚, 徐彬, 尹清强, 李绍钰

2016, 32(6): 143-147. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.020

摘要 ( 272 )

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为了实现原核表达的途径高效获取抗菌肽蛋白，以RT-PCR的方法反转录合成家蝇的抗菌肽diptericin基因，并克隆至pGEX-4T-1载体上，转化至大肠杆菌BL21宿主菌进行表达。测序结果显示，RT-PCR克隆到长345 bp的家蝇diptericin基因，重组菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测到目的蛋白的融合表达，结果表明带有GST标签的融合蛋白大小约为37 kD，并且通过GST纯化柱纯化得到了目的蛋白。

NT-proBNP特异性单克隆抗体的制备及鉴定

刘鹏展, 黄绮玲, 何小维, 李文美, 张文琪, 张赛

2016, 32(6): 148-154. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.021

摘要 ( 296 )

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旨在制备并鉴定抗人NT-proBNP特异性单克隆抗体。采用重组NT-proBNP蛋白免疫Balb/c小鼠，取血清效价高的脾细胞与SP2/0细胞融合，经HAT筛选和有限稀释法亚克隆，获得阳性杂交瘤细胞株，用动物体内诱生法制备腹水，用正辛酸-硫酸铵沉淀法将抗体纯化，并测定抗体的亚类、效价、特异性及相对亲和力。结果表明，获得4株能稳定分泌抗人NT-proBNP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为1G12、1B2、3D5和2D11。抗体Ig亚类，1G12和1B2为IgG2a型，2D11为IgG1型，3D5为IgG2b型；1G12，1B2和3D5的抗体效价达到10⁶，而2D11的效价仅达10⁴。特异性好，1G12、1B2、3D5和2D11四株抗体的亲和常数依次为9.32×10¹¹、1.07×10¹²、2.31×10¹²和6.33×10¹⁰。成功制备了特异性抗人NT-proBNP单克隆抗体。

红鳍东方鲀转录因子GATA4基因的表达

郝薇薇, 高长富, 仇雪梅, 姜志强, 王秀利,

2016, 32(6): 155-160. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.022

摘要 ( 326 )

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利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)成鱼的肾脏、肌肉、脑、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了GATA4基因的表达分析，并对幼鱼不同发育时间的个体水平上的GATA4基因的表达进行分析。结果显示，红鳍东方鲀成鱼的肌肉、脾脏、肾脏和脑等4个组织中的GATA4的表达量差异不显著，精巢、卵巢和肝脏的GATA4的表达量显著高于其他组织(P<0.05)，GATA4在精巢、肝脏中的表达量显著高于卵巢中(P<0.05)。在雄性幼鱼5个发育时期中(23、30、40、60和80日龄)，GATA4的表达量从23日龄到30日龄逐渐升高，30日龄最高且明显高于同时期雌鱼GATA4的表达量(P<0.01)，随后到40日龄之间表达量逐渐降低，从60日龄到80日龄又有上升的趋势。在雌性幼鱼5个发育时期中，GATA4表达量从23日龄到40日龄逐渐升高，40日龄最高且明显高于同时期雄鱼GATA4的表达量(P<0.01)，到60日龄期间表达量降低，从80日龄后又有上升趋势。各时期雌雄幼鱼，除40日龄外，其他各个时期在雄性中GATA4的表达量均高于在雌性中的表达量。

牙鲆emx1基因的克隆及表达

孙文慧, 张俊玲, 施志仪, 孙近近, 向玉婷, 陈晓武

2016, 32(6): 161-167. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.023

摘要 ( 253 )

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为阐述空通气孔同源框1(empty spiracles homeobox 1, emx1)基因在牙鲆发育中的作用，通过PCR技术克隆牙鲆emx1基因，运用BioEdit、MEGA等软件分析其序列结构特征，并采用荧光定量PCR技术分析其在牙鲆早期发育和组织分布中的表达情况。结果成功获得一长度为1 127 bp的牙鲆emx1 cDNA序列，其中包括708 bp的开放阅读框，编码235个氨基酸。同源性比对发现，牙鲆emx1基因的氨基酸序列与雀鲷和花鳉同源性最高，为95%，与其它物种如斑马鱼、墨西哥脂鲤、原鸡、热带爪蟾、小鼠和人的同源性分别为87%、84%、83%、80%、72%和72%。系统进化树分析显示，牙鲆Emx1蛋白与鱼类Emx1紧密聚为一支。荧光定量 PCR显示，emx1基因在牙鲆卵巢中的表达量丰富，精巢中次之，而在其他各组织的表达量则较低。emx1在从原肠胚到孵化后10 d的牙鲆早期发育中也发现了相对较高的表达，且在胚孔封闭和心跳期有最高的表达。结果表明emx1基因很可能在牙鲆早期发育和生殖系统中发挥重要作用。

一株拮抗稻瘟病菌细菌的筛选与鉴定

管玲莉, 任佐华, 李俊俊, 刘二明

2016, 32(6): 168-173. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.024

摘要 ( 286 )

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生防微生物是一种具有开发创新和环境友好的防控稻瘟病策略，旨在发掘高效生防微生物资源。于2014年从湖南桃江山区一季稻感病品种湘早籼24号的感稻瘟病稻丛的健康稻株中分离出817株菌株，采用平板对峙法，筛选出1株对稻瘟病菌具有高效抑制作用的拮抗细菌JN005，通过菌丝生长速率法测定其活体菌代谢产物对稻瘟病菌的抑菌率高达84%；并对另外5种植物病原真菌、4种植物病原细菌和大肠杆菌及金黄色葡萄球菌等11种菌作了抑菌谱测定。结果表明，JN005菌株对禾谷镰刀菌、水稻稻曲病菌有较好的抑制作用，其抑制率分别为70.1%和73.6%。通过形态学观察、生理生化测定及16S rDNA序列系统发育分析，将JN005菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究

刘蒲临, 程德勇, 缪礼鸿

2016, 32(6): 174-180. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.025

摘要 ( 341 )

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筛选并鉴定高产几丁质酶的芽孢杆菌菌株，旨在研究其酶学特性为高效利用几丁质酶资源奠定基础。分离纯化产几丁质酶芽孢杆菌，将目的菌株的几丁质酶基因异源表达并纯化后研究其酶学参数。考虑到菌株的生物安全性，选择侧孢短芽孢杆菌CDY64为进一步研究对象，将其几丁质酶基因表达于大肠杆菌BL21中。酶学研究表明，纯化后的几丁质酶最适反应温度为60℃，在pH6.0-8.0范围内均表现出良好的活性；使用胶体几丁质作为底物时Km与kcat值分别为5.85 μmol/L和29.27 S^-1。结果表明，侧孢短芽孢杆菌CDY64所产几丁质酶在高温下具有良好的催化能力，在体外对多种植物病原真菌表现出了良好的拮抗作用。

产绿原酸内生菌细胞色素P450基因的克隆和功能研究

王川, 李丽, 魏丕伟, 黄非

2016, 32(6): 181-186. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.026

摘要 ( 243 )

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以一株产绿原酸的内生枯草芽孢杆菌为基础，对其绿原酸途径的关键酶基因进行克隆和功能研究。克隆该内生菌的细胞色素P450基因并进行原核表达，对重组蛋白进行肉桂酸羟基化酶(C4H)酶活测定。结果显示，从内生菌中克隆了4个细胞色素P450酶系基因并进行了原核表达，其中P-4重组蛋白具有C4H活性，产生的香豆酸与LC-MS检测的结果一致，该酶的最适温度范围较宽，产物香豆酸对该酶有抑制作用。该内生菌可能利用其细胞色素P450酶系作为C4H的同工酶从而将产物导入绿原酸合成途径。

应用比色法检测枯草芽孢杆菌变异菌株中1-脱氧野尻霉素含量

龙玲, 杨艳, 朱乃硕

2016, 32(6): 187-192. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.027

摘要 ( 310 )

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为寻找测定枯草芽孢杆菌黑色变种突变株Bacillus subtilis var. niger-231(B-231)的发酵液中1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)的新方法并提高其产发酵液中DNJ的含量。在有铜离子的存在下，DNJ与二硫化碳反应，用有机溶剂对产物萃取后在440 nm进行光度测定，得到DNJ含量。再采用紫外诱变方法处理突变株B-231。绘制了检测DNJ标准品的标准曲线，对测定DNJ的新方法做了精密度、灵敏度、准确度以及产物的稳定性的探讨，设计正交试验优化了反应条件，并将此方法运用到细菌发酵液中DNJ含量的测定中，通过遗传诱变手段处理原始细菌B-231，最终筛选到一株高产DNJ的菌株，命名为B. subtilis var. niger- 431(B-431)，DNJ含量达87.3 mg/L，其产生DNJ的量较原始菌株原突变株提高了4.2倍。首次提出了一种快速测定细菌发酵液中的1-脱氧野尻霉素的新方法，紫外诱变手段使细菌产生DNJ的能力有较大提高。

海洋细菌L1-9双抗菌株的定殖能力及其对黄瓜枯萎病的防治作用

王军强, 汪晶晶, 王琦, 马桂珍, 暴增海, 王淑芳, 周向红

2016, 32(6): 193-198. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.028

摘要 ( 231 )

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采用抗生素标记法，对海洋多黏类芽孢杆菌L₁-9菌株进行标记，抗性菌株L₁-9^Str，rif对链霉素和利福平的抗性浓度分别为160 μg/mL 和20 μg/mL。双抗菌株L₁-9^Str，rif的抑菌特性及其对链霉素和利福平的抗性经多次传代仍比较稳定。盆栽试验表明，该双抗菌株能在黄瓜根部土壤及根组织、茎基部、子叶和真叶组织中定殖。菌株L₁-9^Str，rif在黄瓜外根际、根际和根表土壤及黄瓜组织中的定殖动态基本一致，初期黄瓜组织中L₁-9^Str，rif菌量较少，随着时间的延长，菌量逐渐增加，达到高峰后逐渐减少。菌株L₁-9^Str，rif在根表土壤中菌量最多(1.76×10⁹ CFU/g)，其次是根际土壤，外根际土壤中菌量较少；在黄瓜组织中，菌株L₁-9^Str，rif其在子叶中的定殖能力最强(5.63×10⁴ CFU/g)，其次是根和茎基部(0-2 cm)；调查至第26 d时在根部土壤中的含菌量仍保持在稳定的水平，其中根表土壤中含菌量最高(2.41×10⁷ CFU/g)，在黄瓜组织样品中，子叶中的含菌量最高(4.15×10⁴ CFU/g)；温室防病实验结果表明，菌株L₁-9和L₁-9^Str，rif菌株对黄瓜枯萎病具有良好的防治效果，不同时期防效均达70 %以上。上述结果表明来自海洋的多黏类芽孢杆菌L₁-9菌株能在黄瓜根部土壤及幼苗组织中定殖，是一株有潜力的黄瓜枯萎病生防菌株。

重组谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的工艺条件优化

黄燕, 宿玲恰, 吴敬

2016, 32(6): 199-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.029

摘要 ( 323 )

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谷氨酸脱羧酶，一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶，能专一、不可逆地催化L-谷氨酸脱羧得到γ-氨基丁酸(GABA)。构建了产Lactobacillus brevis WJH3 谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a-gad，以此作为菌种进行摇瓶发酵诱导培养，发酵过程中一次性添加0.05 mmol/L PLP培养24 h，破壁上清酶活达81.7 U/mL，是不添加PLP对照酶活的1.8倍。对酶转化L-谷氨酸钠生成GABA反应条件进行了优化，结果表明，在转化体系不添加PLP的情况下，底物谷氨酸钠浓度为250 g/L，反应初始pH5.0，温度37℃，加酶量60 U/g 底物，转速200 r/min，在此条件下反应18 h，GABA转化率达到100%，为γ-氨基丁酸的工业化生产奠定基础。

土壤中木霉的分离及其对毒死蜱降解特性研究

张广志, 张新建, 李红梅, 郭凯, 杨合同

2016, 32(6): 205-210. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.030

摘要 ( 239 )

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为挖掘保护地土壤中的能降解毒死蜱的木霉资源，从长期污染的土壤中共分离6个不同木霉菌株，通过形态学特征和ITS rDNA序列对各菌株进行鉴定，6个菌株分别为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(T. viride)、康宁木霉(T. koningii)、拟康宁木霉(T. koningiopsis)、长枝木霉(T. longibrachiatum)和短密木霉(T. brevicompactum)。选择降解活性最高的长枝木霉TC5菌株，测定各种条件下对毒死蜱的降解特性。结果表明，木霉TC5在中性或偏碱性条件下对毒死蜱具有更好的降解活性；添加碳源或提高木霉的接种浓度，能提高对毒死蜱的降解活性；在50-300 mg/L范围内，随毒死蜱浓度升高，木霉的降解活性也明显提高。盆栽试验中木霉TC5对毒死蜱保持较强的降解活性，但在自然土壤中降解活性显著低于在灭菌土壤中。分离的木霉菌株在土壤农药污染修复方面具有应用开发潜力。

同源异型框蛋白Msx1的两个新的磷酸化位点的鉴定

程庆灵, 王敬强,

2016, 32(6): 211-218. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.031

摘要 ( 232 )

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同源异型框蛋白Msx1的同系物Msx2中已鉴定出磷酸化修饰位点，并且发挥着重要的生物学功能。但是对Msx1的磷酸化修饰情况还不清楚，为了对Msx1的磷酸化修饰情况进行研究。利用生物信息学的方法对Msx1的磷酸化修饰位点进行预测，进一步利用免疫沉淀和质谱技术对其进行具体实验验证。C2C12细胞中的Msx1蛋白复合物经胰蛋白酶消化后，通过高效液相色谱和质谱技术进行分离和分析。结果发现两个新的磷酸化修饰位点，分别是152位的丝氨酸和160位的丝氨酸，而且两个磷酸化位点在人和小鼠中是高度保守的。进一步，制备针对这两个磷酸化位点的特异性磷酸化抗体。磷酸化位点的鉴定以及特异性抗体的获得为进一步研究Msx1的生物学功能提供了良好的条件。

重组融合蛋白Trx-IFN-CSP复性工艺研究

黄演婷, 卢雪梅, 杨小蓉, 金小宝, 朱家勇

2016, 32(6): 219-225. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.032

摘要 ( 263 )

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旨在建立并优化融合蛋白Trx-IFN-CSP的复性工艺。对重组融合Trx-IFN-CSP进行体外复性研究，考查pH、温度、蛋白浓度、氧化还原体系及辅助复性小分子等复性条件对融合蛋白重折叠的影响。结果显示，适合Trx-IFN-CSP复性的方法为，反复冻融联合超声破菌获得包涵体；用含有1% TritonX-100、2 mol/L尿素、2% DOC洗涤液初步纯化包涵体；再用6 mol/L盐酸胍溶解液变性包涵体；脉冲加样稀释变性液后4℃条件下梯度透析复性，使用L-Arg辅助复性。经肠激酶切去Trx标签后，每升发酵液最终获得110-130 mg肝靶向干扰素，每批蛋白纯度都在95%以上，比活性在1.9-2.4×10⁸ U/mg之间，制备工艺稳定。

重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究

梁果义, 甘一迪, 刘晓航, 蔡祥胜

2016, 32(6): 226-230. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.033

摘要 ( 329 )

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为了提高胰岛素在酵母的分泌表达效率，首先合成了胰岛素原基因，并在其序列的N端引入了一段引导肽，构建成pPICZα-A-Pro-INS重组分泌型表达载体。将表达载体线性化处理后电击转化毕赤酵母GSll5感受态细胞，筛选获得分泌型高表达工程菌株，重组蛋白的表达水平为300 mg/L，占分泌总蛋白的40％左右。该结果表达明引导肽的存在对于在毕赤酵母中高效表达胰岛素的基因至关重要。

八株海洋微藻Nannochloris sp.生长及生化性状评价

陈程浩, 吴嘉仪, 汤明星, 李涛, 吴华莲, 王广华, 戴世鲲, 向文洲

2016, 32(6): 231-237. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.034

摘要 ( 322 )

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通过对从南海海域筛选分离纯化的8株Nannochloris sp.海洋微藻进行生长和生化特性分析，评估该属微藻的生产应用潜力。采用干重法、索氏提取法、凯氏定氮法、苯酚硫酸法、气相色谱质谱联用分别测定微藻生长以及油脂、蛋白质、多糖含量及脂肪酸组成。结果表明，8株微藻的最大生物量干重为0.39-0.91 g/L，生长最快的为SCS-761藻株；总脂含量为(19.06-33.67)%，其中SCS-249、SCS-589、SCS-655藻株总脂含量超过25%，且SCS-655藻株油脂产率高达22.23 ± 0.71 mg/(L·d)；SCS-249、SCS-325、SCS-355、SCS-640、SCS-769藻株蛋白质含量超过30%，其中SCS-640藻株蛋白质含量最高(36.70 ± 2.20)%；而各株藻的多糖含量介于19.23%-29.34%，其中SCS-761最高，SCS-655最低。另外，脂肪酸组成分析结果显示8株微藻的脂肪酸组成结构相似，主要为C16饱和脂肪酸和C18系脂肪酸。不饱和脂肪酸以亚油酸相对含量最高，SCS-249、SCS-355、SCS-761藻株亚油酸相对含量超过40%。海洋微藻Nannochloris生物活性物质资源丰富，含有较高的脂质、蛋白质和亚油酸含量，应用潜力可观，应对该属微藻进行更为深入的研究开发，为该属微藻高值化综合性开发奠定基础。

三株栅藻属藻株光合自养产油脂的比较研究

陈传红, 吴洪, 李青, 尹顺吉, 罗少敬, 崔春莉

2016, 32(6): 238-243. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.035

摘要 ( 269 )

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通过柱式光生物反应器培养，比较研究三株栅藻(Scenedesmus sp简写S. sp、Scenedesmus deserticola、Scenedesmus dimorphus)的生长及油脂含量情况，得出3株藻生物量最高的是S. deserticola 为0.48 g/(L·d)；其次是S. sp为0.41 g/(L·d)；S. dimorphus产量最低为0.35 g/(L·d)。且培养后期经尼罗红染色清楚可见油脂分布，其中S. deserticola总脂含量达到了干重的55.3 %，总脂产量为0.29 g/(L·d)；S. dimorphus为46.7 %，0.18 g/(L·d)；S. sp为43.6 %，0.20 g/(L·d)。三株栅藻主要脂肪酸为C18和C16，占总脂肪酸组成的85 %以上，符合生物柴油的生产要求。综合比较，S. deserticola是一株性能优良的产油藻株。

阿霉素诱导下的肝癌细胞HepG2中微小RNA差异表达分析

杨亚蓝, 郭志云, 丁若凡, 茆灿泉, 郭建秀, 熊莉丽

2016, 32(6): 244-249. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.036

摘要 ( 226 )

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旨在研究阿霉素诱导引起的DNA损伤压力下，肝癌细胞HepG2中参与DNA损伤应答的miRNA，并分析这些miRNA靶基因参与肝癌DNA损伤应答相关的生物学进程与通路。通过小RNA测序检测阿霉素处理肝癌细胞HepG2前后miRNA的差异表达情况，使用GO与KEGG通路富集方法对差异表达miRNA靶基因进行功能富集分析。结果显示，共检测出显著表达差异miRNA 68个，其中上调13个，下调55个。miRNA靶基因的功能分析结果显示，53条miRNAs靶基因显著富集于调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和细胞周期等与DNA损伤应答以及肿瘤相关的生物进程和信号通路，包括p53信号通路、癌症通路、Wnt信号通路和MAPK信号通路等。研究表明，在阿霉素诱导下，HepG2中的差异表达miRNAs与DNA损伤相关的肿瘤生物学进程以及信号通路显著相关，预示这些miRNAs在阿霉素引发的肝细胞癌DNA损伤应答中起着重要的作用。

DHP-半乳糖复合体制备多孔生物载体及其在人体肝细胞培养中的应用

吴晨曦, 谢益民, 叶哲孜, 王鹏, 乐喜

2016, 32(6): 250-257. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.037

摘要 ( 241 )

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为了使木素脱氢聚合物(DHP)与人体肝细胞之间有更好的生物相容性，使用DHP和D-半乳糖进行接枝共聚，通过水凝胶的方法制备医用多孔生物载体。利用红外光谱、核磁共振波谱、比表面积测定仪及扫描电子显微镜对多孔生物载体的主要成分含量、物理和化学结构以及表面形态进行分析，并对体外培养中的肝细胞形态与代谢活性进行检测。结果表明，以DHP与D-半乳糖的接枝共聚产物作为原料可以制备性能良好的多孔生物载体，比表面积为6.013 m²/g。使用此多孔生物载体对人体肝细胞进行培养，人体肝细胞能够健康地附着在DHP多孔生物载体上生长增殖。根据含半乳糖的生物载体白蛋白分泌和葡萄糖代谢结果，最大值分别为：9.85 g/(d·L)、16.134 mmol/(d·L)，说明肝细胞在培养阶段中具有较高的代谢活性，DHP与D-半乳糖的接枝共聚产物制备的多孔生物载体具有良好的生物相容性。

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2016, 32(6): 300-300.

摘要 ( 153 )

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