生物技术通报 ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (5): 259-266.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1404
崔祥华1,2(), 陶南2, 程波普1,2, 赵永昌2, 陈卫民2, 李靖1()
收稿日期:
2020-11-18
出版日期:
2021-05-26
发布日期:
2021-06-11
作者简介:
崔祥华,男,硕士研究生,研究方向:资源微生物的开发与利用;E-mail: 基金资助:
CUI Xiang-hua1,2(), TAO Nan2, CHENG Bo-pu1,2, ZHAO Yong-chang2, CHEN Wei-min2, LI Jing1()
Received:
2020-11-18
Published:
2021-05-26
Online:
2021-06-11
摘要:
柱状田头菇(茶树菇)Cyclocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有很高的经济价值。构建高效表达的遗传转化体系,可以深入揭示其遗传特征及基因功能。以柱状田头菇YSG为实验材料,使用多片段重组克隆构建载体,PEG介导的原生质体转化,并以qRT-PCR为测定方法,对actin、gpd和Pumgpd不同长度5个启动子片段驱动靶标基因的表达量进行分析。依据actin基因启动子构建的载体pAa-actin-1和pAa-actin-2获得转化子中,靶标基因表达量为对照3倍以上转化子数量分别为50%和33.33%,最高表达量分别为对照的10.45和6.23倍;携带pAa-gpd-1、pAa-gpd-2和pAa-Pumgpd启动子的载体获得的转化子中,表达量为对照3倍以上的数量分别为0、28.57%和25%,最高表达量分别为对照的2.93、7.75和4.31倍。actin启动子获得高表达转化子得率较gpd和Pumgpd启动子片段高,适用于柱状田头菇转化体系构建。
崔祥华, 陶南, 程波普, 赵永昌, 陈卫民, 李靖. 柱状田头菇遗传转化体系启动子的筛选[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 259-266.
CUI Xiang-hua, TAO Nan, CHENG Bo-pu, ZHAO Yong-chang, CHEN Wei-min, LI Jing. Screening Promoters for Genetic Transformation of Cyclocybe aegerita[J]. Biotechnology Bulletin, 2021, 37(5): 259-266.
引物Primer | 序列Sequence(5'-3') | 用途 Function |
---|---|---|
actin-1-F | gagacggtccagcatctgcagCTCATACCCCGCTCTCACCG | actin-1扩增 |
actin-1-R | cgtttcaggaccatGGCTATTATTCGTTACGGTGAAGA | |
gpd-1-F | gagacggtccagcatctgcagGGCGCCCAGTAGTTGGGA | gpd-1扩增 |
gpd-1-R | ttcaggaccatCGCCGTAAACGAGAGATCTAGC | |
actin-2-F | gagacggtccagcatctgcagGTACAGGATCCTGAGTTTGTTAACCTT | actin-2扩增 |
actin-2-R | cgtttcaggaccatGGCTATTATTCGTTACGGTGAAGA | |
gpd-2-F | gagacggtccagcatctgcagCACTGGGTTGCTGGCCAA | gpd-2扩增 |
gpd-2-R | ttcaggaccatCGCCGTAAACGAGAGATCTAGC | |
Pumgpd-F | gagacggtccagcatctgcagAGATCTTGCTGATAGGCAGGTTTG | Pumgpd扩增 |
Pumgpd-R | gcgtttcaggaccatTATGGAAGAGTGTTTTGGTTTCGA | |
Mek-A1-F | atagccATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-A1扩增 |
Mek-A1-R | tcgcccttcgagaccggatccTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-G1-F | tttacggcgATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-G1扩增 |
Mek-G1-R | tcgcccttcgagaccggatccTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-A2-F | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | Mek-A2扩增 |
Mek-A2-R | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-G2-F | tttacggcgATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-G2扩增 |
Mek-G2-R | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-PG-F | ccataATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-PG扩增 |
Mek-PG-R | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
pAa-F | GAACGAGGCTTATGTCCACT | 转化片段扩增 |
pAa -R | GGTCTAGCCTGGTCACTGTC | |
PM-F | AAGAGGTGCTATGGGCTACG | 转化子验证 |
PM-R | CCCTTATCTGGGAACTACTCAC | |
qMek-F | GCCACACTGCCCACAGAATA | mek基因表达水平 |
qMek-R | AGGCTGACTTGAAGCACTTTC | |
qgpd-F | TCATCAATGGCAAGCCTG | 内参基因表达水平 |
qgpd-R | CCAAGTTCACACCACAGACG |
表1 载体构建和基因表达引物及其序列
Table1 Primer sequences for plasmid construction and gene expression
引物Primer | 序列Sequence(5'-3') | 用途 Function |
---|---|---|
actin-1-F | gagacggtccagcatctgcagCTCATACCCCGCTCTCACCG | actin-1扩增 |
actin-1-R | cgtttcaggaccatGGCTATTATTCGTTACGGTGAAGA | |
gpd-1-F | gagacggtccagcatctgcagGGCGCCCAGTAGTTGGGA | gpd-1扩增 |
gpd-1-R | ttcaggaccatCGCCGTAAACGAGAGATCTAGC | |
actin-2-F | gagacggtccagcatctgcagGTACAGGATCCTGAGTTTGTTAACCTT | actin-2扩增 |
actin-2-R | cgtttcaggaccatGGCTATTATTCGTTACGGTGAAGA | |
gpd-2-F | gagacggtccagcatctgcagCACTGGGTTGCTGGCCAA | gpd-2扩增 |
gpd-2-R | ttcaggaccatCGCCGTAAACGAGAGATCTAGC | |
Pumgpd-F | gagacggtccagcatctgcagAGATCTTGCTGATAGGCAGGTTTG | Pumgpd扩增 |
Pumgpd-R | gcgtttcaggaccatTATGGAAGAGTGTTTTGGTTTCGA | |
Mek-A1-F | atagccATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-A1扩增 |
Mek-A1-R | tcgcccttcgagaccggatccTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-G1-F | tttacggcgATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-G1扩增 |
Mek-G1-R | tcgcccttcgagaccggatccTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-A2-F | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | Mek-A2扩增 |
Mek-A2-R | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-G2-F | tttacggcgATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-G2扩增 |
Mek-G2-R | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
Mek-PG-F | ccataATGGTCCTGAAACGCAAACG | Mek-PG扩增 |
Mek-PG-R | tcgagaccggatccgccatggTCAATTATCGTCATAAGCCTGGAA | |
pAa-F | GAACGAGGCTTATGTCCACT | 转化片段扩增 |
pAa -R | GGTCTAGCCTGGTCACTGTC | |
PM-F | AAGAGGTGCTATGGGCTACG | 转化子验证 |
PM-R | CCCTTATCTGGGAACTACTCAC | |
qMek-F | GCCACACTGCCCACAGAATA | mek基因表达水平 |
qMek-R | AGGCTGACTTGAAGCACTTTC | |
qgpd-F | TCATCAATGGCAAGCCTG | 内参基因表达水平 |
qgpd-R | CCAAGTTCACACCACAGACG |
图1 载体构建示意图 重组质粒的LB、RB区间。LB和RB:农杆菌T-DNA的左边界和右边界
Fig. 1 Schematic diagram of plasmid construction LB and RB intervals of the recombinant plasmid. LB and RB:Left border and right border sequences of Agrobacterium T-DNA
图2 启动子与mek片段扩增 M:DL2000 marker;A:1-2分别为启动子actin-1、gpd-1;B:1-3分别为actin-2、gpd-2和Pumgpd;C:1-5分别为Mek-A1、Mek-G1、Mek-A2、Mek-G2和Mek-PG片段
Fig.2 Amplification fragments of promoters and mek M: DL2000 marker. A: 1-2: Promoter actin-1, gpd-1. B: 1-3:Promoter actin-2, gpd-2 and Pumgpd.C: 1-5:Fragment Mek-A1, Mek-G1, Mek-A2, Mek-G2 and Mek-PG
图3 启动子序列元件特征 A:actin启动子序列;B:gpd启动子序列;C:Pumgpd启动子序列。边框序列表示启动子元件
Fig.3 Characterization of promoter sequences and elements A: actin promoter sequence. B: gpd promoter sequence. C: Pumgpd promoter sequence. The promoter elements shown in the box
图4 重组质粒中转化片段扩增 M:DL10000 DNA marker; 1-5:为pAa-actin-1、pAa-actin-2、pAa-gpd-1、pAa-gpd-2和pAa-Pumgpd长片段
Fig.4 Amplification of transformation fragments in the recombinant plasmids M: DL10000 DNA marker. 1-5:The large fragments of pAa-actin-1, pAa-actin-2, pAa-gpd-1, pAa-gpd-2 and pAa-Pumgpd
图5 潮霉素抗性平板上转化子的筛选 A:转化子的初选;a:对照;b-f:转化子;箭头指示长出的转化子。B:转化子的复筛;g:野生型YSG;h-l:复筛转化子
Fig.5 Screening of transformants on HYG plates A: Primary screening of transformants, a: the control, b-f: transformants, the arrows show the transformants. B: Rescreening of transformants, g: wild type, h-l: Rescreening transformants
图6 部分转化子PCR验证 M:DL5000 DNA marker;1-4:pAa-actin-1转化子;5-8:pAa-actin-2转化子;9-12:pAa-gpd-1转化子;13-16:pAa-gpd-2转化子;17-20:pAa-Pumgpd转化子
Fig.6 PCR verification of partial transformants M:DL5000 DNA marker. 1-4:transformants of pAa-actin-1. 5-8:transformants of pAa-actin-2. 9-12:transformants of pAa-gpd-1. 13-16:transformants of pAa-gpd-2. 17-20:transformants of pAa-Pumgpd
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