人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

刘凯胜;王绍祥;刘忠;张嘉萱;张庶民;王一飞;

暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心;中国药品生物制品检定所;

出版日期:2011-10-26 发布日期:2011-10-26
基金资助:
国家高技术研究发展计划“863”计划(2007AA02Z142)

Published:2011-10-26 Online:2011-10-26

摘要/Abstract

摘要： 通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+)-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础。提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA。以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90AB1。将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经NdeⅠ和SalⅠ双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆。挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+)-hHsp90AB1。重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13%。接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶亲和层析,蛋白纯度达到98%。

关键词: 热休克蛋白90AB1(Hsp90β), 克隆, 原核表达, 中试发酵, 纯化

刘凯胜;王绍祥;刘忠;张嘉萱;张庶民;王一飞;. 人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化[J]. .

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