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2021年 第37卷 第5期    刊出日期：2021-05-26

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研究报告

玉米转录因子NAC78的克隆及表达特性分析

何姗, 王智康, 杨阳, 牟玥薇, 黄玉碧, 余国武

2021, 37(5):  1-10.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1155

摘要 ( 695 )   HTML ( 49)   PDF (3788KB) ( 562 )  

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NAC（NAM,ATAF1/2,CUC2）家族转录因子在调控植物生长发育、响应逆境胁迫及激素信号转导等方面起着重要作用,探究其功能可为解析玉米对逆境的响应机制提供基础。通过RT-PCR克隆得到了玉米转录因子NAC78的CDS序列,通过生物信息学方法分析NAC78的特点,用荧光定量检测了NAC78的组织表达特性及对逆境胁迫的响应情况。结果显示,NAC78基因的开放阅读框长1 830 bp,编码609个氨基酸,蛋白分子量为67.45 kD,等电点5.19。NAC78蛋白质N端含有一个保守的NAM结构域,由8个α螺旋和7个β片层构成。进化树分析结果表明NAC78与谷子NAC86亲缘关系最近。NAC78在玉米各组织中均表达,在胚乳中的表达量显著高于其他组织;在胚乳发育的过程中,NAC78的表达变化呈现先增加后降低的趋势,授粉后15 d的相对表达量较第5天增加52.52倍;NAC78的表达受到ABA、NaCl和PEG的诱导,在3种处理下均呈现先增加后降低的趋势,在ABA处理籽粒6 h后相对表达量较0 h增加了11.4倍,NaCl和PEG处理植株6 h后在叶片中的相对表达量分别增加了1.87和2.69倍。NAC78在玉米胚乳中表达量显著高于其他组织,并对ABA、NaCl和PEG处理有不同程度的响应。

马铃薯StSN2的克隆、定位及表达分析

彭洁, 邓孟胜, 张杰, 刘石锋, 罗李飞, 王西瑶

2021, 37(5):  11-18.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1198

摘要 ( 673 )   HTML ( 27)   PDF (4295KB) ( 465 )  

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Snakin-2（StSN2）属于Snakin/GASA家族,GASAs在调控植物生长发育与抗逆性具有重要作用。克隆StSN2,研究StSN2在马铃薯块茎休眠过程中的功能,为进一步探究StSN2与马铃薯块茎休眠的关系提供理论依据。以马铃薯品种“川芋10号”为材料,克隆StSN2全长CDS序列,并进行生物信息学分析,再利用qRT-PCR分析其组织表达特异性、休眠释放过程表达变化以及对激素的响应情况。结果表明,StSN2开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸,相对分子质量约为11.04 kD,理论等电点为8.91;马铃薯StSN2与番茄、茄子、烟草等茄科植物亲缘关系较近;烟草瞬时表达结果显示该蛋白定位于细胞核、质膜;组织表达分析表明,StSN2在各组织中均有表达,以块茎最高,其次是叶片、根,在茎、花蕾、叶柄最低;进一步研究发现,StSN2表达受ABA、BR以及GA₃调控,尤其是显著响应休眠激素ABA的诱导,并且其表达随休眠的释放而降低,表明StSN2可能参与激素对马铃薯休眠的调控。

陆地棉与野生斯特提棉远缘杂种性状鉴定及遗传解析

赵祝跃, 申状状, 王一帆, 杨亚杰, 荣二花, 吴玉香

2021, 37(5):  19-27.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1359

摘要 ( 426 )   HTML ( 11)   PDF (4334KB) ( 392 )  

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棉花远缘杂交是种质创新和新品种选育的重要途径。以实验室前期合成的陆地棉与野生斯特提棉远缘杂种为材料,对其进行形态学、细胞遗传学及SSR分子标记鉴定。形态学分别从植株、叶片和花三方面进行了双亲和杂种的分析比较,结果表明杂种植株高于双亲,叶片大于双亲,表现出显著的杂种优势;叶色与父本相近,为翠绿色,杂种花基部花斑与父本相近,为深红色;细胞遗传学上对杂种进行了花粉母细胞减数分裂观察,结果表明不育杂种F₁在减数分裂过程中出现许多异常行为,其中二分体占24.00%,三分体占10.40%,四分体占40.60%,多分体占25.00%。在四分体中,正常四分体占72.91%,异常占27.09%,以至于最后形成很多异常花粉粒,所占比例为24.00%,正常花粉粒占76.00%,这是杂种不育的主要原因;最后通过SSR分子标记鉴定结果表明,杂种F1不仅扩增出双亲的互补带,还扩增出双亲没有的特异性条带,遗传成分比例分别为：父本占7.69%,母本占34.62%,双亲的互补带占23.07%,特异性新带占34.62%,既表明在杂交过程中发生了基因重组,也从分子水平证实了该杂种是陆地棉和斯特提棉的真杂种,同时为棉花遗传育种和种质创新提供了有价值的材料。

春兰miR396过表达对拟南芥叶片生长、光合及叶绿素荧光特性的影响

徐子涵, 刘倩, 苗大鹏, 陈跃, 胡凤荣

2021, 37(5):  28-37.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1203

摘要 ( 490 )   HTML ( 11)   PDF (4269KB) ( 492 )  

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为研究春兰miR396（cgo-miR396）基因在植物叶片生长发育中的作用,针对春兰的栽培和生产提供新的研究思路。将该基因前体cgo-MIR396在拟南芥中过量表达,观察其形态指标的变化并对相应的光合和叶绿素荧光参数进行测定。春兰miR396基因在花期叶片中的表达量最高,过表达该基因可以显著增加拟南芥的叶长、叶宽、叶面积和株高,并明显降低叶片的叶绿素含量、气孔导度（gs）和蒸腾速率（Tr）,提高了水分利用效率（WUE）;另外,cgo-miR396的过表达还导致反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额（φEo）、性能指数（PI_ABS）、推动力（DF_ABS）等叶绿素荧光参数的下降。春兰miR396主要于生殖生长时期发挥作用,在保证净光合效率和叶片生长发育的同时,适当降低了叶片的气孔导度及PSII受体侧的部分性能。

球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）叶绿体基因组特征及亲缘关系解析

朱斌, 甘晨晨, 王洪程

2021, 37(5):  38-47.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1380

摘要 ( 465 )   HTML ( 10)   PDF (3769KB) ( 408 )  

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球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）主要分布在我国云南地区,是非常重要的传统中药材及观赏花卉。本研究整合二代、三代测序数据,从头组装了球花石斛的完整叶绿体基因组。球花石斛叶绿体基因组全长151 686 bp,为典型的四分结构,包含106个unigenes,其中编码基因71个,tRNA 31个,rRNA 4个。球花石斛叶绿体基因组检测到58个SSR（simple sequence repeat）位点,以单碱基重复A/T类型为主。密码子偏好性分析显示,亮氨酸为使用频率最高的氨基酸（10.15%）,具有偏好性的密码子有31个,且绝大多数偏好性密码子以A/U结尾。通过共有编码基因序列（coding sequence,CDs）对27种石斛进行系统进化分析,将所选石斛分为9大类群,其中球花石斛与霍山石斛亲缘关系密切。本研究结果阐明了球花石斛的叶绿体基因组特征,为其资源筛选、鉴定,遗传多样性分析提供分子依据。

虎杖PcMYB1启动子的克隆及其活性分析

林艳丽, 覃建兵, 伍翔, 王岩岩, 潘佑找, 柳忠玉

2021, 37(5):  48-55.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1319

摘要 ( 349 )   HTML ( 14)   PDF (3542KB) ( 342 )  

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获得药用植物虎杖（Polygonum cuspidatum）PcMYB1启动子,并分析其活性,为进一步研究虎杖转录因子PcMYB1的功能奠定基础。通过hiTAIL-PCR方法,从虎杖叶片基因组DNA中克隆PcMYB1启动子并进行生物信息学分析。分别构建由全长启动子或5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS。将重组表达载体转入发根农杆菌中进行虎杖毛状根转化试验,以转化的阳性毛状根为材料,通过GUS组织化学染色分析启动子的活性。成功获得2 884 bp的PcMYB1启动子序列（GenBank登录号MT811057）。该启动子具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,还含有茉莉酸甲酯和低温响应元件以及光响应、厌氧应答等相关的顺式调控元件。重组表达载体经PCR鉴定,证实已构建成功。转化的虎杖毛状根染色之后显蓝色,但同对照相比颜色较浅,说明全长启动子或5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。PcMYB1的启动子被成功克隆,其具有驱动下游GUS表达的活性。

无菌猪和普通猪早期脂肪发育及脂肪组织基因转录表达的差异

邱小宇, 刘作华, 齐仁立

2021, 37(5):  56-66.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0919

摘要 ( 588 )   HTML ( 12)   PDF (8164KB) ( 189 )  

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通过比较无菌仔猪和普通仔猪在生长早期脂肪沉积的差异及脂肪组织基因转录表达谱的不同,评估肠道微生物定植对猪脂肪组织早期发育的直接影响。分别采集25日龄无菌仔猪（3头）和普通仔猪（3头）的颈部皮下脂肪,切片后经HE染色观察不同猪脂肪细胞的形态差异;Western Blot检测脂肪合成调控因子的蛋白表达差异;ELISA法测定不同猪脂肪组织分泌产生的脂肪细胞因子含量;转录组测序（RNA-seq）分析不同猪脂肪组织中的基因表达谱,鉴定关键差异基因及其相关信号网络。与普通仔猪相比,相同日龄的无菌仔猪体脂沉积量较少,皮下脂肪厚度和脂肪细胞尺寸均明显减小（P<0.001）;脂肪组织中的脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4,FABP4）、过氧化物酶体增殖体激活受体γ（peroxisome proliferators activated recepor γ,PPARγ）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase,ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）的蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。脂肪产生的功能性细胞因子脂联素（adiponectin,P=0.100）和瘦素（leptin,P=0.095）有着不同程度的减少。测序结果显示与普通猪相比,无菌猪的脂肪中有695个基因显著差异表达（P<0.05）,包括338个基因表达上调,357个基因表达下调。qRT-PCR验证了转录组测序结果的准确性。KEGG通路富集分析结果显示差异基因主要与脂质合成代谢、分解代谢、脂质氧化、能量稳态相关。肠道微生物的定植显著影响了动物脂肪组织的发育、代谢和生理功能。

切割小鼠X染色体的CRISPR/Cas9系统表达载体的构建及验证

谢绍怡, 蒋璐蔓, 杨晓峰, 张仙玉, 吴珍芳, 李紫聪

2021, 37(5):  67-75.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0963

摘要 ( 440 )   HTML ( 14)   PDF (3288KB) ( 210 )  

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性别控制技术在畜牧业生产、濒危动物保护、伴性疾病预防等方面都有着重要的意义,但是目前较为有效的精子分离技术却因成本高昂、技术难度大的问题无法广泛应用于畜禽生产上。受在蚊子上成功实现性别控制的研究启发,本实验设计了两个靶向小鼠X染色体重复序列的sgRNA,构建了含有靶向切割小鼠X染色体的CRISPR/Cas9系统的CMV载体,并对其进行体外、细胞及胚胎水平上的切割效率验证。结果显示：sgRNA X1和sgRNA X3体外介导的Cas9蛋白切割靶序列的效率分别为60.0%和75.0%;CMV载体成功转染MLTC-1细胞后,死亡率与对照组（转染空载体）相比显著提高;CMV载体对X1靶位点的突变效率为11.1%;与对照组相比,小鼠孤雌胚胎注射CMV载体后囊胚率有一定的下降,但未达到显著水平,而囊胚细胞数则显著下降（P<0.01）。实验证明了CMV载体在体外、细胞及胚胎水平上均具有较高的切割效率,能够成功删除X染色体,可用于减少某一性别的精子或胚胎,从而实现哺乳动物的性别控制。

白斑狗鱼早期发育阶段的高温耐受性分析

张钰, 海萨·艾也力汗, 热比古丽·沙吾提, 时春明, 张人铭

2021, 37(5):  76-83.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1335

摘要 ( 375 )   HTML ( 3)   PDF (2871KB) ( 146 )  

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对白斑狗鱼早期发育阶段的高温耐受性进行分析,旨为白斑狗鱼的养殖和生态适应性研究奠定理论基础。采用高温胁迫法研究白斑狗鱼受精卵及仔鱼的高温耐受性,用24hUILT₅₀和CT_max进行评估;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术和相对定量2^-ΔΔCt法,分别比较了不同温度和不同时间高温胁迫下HSP70基因在白斑狗鱼幼鱼脑、鳃、心和肝各组织中的表达情况。结果显示,白斑狗鱼受精卵破膜时间随着孵化温度的上升逐渐缩短,鱼苗上浮率呈现先缓慢上升后急剧下降的趋势。随着驯化水温的提高,白斑狗鱼仔鱼在高温胁迫下的24hUILT₅₀值升高,且CT_max出现的时间推迟。在不同温度高温胁迫下,白斑狗鱼幼鱼脑、鳃和心脏组织HSP70基因的表达量呈现先上升后下降的趋势,肝脏组织呈现持续上升的趋势。白斑狗鱼幼鱼脑、鳃和心脏组织在30℃高温胁迫0-24 h时,HSP70基因的表达量呈现先上升后下降的趋势,肝脏组织呈现先下降后上升再下降的趋势。白斑狗鱼幼鱼的脑、鳃、心和肝4种组织在不同温度和不同时间的高温胁迫下,HSP70基因的表达量发生不同程度的变化,其变化具有时间和组织特异性,但应答幅度不尽相同。经过高温驯化后,白斑狗鱼提高了温度耐受性,可能是通过HSP70参与重要调控作用。

溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定

曾福源, 苏泽辉, 周诗慧, 谢妙, 庞欢瑛

2021, 37(5):  84-91.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0949

摘要 ( 440 )   HTML ( 11)   PDF (4387KB) ( 401 )  

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构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化、琥珀酰化修饰。结果显示, pepck基因全长1 629 bp,重组菌株可以正确表达分子质量约60.9 kD的蛋白。诱导温度：在28℃条件下PEPCK存在于上清和包涵体中,在37℃则主要以包涵体形式存在;IPTG浓度：0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范围内,PEPCK的表达量无明显差异;时间：在0-8 h内PEPCK表达量随时间增长逐渐增加,诱导8 h后趋于稳定。Western blot显示PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。成功构建溶藻弧菌PEPCK重组表达菌株,其最优诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG,28℃诱导8 h;经鉴定PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白C端重组蛋白的原核表达、纯化及应用

张西西, 张怡青, 李玉林, 韩笑, 王国强, 王晓军, 王旭东, 王云龙

2021, 37(5):  92-97.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0902

摘要 ( 594 )   HTML ( 19)   PDF (3794KB) ( 605 )  

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通过原核表达系统探究SARS-CoV-2 核衣壳（Nucleocapsid,N）蛋白C端重组蛋白表达、纯化的制备方式以及提供有效的重组蛋白用于COVID-19的早期快速诊断。合成N蛋白C端基因序列,构建重组载体,利用原核系统表达重组目的蛋白。利用Ni²⁺亲和层析和凝胶过滤层析的方法对表达产物进行纯化,SDS-PAGE电泳和高效液相色谱鉴定重组蛋白的纯度。通过Western blot验证目的蛋白生物活性,用纯化的重组蛋白作为包被抗原,核衣壳全长蛋白标记荧光微球,组装成荧光免疫层析试纸条检测PCR确证的阳性和阴性血清样本。成功构建重组载体pET21b-NC,工程菌株在37℃诱导条件下,80%目的蛋白以可溶形式表达。通过Ni²⁺亲和层析和凝胶过滤层析,目的蛋白纯度高达90%以上,利用重组蛋白组装荧光免疫层析试纸,该试纸条可区分阴阳血清。SARS-CoV-2 N蛋白C端可在大肠杆菌中以可溶性形式表达,高纯度的目的蛋白在荧光免疫层析检测试纸中表现出较好的反应原性和特异性,可初步用于COVID-19的早期初筛。

集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析

白福美, 李至敏, 王小琴, 胡紫微, 鲍玲玲, 李志敏

2021, 37(5):  98-107.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1149

摘要 ( 461 )   HTML ( 5)   PDF (4364KB) ( 414 )  

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旨在对集胞藻PCC6803中slr1022基因编码的N-乙酰鸟氨酸转氨酶进行生化表征及结构分析,为进一步研究该酶的催化功能及机制奠定理论基础。以集胞藻PCC6803基因组为模板,通过PCR扩增获得slr1022基因,将其连接到表达载体pET-28a上,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态。经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化后获得重组Slr1022蛋白,然后通过紫外分光光度法对Slr1022蛋白的催化功能进行表征,并运用生物信息学软件对该蛋白进行结构分析。成功构建pET28a-slr1022重组表达质粒,并诱导表达重组Slr1022蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定该蛋白分子量约为50 kD,与理论大小相符。Slr1022蛋白与底物N-乙酰鸟氨酸的结合常数K_m和最大反应速度V_max分别是0.12 mmol/L和0.60 μmol/（L·s）,并且Slr1022蛋白与另一底物α-酮戊二酸的K_m和V_max分别是0.039 mmol/L和0.65 μmol/（L·s）。Slr1022蛋白在pH 8.5时催化活性最强。Slr1022蛋白和其他来源的N-乙酰鸟氨酸转氨酶氨基酸序列有一定的同源性,而且活性位点的氨基酸残基高度保守。成功克隆并表达纯化出Slr1022蛋白,酶学性质和生物信息学研究表明Slr1022蛋白为N-乙酰鸟氨酸转氨酶。

氟化钠促进节杆菌发酵合成环磷酸腺苷的生理机制

顾阳, 谭海, 员林娜, 孙海彦, 常景玲, 李志刚

2021, 37(5):  108-116.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1234

摘要 ( 412 )   HTML ( 5)   PDF (3181KB) ( 419 )  

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环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）发酵过程中存在严重的“碳溢流”现象并伴随副产物腺苷的大量积累,导致cAMP产量和糖苷转化率低下。为提高cAMP产量和转化率,向发酵液中添加糖酵解抑制剂氟化钠,并从发酵动力学、酶活性分析、能量代谢及关键代谢物水平等方面,对发酵性能得以提高的原因进行分析。结果表明,通过添加0.2 g/L氟化钠,cAMP产量在从头合成和补救合成发酵模式下分别达到3.36 g/L和4.35 g/L,与对应未添加氟化钠批次相比,分别提高了25.8%和27.9%,糖苷转化率也得到等比例提高,同时腺苷和有机酸合成量显著降低,发酵性能得到明显改善。关键酶活性测定结果表明,氟化钠一定程度上抑制了糖酵解途径,使碳流更多分配到磷酸戊糖途径,用于产物合成,而催化腺苷合成的5'-核苷酸酶活性则显著下降,减少了前体AMP的分解,促进了产物合成和糖苷转化率的提高。另外,由于氟化钠的添加,ATP/AMP、NADH/NAD⁺以及胞内天冬氨酸、谷氨酸等前体物质水平均得到明显提高,能量代谢和前体物质水平的提升也为产物合成提供有利条件。

综述与专论

葡萄种子休眠研究进展

李上云, 王晨, 宣旭娴, 任艳华, 房经贵

2021, 37(5):  117-127.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1140

摘要 ( 600 )   HTML ( 29)   PDF (2994KB) ( 540 )  

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种子是葡萄新品种选育的重要材料,但因具有明显的休眠特性,葡萄育种的效率极低。为提高葡萄育种效率很有必要研究其种子休眠特性,从而高效打破葡萄种子休眠。目前,葡萄种子休眠研究已成为葡萄育种的一个重要研究方向。鉴于葡萄种子休眠过程是一个复杂的过程,且因葡萄种群不同其休眠特性也存在重要差异,因而相关研究颇受关注,人们从休眠理论及休眠调控等方面开展了广泛的研究,但目前为止,尚未有葡萄种子休眠方面研究的系统综述。为此,基于前人研究,从葡萄种子休眠类型、休眠机制、休眠解除及促进种子萌发相关调控技术的研究等多个方面开展了综述,以期为建立打破种子休眠、提高种子萌发率的技术体系提供理论依据,从而为提高葡萄杂交育种与品种选育的效率提供新思路和指明方向。

荒漠植物柽柳抗逆机制的研究进展

李彩霞, 兰海燕

2021, 37(5):  128-140.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1040

摘要 ( 621 )   HTML ( 11)   PDF (3059KB) ( 394 )  

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柽柳是广泛分布于荒漠地区的一种极其耐旱、耐盐的多年生灌木。在长期进化过程中,柽柳在形态结构、生理生化及分子生物学等不同层面形成了多种适应性特征,从而适应极端环境。柽柳在种子萌发阶段的特殊机制使其种群得以成功繁衍;为了适应复杂的荒漠环境,柽柳叶片退化成鳞片状,茎叶表面布满盐腺,发育出极其发达的根系,进而在形态结构方面做出相应的适应性改变,并协同渗透调节、抗氧化、高光效等多种生理途径,以及逆境响应信号途径和相关基因的表达调控,共同应对环境胁迫。主要从种子特性、植株形态结构、抗逆生理及分子生物学调控等水平对柽柳适应逆境的机制进行综合论述及展望,以期为柽柳适应机制的深入探索提供参考依据。

植物VIGS技术及其在林业科学中的研究进展

高鹏飞, 席飞虎, 张泽宇, 胡凯强, 陈凯, 魏文桃, 丁家治, 顾连峰

2021, 37(5):  141-153.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1452

摘要 ( 937 )   HTML ( 30)   PDF (1868KB) ( 1047 )  

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随着基因组序列信息的激增,生物科学研究进入大数据时代,但如何对基因组信息进行功能注释成为了一个重要的研究目标。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术作为一种强大的工具,可以针对缺乏稳定遗传转化体系的林木物种进行基因功能分析,已经被用来研究了多个植物生长发育过程中的关键基因。该技术利用植物先天抗病毒防御机制,通过把目的基因片段插入病毒载体中进而在植物体内产生小干扰RNA,使该植物内源基因的转录物成为被降解的靶标,从而导致目的基因的表达量下调。系统综述了VIGS技术的优势、局限性、以及相应的解决方案,同时还讨论了VIGS在林木科学研究中的应用,最后探究了VIGS作为探究和表征植物基因功能的有力工具的最新改进方案和未来前景。

植物磷脂酶C在应答胁迫反应中的研究进展

赵阿慧, 王宪国, 董剑, 侯佐, 赵万春, 高翔, 杨明明

2021, 37(5):  154-164.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1211

摘要 ( 521 )   HTML ( 12)   PDF (1880KB) ( 504 )  

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磷脂酶C（phospholipase C,PLC）是参与脂质和Ca²⁺依赖信号通路的重要调节酶,它能将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP₂）水解生成2个重要的第二信使分子：脂类的二酰甘油和可溶性分子肌醇1,4,5-三磷酸。磷脂酶C根据其水解磷脂的底物不同,可分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和非特异性磷脂酶C。植物PLC基因通过调控各种信号途径,从而在植物的非生物胁迫（渗透胁迫、低温胁迫、干旱胁迫等）以及生物胁迫的应答过程中具有重要作用。综述了植物磷脂酶C分类、结构、生化特性和生理功能,并对相关领域的研究方向进行了展望。

活性氧诱发的植物亚细胞间通讯

李陆萍, 梁大成

2021, 37(5):  165-173.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1275

摘要 ( 492 )   HTML ( 14)   PDF (2761KB) ( 335 )  

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在正常发育和应激条件下,活性氧（reactive oxygen species,ROS）均会在植物细胞的不同细胞器中产生,如线粒体呼吸作用和叶绿体光合作用都是ROS的重要来源。ROS虽然对细胞存在潜在的毒害,但是适量的ROS可以作为信号分子激活信号传导通路引起细胞器内多种生理反应,从而协调亚细胞器的代谢功能及相互作用。尽管这些过程已被广泛研究,但ROS在植物亚细胞器间的通讯过程所发挥的作用则相对零散。综述了ROS的种类及其产生途径,重点介绍了植物细胞如何感知并响应ROS以及细胞器间的ROS信号传递过程。这些结果将有助于理解ROS作为信号分子在线粒体、叶绿体和细胞核信号交流中的作用。

抗非洲猪瘟病毒制剂的研究进展

赵鸿远, 王朝, 成温玉, 马宁宁, 李曼, 魏小丽

2021, 37(5):  174-181.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1079

摘要 ( 552 )   HTML ( 16)   PDF (1101KB) ( 778 )  

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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）作为我国当前最为严重的外来猪病,被列为一类动物传染病。2018年8月沈阳暴发ASF疫情以来,连续不断的感染疫情给我国养猪业造成重创,严重威胁生猪养殖的健康发展。目前针对ASF尚无商品化的疫苗和经济有效的抗病毒药物,猪群一旦感染只能依靠快速扑杀进行防控。从干扰素、抗生素、核苷类似物、植物天然产物及其他可能抗非洲猪瘟病毒制剂的研究现状进行详细概述,以期为抗非洲猪瘟药物的创制提供借鉴及参考。

Wnt信号通路与无脊椎动物天然免疫

邹晨辰, 阮灵伟, 施泓

2021, 37(5):  182-196.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1073

摘要 ( 581 )   HTML ( 20)   PDF (1199KB) ( 1744 )  

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Wnt作为一条保守的信号通路,其在不同生物过程中的作用已被广泛研究。相比脊椎动物,天然免疫在缺乏获得性免疫的无脊椎动物中显得尤为重要。近年来,由于Wnt信号通路在脊椎动物免疫中的功能被逐渐挖掘,其在无脊椎动物天然免疫中的作用引发越来越多的关注。对Wnt信号通路及其在无脊椎动物天然免疫中的重要作用进行了综述,旨为无脊椎动物的疾病防治提供新思路。

受体相互作用蛋白的功能及在硬骨鱼类中的研究进展

李凯晴, 李莹, 王艺磊, 邹鹏飞

2021, 37(5):  197-211.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1258

摘要 ( 462 )   HTML ( 10)   PDF (3506KB) ( 773 )  

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受体相互作用蛋白（RIP）是介导细胞死亡信号和炎症反应的关键调节因子,在调节免疫反应和维持机体稳态方面起着至关重要的作用。RIP在哺乳动物中参与了细胞死亡、炎症反应、先天免疫等不同的生物学过程,而鱼类作为重要的脊椎动物类群,关于RIP在鱼类中的功能我们仍然所知有限。因此,主要综述了RIP家族成员的分子结构、介导的信号通路和作用机制,以及其在硬骨鱼类中的研究进展,旨为深入解析鱼类乃至哺乳动物的免疫反应和抗病机制奠定基础。

银纳米簇抗菌机理、活性及其应用的研究进展

龚晓惠, 杨敏, 李舒婷, 林晟豪, 许文涛

2021, 37(5):  212-220.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0828

摘要 ( 660 )   HTML ( 17)   PDF (2854KB) ( 933 )  

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银纳米簇是一类粒径介于银原子和银纳米颗粒之间,由几个到几十个银原子组成,核心尺寸小于2 nm的银纳米材料。近年来银纳米簇以其固有的广谱抑菌性、不致耐药性、良好的生物相容性、低剂量有效性等优势在抗菌应用领域受到了较高的关注。综述了银纳米簇的抗菌机理及抗菌活性的影响因素,探讨其细胞毒性,并对目前已有的抗菌应用进行总结,展望了银纳米簇未来的应用方向及要突破的问题,着重突出DNA银纳米簇的广泛应用前景。

有益微生物菌肥对农作物的作用机制研究进展

武杞蔓, 张金梅, 李玥莹, 张颖

2021, 37(5):  221-230.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0846

摘要 ( 844 )   HTML ( 56)   PDF (1171KB) ( 1440 )  

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微生物肥料是一种对环境友好的新型生物肥料,可以促进植物生长,提高果实品质,改善土壤质量,通过在植物和微生物之间构建良好的联系,实现环境的可持续发展,形成“可循环经济”,从而有效促进有机农业的整体发展。就有益微生物菌肥改善土壤理化性质、促进植物生长和改善果实品质、提高植物抗逆性和抗病性等方面进行了综述,并简要介绍了微生物与植物相互作用的分子机制,对微生物菌肥在有机农业上的应用前景进行了展望。

微生物来源碱性蛋白酶活性提高策略的研究进展

袁媛, 王蕾, 石亚伟

2021, 37(5):  231-236.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1043

摘要 ( 573 )   HTML ( 17)   PDF (1535KB) ( 760 )  

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碱性蛋白酶是工业上应用广泛的一类重要的蛋白酶制剂。目前国内高端洗涤用碱性蛋白酶主要依赖于进口,制约国内高端洗涤用蛋白酶的其中一个因素就是酶活性不高。从微生物菌株改造、蛋白质工程,以及通过优化启动子或信号肽的方式调控碱性蛋白酶的表达等3个方面阐述了提高微生物碱性蛋白酶酶活性的策略,最后对未来如何提高微生物来源的碱性蛋白酶活性的前景做了展望。

微生物电合成生产中链脂肪酸的基本原理及研究进展

褚娜, 蒋永, 曾建雄

2021, 37(5):  237-247.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1054

摘要 ( 606 )   HTML ( 25)   PDF (2705KB) ( 1283 )  

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微生物电合成（microbial electrosynthesis,MES）是一种新型微生物电化学技术,以电能驱动微生物在温和条件下转化水和CO₂生成有机物。中链脂肪酸（medium-chain fatty acids,MCFAs）是指C6至C12的一元饱和羧酸,是重要的化工原料和农用产品。微生物生产MCFAs通常包括一次发酵和二次发酵过程：一次发酵即微生物将单体和多聚物氧化为中间产物丙酮酸盐,并最终生成短链脂肪酸和醇以及H₂和CO₂等小分子物质;二次发酵为微生物对一次发酵的产物再利用,包括碳链延长产生中链脂肪酸。MES生产MCFAs可望获得比传统有机废弃物厌氧发酵途径生产MCFAs更高的能量效率,并有望以获得高附加值产物的方式推进MES技术的实用化。综述了MES催化转化C1废气并耦合二次发酵过程进行碳链延长产生MCFAs的研究现状,分析代谢路径及功能微生物,探讨电极材料以及关键运行参数,为MES生产MCFAs的进一步发展提供重要的科学依据和技术支持。

技术与方法

转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗BCG-17转化体特异性检测方法的建立

冯翠莲, 万玥, 王俊刚, 冯小艳, 赵婷婷, 王文治, 沈林波, 张树珍

2021, 37(5):  248-258.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1206

摘要 ( 435 )   HTML ( 7)   PDF (4104KB) ( 349 )  

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转基因作物外源T-DNA插入的侧翼序列是转基因事件检测的关键组分,也是转基因作物生物安全评价和监管所必需提供的重要信息。为了明确抗虫转基因甘蔗BCG-17的分子特征和建立其事件特异性检测方法,推进其生物安全性评价工作及未来的监管工作,以其T2代为研究材料,通过Southern 杂交检测外源基因在甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立该转化体的高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BCG-17株系;经过3-4次的热不对称PCR扩增,分离到510 bp的T-DNA左侧翼序列和915 bp的右侧翼序列;以此为基础,分别设计左右侧翼检测引物,建立了BCG-17株系的转化事件特异性PCR检测方法,左侧翼的PCR检测方法特异性强、灵敏度高,检出极限为0.1%,相当于9个单倍体甘蔗基因组拷贝数。转基因株系BCG-17的分子特征及其转化事件特异性检测的完成,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供了技术依据。

柱状田头菇遗传转化体系启动子的筛选

崔祥华, 陶南, 程波普, 赵永昌, 陈卫民, 李靖

2021, 37(5):  259-266.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1404

摘要 ( 329 )   HTML ( 6)   PDF (4050KB) ( 226 )  

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柱状田头菇（茶树菇）Cyclocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有很高的经济价值。构建高效表达的遗传转化体系,可以深入揭示其遗传特征及基因功能。以柱状田头菇YSG为实验材料,使用多片段重组克隆构建载体,PEG介导的原生质体转化,并以qRT-PCR为测定方法,对actin、gpd和Pumgpd不同长度5个启动子片段驱动靶标基因的表达量进行分析。依据actin基因启动子构建的载体pAa-actin-1和pAa-actin-2获得转化子中,靶标基因表达量为对照3倍以上转化子数量分别为50%和33.33%,最高表达量分别为对照的10.45和6.23倍;携带pAa-gpd-1、pAa-gpd-2和pAa-Pumgpd启动子的载体获得的转化子中,表达量为对照3倍以上的数量分别为0、28.57%和25%,最高表达量分别为对照的2.93、7.75和4.31倍。actin启动子获得高表达转化子得率较gpd和Pumgpd启动子片段高,适用于柱状田头菇转化体系构建。

应用CRISPR/Cas9技术敲除SERPINF2基因对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

付强, 陈俊贞, 郭妍婷, 姚刚, 冉多良, 史慧君

2021, 37(5):  267-272.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0886

摘要 ( 501 )   HTML ( 14)   PDF (4115KB) ( 465 )  

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应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除MDBK细胞的SERPINF2基因,以探明SERPINF2基因对牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）复制的影响。采用CRISPR/Cas9技术建立SERPINF2敲除细胞;实时荧光定量PCR、免疫荧光染色、Reed-Muench法等检测BVDV感染SERPINF2敲除细胞后病毒RNA水平、dsRNA积累、病毒滴度和CPE等。构建SERPINF2基因敲除的MDBK细胞SERPINF2 KO,测序27株阳性克隆中有19株基因序列发生缺失（-）和插入（+）等移码突变,敲除效率约为70.37%;实时荧光定量PCR检测BVDV TC株感染MDBK细胞后SERPINF2 mRNA转录水平显著升高;与对照组Scramble细胞相比,BVDV TC株感染SERPINF2 KO细胞后病毒RNA水平和dsRNA积累显著性降低,CPE发生延迟,相同时间导致细胞脱落数量显著减少,BVDV滴度显著性降低。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除MDBK细胞的SERPINF2基因,建立SERPINF2 KO细胞,试验表明敲除SERPINF2基因显著性抑制BVDV复制。

猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立

瞿欢, 李成, 陈汭, 廖艺杰, 曹三杰, 文翼平, 颜其贵, 黄小波

2021, 37(5):  273-280.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-1181

摘要 ( 442 )   HTML ( 10)   PDF (3550KB) ( 315 )  

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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区（S1-CTD）并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区（位于S基因的832-1 848 bp）,构建原核表达载体pET28a-S1-CTD,表达的重组S1-CTD蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约41 kD,Western Blot证明其有良好的反应原性。以重组S1-CTD 蛋白为抗原建立间接ELISA,抗原最佳包被浓度为1μg/孔,待检血清的最佳稀释度为1∶50,阴阳性临界值为OD_450nm≥0.377。该ELISA检测其他8种常见猪病阳性血清无交叉反应,特异性好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性好。ELISA与病毒中和试验的总符合率达83.3%。用建立的ELISA检测了2012-2017年四川部分猪场490份临床血清,结果显示血清中PDCoV抗体阳性率为49.18%。

一种快速精确测定Tth DNA聚合酶活性的方法

陈晓雨, 张建, 张新亚, 唐雨婷, 邵钰晨, 罗志丹, 卢辰

2021, 37(5):  281-286.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0953

摘要 ( 833 )   HTML ( 27)   PDF (2604KB) ( 978 )  

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Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶,但在生产和改造过程中,缺乏准确、快速、简便测定酶活的方法。利用高灵敏度双链特异性核酸染料PicoGreen和特殊设计的发夹型探针,建立了一种测定Tth DNA聚合酶活性的新方法。该方法的标准曲线线性关系良好,决定系数R²达到0.99以上,灵敏度和准确度高,操作简单,测定结果与商业化产品标定的活力相符,经荧光定量PCR验证能够反映真实使用环境下的酶活。该方法还可推广到测定其他DNA聚合酶活性,将为DNA聚合酶的生产和改造提供有效的检测手段。

其他

目录

2021, 37(5):  287-287. 

摘要 ( 114 )   PDF (337KB) ( 106 )  

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封面

2021, 37(5):  288-288. 

摘要 ( 128 )   PDF (52599KB) ( 390 )  

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