生物技术通报

新一代测序技术的发展和应用

田李,张颖, 赵云峰

2015, 31(11): 1-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.003

摘要 ( 568 )

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DNA测序技术是人类探索生命秘密的重要研究手段。自第一代的Sanger测序技术诞生以来，DNA测序技术经历了三代变革，产生了第二代到第四代测序技术，统称为新一代测序技术。目前，新一代测序技术的数据产出能力呈指数增长，而且这一技术本身也从依赖DNA聚合酶的生化反应转变为面向物理学中纳米技术的新领域。新一代测序对生命科学领域具有里程碑意义，引领了科学研究模式革新和研究思维的转变。科研人员可利用新一代测序技术对基因组、转录组和表观组等诸多领域展深入的研究。分析了新一代测序技术的特点，并对其未来的发展方向以及应用进行了展望。

WRKY转录因子的基因组水平研究现状

颜君, 郭兴启, 曹学成

2015, 31(11): 9-17. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.005

摘要 ( 314 )

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WRKY转录因子家族是植物中广泛存在、目前发现最大的转录因子家族之一；参与很多信号转导网络，调控多种植物发育和防御等进程。随着植物全基因组测序技术的兴起，全基因组鉴定和分析WRKY基因家族变得可能。2003-2006年，此类研究主要集中在模式生物拟南芥和水稻中。随着其他植物基因组测序的完成和公布，全基因组鉴定和分析WRKY基因家族的研究报道日益增多，这些研究不仅分析了各个植物WRKY家族的系统进化，而且用实时定量PCR、微阵列芯片、转录组RNA测序等新技术大规模研究了它们涉及到的生物学功能。主要综述了全基因组鉴定和分析WRKY基因家族的研究进展。

蛋白质组学在木薯育种中的应用

陈松笔, 安飞飞, 朱文丽, 李开绵, Luiz JCB Carvalho, 李庆孝

2015, 31(11): 18-26. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.011

摘要 ( 436 )

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蛋白质组学通过研究整体蛋白质活动来揭示生命运动规律，是解析功能基因组表达的必要手段。目前蛋白质组学为木薯选育种研究提供了重要手段和新思路。介绍了蛋白质组学研究平台并对其在选育高光效高淀粉积累、高蛋白质、高类胡萝卜素及抗逆木薯种质方面的应用进行了综述。

人类长链非编码RNA相关SNP鉴定与功能预测的研究进展

龚静, 柳纯洁, 缪小平, 郭安源

2015, 31(11): 27-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.002

摘要 ( 351 )

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长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸，且不表现出任何蛋白质编码潜能的RNA。最新研究表明，lncRNA广泛地参与动植物的生长发育及疾病的发生发展等各种生物学过程，具有类型多、数量大且作用范围广等特点。目前对于lncRNA的发现、预测方法、功能及与疾病的关系已有了一系列报道。主要对lncRNA相关SNP文献进行综述，并对lncRNA相关SNP的鉴定与功能预测方法进行介绍。对其中涉及的生物信息学方法及相应的数据库进行全面综述，旨在为lncRNA研究提供新的思路，对复杂疾病的预测、诊断和治疗提供新的依据。

家养动物基因组拷贝数变异研究进展及其育种应用展望

程红, 姜雨

2015, 31(11): 35-42. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.006

摘要 ( 289 )

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家养动物参考基因组组装的不断完善和群体重测序数据的持续增加促进了基因组中大量变异的发现。基因组上的变异主要包括单核苷酸变异(SNP)和拷贝数变异(CNV)两种类型。相对于数量众多，已经被广泛研究和用作分子育种标记SNP，目前已经被发现和经过实验验证其功能的CNV数量较少，鲜有被直接用作分子标记进行育种的报道。CNV片段长度大、在基因组中普遍存在且比SNP变异覆盖的基因组范围更广，所以可能对农艺性状造成很大影响，其在畜禽基因组研究和育种应用中具有广阔前景。重点讨论了家养动物CNV的研究进展，并对其在家养动物育种中的应用进行了分析展望。

基于染色质交互数据的基因组组装方法

陶婧芬, 谢婷, 郑觉非, 杨庆勇, 张红雨

2015, 31(11): 43-50. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.007

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伴随着高通量DNA测序技术的不断推陈出新和价格持续下调，如何将scaffolds定位于染色体逐渐成为完整参考基因组获得的关键。高通量染色质构象捕获技术(High-throughput chromosome conformation capture，简称Hi-C)的出现为基因组组装过程中scaffolds快速锚位提供了契机。相比于传统的基因组组装方法，基于染色质交互组装基因组的策略实验操作简易、实验和时间成本较低、正确率及分辨率高，在基因组相对复杂的多倍型和高度杂合的物种中有着更大的应用前景。但由于技术本身的限制，该方法还存在分辨率、背景噪声等问题需要解决，有待进一步改进和提高。

元基因组学方法在环境微生物中的研究进展

刘捷孟, 戚继

2015, 31(11): 51-59. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.001

摘要 ( 295 )

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新一代测序技术的快速发展，使得元基因组学研究方法成为了理解环境微生物群落结构和相互作用的重要手段之一。元基因组学方法不需要将环境样本中的微生物单独分离培养，而是作为整体进行研究，因而可以回避传统研究时分离培养微生物的困难。基于这一优势，人体、海洋和土壤等环境有关的各项环境微生物测序计划相继启动，并取得了一系列重要的研究进展。探讨了元基因组测序数据分析中所经常采用的方法，以及有关流程的优势和局限性，并进一步讨论了这些方法在各种环境微生物研究中的应用和成果。

基于全基因组的微生物亲缘关系与分类系统研究工具——CVTree3

左光宏, 郝柏林

2015, 31(11): 60-67. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.009

摘要 ( 309 )

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组分矢量构树(CVTree)方法是基于全基因组的、不用序列联配的物种亲缘关系研究方法。CVTree3是我们最新开发的CVTree网络服务器，它基于并行化的核心程序，以适应当前基因组数据的海量增加；它自动对比物种亲缘关系与分类系统，并在网页上以交互作用形式显示，从而使研究更加直观。使用CVTree3网络服务器，用户可以快速的对未知的全基因组序列进行亲缘关系分析，并对其分类地位进行初步鉴定。由于合理利用全基因组信息，CVTree方法能对种以下的亲缘关系与分类具有高分辨力。随着CVTree方法的深入与完善，希望其能成为阐明原核生物亲缘关系与分类系统的定义性的工具。

植物转录因子分类、预测和数据库构建

靳进朴, 郭安源, 何坤, 张禾, 朱其慧, 陈新, 高歌, 罗静初

2015, 31(11): 68-77. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.004

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转录因子在植物生长发育和应对胁迫等过程中具有重要调控作用，基因组水平上系统预测植物转录因子是研究其功能和演化的基础。通过深入全面的文献调研，总结了一套完整的植物转录因子家族分类规则，开发了转录因子预测流程，构建了转录因子预测平台。基于该流程，从83种绿色植物中预测到129 288个转录因子，分属58个家族。对预测到的转录因子，从家族和个体两个层次进行了详尽注释，构建了植物转录因子数据库PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)。PlantTFDB提供了覆盖绿色植物主要谱系的转录因子，其中大部分为具有重要经济价值的单子叶和双子叶植物，已成为植物转录因子功能和演化研究的重要信息资源和分析平台。

环境微生物宏基因组学数据库利用

王慧丽, 郭安源

2015, 31(11): 78-88. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.008

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宏基因组学技术产生的数据是研究环境微生物的宝贵资源，国际上已有微生物计划、海洋计划、生命普查等大项目，采集和测序的样本量数以百万计，产生了海量的环境宏基因组学数据，并以此建立了几十个相关宏基因组数据库和平台。主要从以下几个方面综述环境宏基因组学的研究进展和已有资源: 环境宏基因组学国际合作大项目、宏基因组学数据库和宏基因组学数据在线分析平台。将结合相应的数据库网站介绍其项目详情、样本来源、数据类型、使用方式和分析结果等，以便研究者全面了解此类数据并能快速找到和利用相关资源。

肿瘤生物信息学数据库

杨健, 蔡浩洋

2015, 31(11): 89-101. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.010

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恶性肿瘤已经成为严重危害人类健康的主要疾病之一。近年来，高通量检测技术迅速发展，成为肿瘤研究的重要手段之一，使得与肿瘤相关的组学数据迅速积累。这些数据对于研究肿瘤的发生发展机制具有重要意义。对海量生物学数据的管理和挖掘已经成为癌症研究的基础与重要方向。主要介绍人类肿瘤研究中经常用到的生物信息学数据库，包括综合性数据库、基因组、转录组、蛋白组、表观遗传组数据库等。在总结国内外肿瘤数据库发展现状的基础上，讨论了目前数据库开发存在的问题，旨为现有的研究提供帮助。

实用生物信息技术课程教学实例

罗静初

2015, 31(11): 102-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.001

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介绍“实用生物信息技术”研究生课程的5个教学实例。以血红蛋白序列和结构为例，介绍常用生物信息技术和分析方法，包括蛋白质和核酸序列相似性比对、蛋白质和核酸序列数据库检索、Blast数据库相似性搜索、分子系统发生树构建，以及蛋白质结构比较分析等。

质谱技术在DNA甲基化研究中的应用

黄新凤, 叶金波, 刘建军

2015, 31(11): 112-120. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.012

摘要 ( 342 )

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DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一，主要发生在哺乳动物基因组CpG核苷酸序列中的胞嘧啶C-5位点，并与机体生长发育、转座子沉默、X染色体失活及许多疾病的发生相关。但对DNA甲基化的形成、维持和重构的分子机制的认识是有限的，需要从基因组水平寻找最优的DNA甲基化定性和定量分析方法，而质谱技术以高敏感性、高通量、高准确率、高分辨率、快速且重复性好等优势在该研究领域具有较大的应用价值。介绍质谱技术在全基因组DNA甲基化和启动子区甲基化分析中的应用。

一种点杂交膜预处理方法的建立及应用

姜超, 苏小琴, 张学文, 潘映红

2015, 31(11): 121-124. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.013

摘要 ( 250 )

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旨在解决手工点样斑点杂交中样品点密度小、点样体积受限制和点样点不规整等问题，建立了一种新的点杂交膜预处理方法。首先根据预设点样点的大小、排列方式和密度，制作柱状凸起模具；其次将模具固定于杂交膜上，使模具凸起部位与膜紧密接触；再将熔化的石蜡涂布于膜上非模具接触部位，待石蜡凝固后移走模具，获得预处理杂交膜。以荧光染料IRDye800标记的抗体为样品进行直接点样检测，同时提取水稻、小麦和大豆的蛋白进行点杂交实验验证。结果显示，利用上述方法得到非点样部位具有疏水性的预处理NC膜和PVDF膜，其点样点位置、形状和大小固定，点样密度高。不同体积荧光染料标记抗体直接点样得到的荧光图像整齐规范，水稻、小麦和大豆蛋白与水稻看家蛋白抗体Anti-HSP杂交后均能检测到稳定信号。杂交膜经预处理后可最大限度实现点样点位置、大小和形状的统一，并能显著提高上样体积和点样密度。

栅藻Scenedesmus sp.蛋白质提取方法优化及氨氮与硝态氮处理下蛋白质组表达差异

贾其坤, 梁青, 吴后波, 王广华, 吴华莲, 李涛, 王兵, 向文洲

2015, 31(11): 125-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.014

摘要 ( 270 )

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旨在寻找一种快速高效提取栅藻Scenedesmus sp.蛋白质的方法并研究氨氮对该藻的毒害机制。使用液氮研磨和超声细胞破碎进行细胞破碎，丙酮沉淀和TCA-丙酮沉淀法进行蛋白纯化，SDS-PAGE进行蛋白样品丰度检验，2-DE电泳技术对差异表达蛋白进行分析。结果显示，对于栅藻Scenedesmus sp.，液氮研磨破碎细胞效果明显优于超声细胞破碎法，前者细胞破碎完全，内容物充分外泄。TCA-丙酮沉淀纯化得到的蛋白样品不仅浓度高，而且丰度和纯度均显著优于丙酮沉淀法。氨氮毒害作用下栅藻Scenedesmus sp.蛋白差异表达分析结果显示85个表达降低的蛋白和25个表达升高的蛋白，这些蛋白涉及光合作用、二氧化碳固定、糖酵解、蛋白质合成及非正常折叠蛋白降解、细胞分裂和物质运输，以及自由基清除等途径。应用液氮研磨和TCA-丙酮沉淀法可快速高效地提取栅藻Scenedesmus sp.蛋白质，氨氮毒害作用涉及光合作用、脂肪酸合成、非正常折叠蛋白降解等多种代谢途径。

水稻白叶枯病菌第二信使c-di-GMP代谢酶基因的预测和分析

薛丁榕, 田芳, 李海云, 杨凤环, 陈华民, 何晨阳

2015, 31(11): 131-138. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.016

摘要 ( 277 )

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旨在从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)中鉴定出含有GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGC)和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDE)编码基因。预测分析了Xoo已测序菌株中的GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白的种类、数量及其序列特征，鉴别了基序保守的DGC或PDE、基序退化的信号受体以及信号输入结构域，验证了部分不同类型结构域蛋白作为DGC/PDE、信号受体以及在细菌毒性调控等方面的功能。

水稻小G蛋白OsRab5b的亚细胞定位研究

邵军丽, 龙跃生, 徐增富

2015, 31(11): 139-145. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.017

摘要 ( 314 )

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旨在研究水稻OsRab5b亚细胞定位及第二位甘氨酸在蛋白定位中的作用。利用药物、细胞器标记物和示踪染料处理OsRab5b-GFP与OsRab5b(Gly2Ala)-GFP的转基因BY-2细胞，然后用激光共聚焦显微镜观察。结果表明，OsRab5b-GFP转基因细胞呈现出大量的分散点状结构和少量细胞质弥散信号；wortmannin处理可以使OsRab5b-GFP标记的点状结构膨胀成小的环状结构；采用100 μg/mL布雷菲德菌素A(BFA)处理可使OsRab5b-GFP标记的结构聚集。大部分的OsRab5b-GFP信号都可以与前液泡区标记蛋白VSR_At-1共定位。在内吞示踪染料FM4-64摄取的第60 min，OsRab5b-GFP标记的结构大部分被FM4-64标记。突变体OsRab5b(Gly2Ala)-GFP弥散分布于细胞核和细胞质内，而且不受wortmannin或BFA药物处理的影响。OsRab5b定位于BY-2细胞的前液泡区，Gly2在蛋白准确定位方面发挥重要作用。

棉花YABBY基因家族的全基因组分析

徐珍珍, 倪万潮, 张香桂, 郭琪, 徐鹏, 沈新莲

2015, 31(11): 146-152. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.019

摘要 ( 400 )

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YABBY基因家族属于锌指蛋白超家族(Zinc finger super-family)的亚家族，在调控植物叶和花器官发育过程中起着重要的作用。从陆地棉标准系TM-1(Gossypium hirsutum L. acc. TM-1)基因组中鉴定到23个YABBY基因家族成员，具有不同的亚细胞定位；这些基因分布在16条染色体和1条Scaffold上，且有9对共线性基因；棉花的YABBY基因家族分为4个亚组，每个亚组都有与拟南芥同源的基因，且每个亚组成员间具有相似的基序类型和排列顺序；组织表达分析表明，TM-1全基因组中的23个YABBY基因家族成员具有较为广泛的组织表达类型。所有YABBY基因家族成员在花、蕾和茎端分生组织中表达。

甜瓜CmERFIII-1转录因子基因cDNA的克隆与表达分析

郭呈宇, 孙晓蕾, 邵琪, 白立华, 牛一丁, 哈斯阿古拉

2015, 31(11): 153-158. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.020

摘要 ( 222 )

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根据甜瓜ERF亚家族成员聚类结果，选取第三亚群的CmERFIII-1(甜瓜基因组数据库登录号MELO3C005465)基因为研究对象，根据其cDNA序列设计基因特异引物，应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜果实的总RNA中克隆得到CmERFIII-1基因cDNA，序列长711 bp，编码236个氨基酸组成的多肽。序列比对及系统发育分析表明，CmERFIII-1 cDNA编码的蛋白质氨基酸序列与黄瓜中ERF亚家族两个成员的序列(GenBank登录号: XP_004143677.1、XP_004158119.1)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明，该基因在甜瓜根、茎、叶和授粉后不同时期果实中均有不同程度表达，在叶片中表达量最高。

盐角草高亲和钾离子转运蛋白SeHKT1基因的克隆及表达分析

马金彪, 张大勇, 张梅茹, 肖薪龙, 张选, 李丽

2015, 31(11): 159-165. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.021

摘要 ( 314 )

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利用RACR技术从盐生植物盐角草中克隆SeHKT1基因，GenBank登录号为KP739261，用生物信息学方法对获得的基因序列进行分析，利用qRT-PCR方法研究SeHKT1基因在不同组织和不同盐胁迫下的表达特性。结果表明，该基因cDNA 序列含有1个1 761 bp的完整 ORF，编码550个氨基酸，Blast分析表明该蛋白与毕氏海篷子SbHKT1蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR分析表明SeHKT1基因在NaCl处理下地上部和地下部均诱导上调表达，主要在盐角草根部表达，在地上部表达相对较低，200 mmol/L NaCl处理6 h后在根部表达量达到最高，随后逐渐降低；在钾饥饿条件下，该基因在根部和地上部的相对表达量均高于对照。说明SeHKT1不仅能响应NaCl胁迫，还能在缺钾条件下提高表达，发挥高亲和钾离子载体功能。

星星草PtLIR1基因克隆及其在NaCl胁迫下的表达分析

周琪, 罗春, 郭敏, 付畅

2015, 31(11): 166-172. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.022

摘要 ( 242 )

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类光诱导蛋白1基因LIR1与植物的抗逆性密切相关，可能与蔗糖水平的调节有关。克隆了星星草PtLIR1基因的编码区序列，在此基础上分析了NaCl胁迫下星星草根中PtLIR1的表达特性。PtLIR1基因的开放读码框全长408 bp，编码135个氨基酸。PtLIR1与黑麦草、水稻、玉米、芜青、小盐芥、拟南芥、短花药野生稻、粟、马铃薯、葡萄、二穗短柄草和大豆等的植物LIR1具有较高的同源性，其中与黑麦草类光诱导蛋白1的一致性最高，达80%。PtLIR1响应盐胁迫的实验表明，在盐胁迫早期，可溶性糖的积累与星星草根中PtLIR1基因的表达呈现出负相关性，在蔗糖水平的调节中其他蔗糖代谢相关基因可能发挥了更主要的作用。但在盐胁迫晚期，星星草根中的PtLIR1基因响应盐胁迫上调表达，可能在蔗糖水平的调节中发挥了主要作用。研究结果表明PtLIR1基因参与星星草根系对NaCl胁迫的应答，可能在星星草根抵御盐胁迫的过程中具有重要的调控作用。

miR319a及其靶基因在木薯中的低温响应分析

曾长英, 周玉飞, 彭明

2015, 31(11): 173-178. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.015

摘要 ( 242 )

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旨在探索miRNA在木薯低温逆境中的调控作用，前期小RNA测序筛选出miR319对低温显著响应，通过实时定量PCR方法分析miR319与其4个不同靶基因在两个木薯品种的4种低温处理下的差异表达情况。结果显示，miRNA与其靶基因在两个不同木薯品种间的响应不同，4个低温处理间的响应也不同，miRNA与各个靶基因的相关系数也不同。比较发现在C4中miR319a与3个靶基因(GSTU8除外)负相关性均好于SC124，处理之间在NAH中的负相关表现最典型，miR319与4个靶基因之间的相关系数从大到小的顺序为: MYB33>Unknown>TCP4>GSTU8，预示着MYB33和Unknown(021030m)两个靶基因在C4的NAH中是miR319a更为优先的调控目标。结果表明在木薯的低温逆境适应过程中miR319对MYB33和Unknown两个靶基因的调控作用值得深入研究。

毕赤酵母GS115中N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究

朱海峰, 吴丹, 吴敬

2015, 31(11): 179-185. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.023

摘要 ( 349 )

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为了研究P. pastoris Mpr1的生理特性，在E. coli JM109胞内中成功表达来源于P. pastoris GS115的Mpr1酶，并利用响应面分析法对诱导温度、IPTG诱导浓度、起始诱导OD进行发酵优化，酶活达到(610.3±9.5)mU/mL。酶学性质显示，Mpr1酶的最适反应pH范围为7.0-7.5，最适反应温度是30℃。通过分析重组表达Mpr1菌株和对照菌株的培养过程，显示重组菌株的生长能力显著增强，原因是Mpr1降低了细胞内的ROS水平。

嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究

李凌凌, 吕早生, 左振宇, 李尧益

2015, 31(11): 186-194. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.024

摘要 ( 226 )

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旨为研究嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶的生化特性，以嗜酸喜温硫杆菌TST3的基因组DNA为模板，PCR扩增出硫加氧还原酶基因(sor)，构建了表达载体pET-sor，转化到Escherichia coli BL21(DE3)后，获得了重组菌株E.coli BL21(pET-sor2)。SDS-PAGE实验证明，经IPTG诱导，该重组菌可以表达目的蛋白SOR。对诱导条件进行优化，并在最优的条件下诱导SOR酶表达，再经超声波破碎重组菌，上清液通过Ni⁺-NTA亲和层析柱纯化获得重组酶，其催化氧化反应的比酶活、K_m值和V_max分别为0.70 U/mg，15.672×10^-2g/mL和12.755×10^-5 mol/ (L·min)，而催化的还原反应的比酶活、K_m值和V_max分别为2.21 U/mg，0.507×10^-2g/mL和4.876×10^-5 mol/ (L·min)。

ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究

陈利娟, 吴斌, 何冰芳

2015, 31(11): 195-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.025

摘要 ( 236 )

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旨在选育鼠李糖脂高产菌株，以实验室筛选的产鼠李糖脂的Pseudomonas aeruginosa C3为出发菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP)，选育出一株高产突变株Pseudomonas aeruginosa SC-11，产量比出发菌株提高了74.1%。进一步对产鼠李糖脂的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化，优化后的鼠李糖脂产量达42 g/L，底物转化率达到0.7 g/g底物。添加0.01%鼠李糖脂到Bacillus subtilis CL产羧甲基纤维素酶与木聚糖酶的培养基中，羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活分别提高12.9%和18.3%。研究表明，鼠李糖脂通过增加细胞通透性来提高胞外酶产量。

大肠杆菌DPS表达、体外自组装及抗氧化作用研究

刘文, 贾义华, 方丽, 刘长爱, 陈浩, 路凯敏, 胡巍

2015, 31(11): 202-206. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.026

摘要 ( 300 )

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DNA结合蛋白(DNA- binding proteins from starved cells，DPS)是细菌一类重要的抗逆境保护蛋白。对大肠杆菌DPS蛋白进行原核表达和纯化旨为研究其体外自组装和抗氧化活性。构建表达载体pBVDPSHis，诱导表达并纯化DPS单体蛋白，通过非变性PAGE检测DPS单体自组装情况，通过质粒在Fenton反应时的降解情况检测DPS对DNA的抗氧化保护作用。结果表明，PCR扩增得到522 bp的特异性基因片段，成功构建表达载体pBVDPSHis，诱导表达了分子量为19.5 kD的DPS单体蛋白，亲和层析法纯化的单体DPS经非变性PAGE电泳证实以多聚体蛋白形式存在，Fenton反应说明DPS具有保护质粒DNA抗氧化损伤作用。原核表达的DPS在体外可以自组装成多聚体结构具有抗氧化保护DNA作用。

曲霉固液态发酵产壳聚糖降解酶组分及酶学特性分析

阎贺静, 时月, 刘畅

2015, 31(11): 207-213. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.027

摘要 ( 278 )

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以壳聚糖酶产生菌——曲霉为出发菌株进行固液态发酵，旨在比较其产物酶组分和酶学性质。结果表明固态发酵产酶组分复杂，除具有壳聚糖降解活性外，还具有多种常见水解酶酶活如蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等；液态发酵所得酶组分较简单，不仅具有较大壳聚糖降解活性，还表现出少量蛋白酶和纤维素酶活性。固液态发酵产物酶学性质不同，最适反应温度分别为45℃和40℃，适宜温度分别为40-55℃和35-40℃，分别在40-50℃和30℃稳定性较高；最适反应pH分别为5.8和5.2，分别在pH4.6-6.4和pH4.6-5.8范围内具有较高活性，在pH4.6和pH5.2时稳定性最高。由此说明，固液态发酵产酶组分和相关酶学性质不同，在工业应用中有不同的作用表现。

Cry1Ie蛋白的模拟胃肠液消化稳定性及热稳定性分析

李欣竹, 耿丽丽, 高继国, 张杰

2015, 31(11): 214-221. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.028

摘要 ( 310 )

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Cry1Ie蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有高毒力，cry1Ie基因已经应用于转基因抗虫玉米的种质创制。为评价Cry1Ie蛋白的食用安全性，开展了Cry1Ie蛋白的消化及热稳定性研究。利用实验室已经构建的表达载体，在大肠杆菌中表达了分子量为81 kD的可溶性Cry1Ie蛋白，经过Ni-NTA亲和层析和Superdex-75分子筛层析获得纯度达91%蛋白。模拟消化液实验结果表明，Cry1Ie蛋白在模拟胃肠液中15 s内即被消化，SDS-PAGE未检测到蛋白残留。热稳定性实验中，Cry1Ie蛋白在玉米粉提取液中不稳定，100℃ 30 min内蛋白基本降解。对样品进行了生物活性测定发现，经模拟胃肠液消化处理和热处理后的Cry1Ie蛋白对亚洲玉米螟无杀虫活性。Cry1Ie蛋白在胃肠液系统中和热处理条件下均不稳定，并丧失了对亚洲玉米螟的杀虫活性。

大菱鲆病原鳗弧菌的检验与分析

郭杨柳, 吴楠, 房海, 陈翠珍, 李艳云, 王晓珊, 卢会鹏, 张东林

2015, 31(11): 222-227. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.029

摘要 ( 366 )

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旨对从发病死亡的养殖大菱鲆鱼苗中分离的10株细菌进行检验与分析。运用表观分类学指征、16S rRNA基因序列与系统发育、免疫血清学、人工感染的致病作用等方法进行检验。经过检验，结果表明为弧菌属(Vibrio Pacini 1854)的鳗弧菌(Vibrio anguillarum Bergeman 1909)，对供试大菱鲆显示强致病性；与用不同来源的鳗弧菌制备的全菌体抗血清能够发生免疫血清学的强凝集反应。

有机磷农药降解菌YC-YH1中mpd和ophc2的克隆及酶学性质分析

贾阳, 史延华, 任磊, 乔铖, 王俊欢, 闫艳春

2015, 31(11): 228-235. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.030

摘要 ( 275 )

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从一株有机磷农药降解菌施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri YC-YH1中克隆到两个有机磷水解酶基因mpd和ophc2。将两个基因分别连接到表达载体pET-32a并克隆到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达；利用Ni亲和层析柱纯化甲基对硫磷水解酶（MPH）和有机磷水解酶（OPHC2），并进行了酶学性质分析。MPH最高活力的反应温度为40℃，在pH8-12范围内，酶表现出较高的活力。OPHC2酶的最适反应温度为30℃，在pH 8-12的范围内酶活力较高。两种酶按1:1比例混合组成的混合酶在30-40℃范围内酶活力很高，达95%以上，混合酶在pH范围为8-12内仍具有较高的活力。多种金属离子会对酶的活性产生一定影响，酶对SDS和EDTA都有很高的敏感度，混合酶能够降低对金属离子的敏感性。

恶臭假单胞菌HspB的单晶培养及结晶条件优化

邬志杰, 吴更, 唐鸿志, 许平

2015, 31(11): 236-242. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.031

摘要 ( 265 )

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为了获得可用于X射线衍射的恶臭假单胞菌尼古丁代谢途径中关键单加氧酶HspB的单晶。定点突变PCR构建重组质粒，大肠杆菌中诱导表达，镍柱亲和层析、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)蛋白酶酶切和凝胶过滤层析纯化，悬滴扩散法进行结晶。成功构建重组质粒并获得高表达；比较了TEV蛋白酶柱上及透析酶切的效率，TEV蛋白酶透析酶切效率更高; 确定了该纯化路线，获得电泳纯级的HspB蛋白。结晶条件初筛和正交优化后获得可培养HspB蛋白单晶的条件为22% PEG3350、0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5、0.21 mol/L MgCl₂、18℃、1:50比例加晶种。去除标签后的HspB蛋白获得了分辨率1.8Å的单晶。

感染时间对MDCK细胞中H1N1甲型流感病毒扩增过程的影响

黄锭, 刘旭平, 范里, 赵亮, 谭文松, 陈则

2015, 31(11): 243-250. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.032

摘要 ( 337 )

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为了研究感染时间TOI对MDCK细胞中H1N1甲型流感病毒扩增过程的影响，以期合理优化以MDCK细胞培养技术为基础的H1N1流感病毒生产工艺，从而提高其生产效率。在不同TOI条件下以H1N1流感病毒感染MDCK细胞，考察TOI对MDCK细胞生长与代谢动力学以及H1N1流感病毒扩增过程的影响。结果表明，当TOI为72 h时，H1N1流感病毒产量最高。然而单位细胞病毒产率却随TOI增大而呈现下降趋势，进一步剖析TOI与感染时细胞密度CCI对单位细胞病毒产率的影响可知，该现象是由细胞状态而非高细胞密度所致。上述研究揭示了由TOI不同导致的细胞状态差异对MDCK细胞中H1N1流感病毒生产效率的重要性。

人类卵母细胞报告系统的构建

罗梦圆, 纪家葵

2015, 31(11): 251-256. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.033

摘要 ( 230 )

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体外分化培养干细胞得到成熟生殖细胞具有重要的科学价值和临床意义，构建出人类胚胎干细胞体外分化为卵细胞的报告系统，旨在能为这一研究提供有效的工具。ZP2是组成哺乳动物卵细胞周围透明带的重要蛋白之一，其蛋白只能在卵细胞中表达，具有很高的组织特异性。将人ZP2基因300 bp和2 500 bp启动子片段分别与eGFP荧光蛋白基因连接，利用Gateway 系统构建出重组质粒ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP，在WI38、未分化的人胚胎干细胞H9和小鼠卵母细胞中验证其荧光蛋白表达组织特异性。结果表明，ZP2-2 500-eGFP报告系统可以特异启动荧光报告基因在小鼠的卵母细胞中的表达。

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2015, 31(11): 777.

摘要 ( 158 )

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