生物技术通报

植物生物反应器制药的现状及展望

陈金梅,姜路壹,洪治

2015, 31(10): 1-7. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.005

摘要 ( 518 )

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随着生命科学的发展以及基因工程和分子生物学技术的迅速崛起, 人们能够利用不同生物体作为“工厂”生产出可供治疗人类疾病和具有保健功能的产品, 即生物制药。目前使用的生物反应器平台有细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物表达系统, 其中以植物为平台的生物反应器以其技术操作简单和成本较低越来越受到人们的青睐。就植物生物反应器在生物制药领域的应用、存在的问题以及可以采取的改进措施进行了概述。同时针对目前生物制药发展的趋势, 对植物生物反应器的应用及推广进行了展望。

植物诱导型启动子及相关顺式作用元件研究进展

李濯雪,陈信波

2015, 31(10): 8-15. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.006

摘要 ( 695 )

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启动子是基因表达调控的重要元件, 而启动子能正确调控基因的表达需要核心启动子以及上下游的顺式作用元件协同作用。诱导型启动子的应用减少了外源基因表达时产生的大量异源蛋白等代谢产物的积累和植物能量的浪费。综合近几年关于诱导型启动子的研究, 从其启动子的结构及功能、分类、应用及相关顺式作用元件等方面进行概述, 提出了在研究过程中存在的问题及展望。

植物非细胞自主性小RNA分子研究进展

邓帅,张婷婷,王茹茹,刘宇,张元湖

2015, 31(10): 16-23. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.007

摘要 ( 474 )

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非细胞自主性是RNA干扰的主要特点之一, 表现为沉默效应可以在细胞、组织和生物个体间传递和扩散, 可移动的小RNA分子在这种非细胞自主性的沉默扩散中发挥了核心作用。近年来的研究表明小RNA分子可以与转录因子、多肽和植物激素一样传递胞间信息, 并以其特有的方式调控发育模式、响应环境胁迫、增强病毒抗性和维持转座子的沉默。综述了近年来在植物非细胞自主性RNAi研究中取得的主要进展, 主要介绍了通过韧皮部和胞间连丝途径传递沉默信号的各种小RNA分子及其生物学作用、非细胞自主性小RNA的分子特征和运输效率的调控, 并对存在的问题及其研究前景进行了展望。

甾族糖苷生物碱研究进展

许蕙金兰,王翠翠,傅达奇

2015, 31(10): 24-30. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.008

摘要 ( 645 )

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甾族糖苷生物碱是茄科植物中广泛存在的一种物质, 存在于植物的叶子、根、花、果实和块茎中, 具有多种生物活性, 如抗癌、抗真菌、抗病毒、抗氧化及抗炎等功能。关于植物中糖苷生物碱的分布、含量、生物活性及合成代谢途径的研究一直是本领域的研究热点。糖苷生物碱生物合成分子机理的研究将为优良品种的培育提供理论依据。对甾族糖苷生物碱的结构、生物活性及其生物合成途径进行了综述。

赤霉素信号在非生物胁迫中的作用及其调控机制研究进展

牛亚利,赵芊,张肖晗,艾秋实,宋水山

2015, 31(10): 31-37. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.009

摘要 ( 509 )

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赤霉素（GA）能促进种子萌发和植物生长发育。近年来的研究表明赤霉素这一激素在植物响应非生物胁迫中同样发挥着重要的作用。植物通过调节GA生物合成、信号转导及其生物活性提高胁迫耐受性。综述了赤霉素在应对常见的几类非生物胁迫中所起的作用, 分析了其合成、信号转导通路调控机制以及赤霉素与其他激素在响应非生物胁迫的关系。

铁蛋白纳米颗粒应用于生物医疗领域的研究进展

李志鹏,刘庆友,石德顺,

2015, 31(10): 38-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.010

摘要 ( 606 )

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在漫长的进化过程中, 生物系统中出现了多种多样的纳米粒子。其中铁蛋白纳米粒子广泛存在于所有生物体内, 是参与生命活动的重要功能蛋白。近年来, 铁蛋白自组装纳米粒子特殊的理化性质使其在生物医学领域应用中呈现出巨大的优势和应用前景。铁蛋白纳米笼的应用主要包括微量血清铁蛋白的临床检查、作为营养物质补充机体铁需求、纳米生物材料平台和纳米材料的生物呈递等。综述了铁蛋白纳米粒子在疾病诊断与治疗以及药物呈递与疫苗开发上的应用, 并对铁蛋白纳米粒子在生物医学领域的应用前景进行展望。

细菌群体感应信号分子淬灭酶的研究进展

邢启凡,柳鹏福,史吉平,孙玉梅

2015, 31(10): 48-55. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.011

摘要 ( 690 )

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群体感应（Quorum sensing, QS）是细菌细胞间通过信号分子互相交流的一种现象, 细菌细胞通过分泌并感应特定的信号分子浓度, 当信号分子浓度达到一定阈值时, 细菌细胞会启动特定基因尤其是很多致病基因的表达, 这就给防治某些植物、动物性疾病提供了一种新思维。群体淬灭（Quorum quenching, QQ）就是基于群体感应而提出的, 它主要是通过分解细菌细胞所产生的信号分子, 使信号分子浓度在阈值之内, 从而使细菌无法表达特定致病因子, 进而防治病害的一种方法, 群体淬灭酶是研究的最多也是最有效的淬灭途径。到目前为止, 很多群体淬灭酶已经被分离出来。系统总结了群体淬灭酶的种类、特性、催化机制和生理功能方面的进展。

镉诱导细胞自噬的研究进展

王棋文,宋德荣,刘其昌,周大荣,彭华,张琼娣,罗耀

2015, 31(10): 56-61. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.012

摘要 ( 329 )

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镉是一种有毒的重金属, 其对环境和人类的健康造成巨大危害。越来越多的证据表明镉对多个器官和系统造成损害, 甚至引起癌变和肿瘤。自噬是进化上保守的, 利用溶酶体途径降解细胞内蛋白质和细胞器的过程。一方面, 自噬通过清除受损的细胞器保护细胞免受镉损伤; 而当细胞受到的损伤不可逆时, 自噬作为一种死亡机制导致细胞死亡。自噬在镉引起的细胞损伤中的作用目前仍有争议, 可能是镉的剂量和暴露时间的不同造成了自噬在损伤中的作用不同。目前对自噬在其中的作用机理研究, 主要集中在mTOR, Ca²⁺, Beclin-1等信号分子。对镉与自噬分子机理的研究, 可以为治疗和预防镉中毒提供新思路。综述了自噬在镉致细胞毒性中的作用, 以及镉诱导细胞自噬的信号调节通路。

鲟鱼性别分化相关基因研究进展

东天,刘凤娇,胡红霞,朱华

2015, 31(10): 62-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.013

摘要 ( 424 )

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鲟鱼是目前世界上最古老的鱼类之一, 其肉质鲜美, 营养丰富, 鱼卵加工成的鱼子酱具有极高的经济价值。鲟鱼鱼子酱价格居高不下, 因此养殖雌性鲟鱼比养殖雄鱼具有更高的经济前景。由于鲟鱼外形无法辨别雌雄, 目前, 通常借助超声波、内窥镜等仪器进行早期性别鉴定, 但鉴别准确性无法保证。因此采用现代分子生物学技术探究鲟鱼性别决定及性别分化机制有助于早期鲟鱼性别鉴定技术的开发及实现鲟鱼全雌化苗种培育。总结了鱼类性别决定与性别分化相关基因的研究现状, 综述了目前在鲟鱼上性别决定与性别分化相关基因的研究进展并预测了未来的研究方向及研究趋势。

蛋白质组学技术在玉米杂种优势研究上的应用进展

冯万军,窦晨,牛旭龙,邢国芳

2015, 31(10): 71-76. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.014

摘要 ( 340 )

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杂种优势是生物界普遍存在的一种现象, 在玉米中已经广泛应用, 但其形成的分子机理仍不清楚。蛋白质组学技术是一种高通量筛选重要功能蛋白的研究手段, 在玉米杂种优势的形成上进行蛋白质组学研究有利于深入解析杂种优势形成的分子机制。简单介绍了玉米杂种优势的表现, 并对玉米种子胚、苗期根系、叶片和雌穗等性状上有关杂种优势形成的分子机理的蛋白质组学研究进行了综述。

利用分子生物学技术提高微生物有机溶剂耐受性的研究进展

王艳霞,刘祥胜,王敏,骆健美

2015, 31(10): 77-88. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.015

摘要 ( 386 )

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耐有机溶剂微生物是一类能够在较高浓度有机溶剂中存活或者生长的微生物, 其在非水相生物催化等领域表现出巨大的应用优势。与自然筛选、长期驯化和传统诱变等方法相比, 利用分子生物学技术获得微生物有机溶剂耐受菌株是一种更为理性且高效的手段。主要综述了近年来利用分子生物学技术对耐性相关功能基因和转录因子进行改造, 提高微生物有机溶剂耐受性的研究进展, 并展望了有机溶剂耐受菌株的应用前景。

转基因技术：糖尿病的动物模型构建及治疗

王鹤霏,刘东军

2015, 31(10): 89-98. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.016

摘要 ( 404 )

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糖尿病是严重危害人类健康的疾病, 近年来, 随着转基因理论及技术的发展, 很多科学家都致力于应用转基因技术治疗糖尿病, 并取得了显著成效。主要综述了目前在转基因糖尿病动物模型构建和糖尿病治疗方面取得的诸多成果, 以及面临的挑战。提出了今后在建立高效的胰岛素基因转移体系、选择与β细胞生理特点相似又免受自身免疫系统攻击的靶细胞、基因表达的持续性和糖尿病易感基因的鉴定等方向的突破, 可以加快糖尿病的基因治疗用于临床的步伐。

微生物技术在防治农业面源水污染中的研究

李白,李军

2015, 31(10): 99-104. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.017

摘要 ( 375 )

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农业面源污染已是我国总面源污染的第一大来源, 而水污染是农业面源污染最重要的内容。由于面源污染的复杂性, 防治农业水污染, “防”胜于“治”。随着近几十年科学技术的迅猛发展, 微生物技术在防控农业水污染措施中起着越来越重要的作用。微生物技术通过减量农业源头污染, 截留农业过程污染, 来减少污染物向周围水体的排放, 有利于农业生态环境的可持续发展。综述和展望了微生物技术在防治农业面源水污染“源头减量”和“过程截断”中的应用, 为农业面源水污染防治提供参考。

病毒诱导的基因沉默及其在植物研究中的应用

孙威,许奕,许桂莺,孙佩光,宋顺,常胜合

2015, 31(10): 105-110. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.018

摘要 ( 371 )

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病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）在植物的基因功能鉴定中是一个非常有用的工具, 在植物中了得到广泛应用。与传统的研究植物基因阻断的方法相比, VIGS具有简便高效、周期性短、不需要对植物进行转化以及可以沉默基因家族等特点, 而且在一定条件下其沉默效应还能够传递给后代。介绍了VIGS的原理与操作过程, 综述了该技术的应用与研究成果, 有助于推动其在植物尤其是农作物育种中的进一步应用与发展。

干旱和低温胁迫影响烟草幼苗海藻糖代谢的差异比较

张建波,王莎莎,郝大海,杨慧芹,马文广,高雪,崔明昆,龚明

2015, 31(10): 111-118. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.019

摘要 ( 264 )

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为了明确海藻糖代谢在干旱和低温胁迫下的响应及其差异, 以及海藻糖在烟草耐旱和耐冷性中的作用, 选用烟草品种云烟203幼苗为实验材料, 通过对烟草幼苗进行干旱和4℃低温胁迫处理, 研究叶片中海藻糖含量及代谢相关酶（海藻糖-6-磷酸合成酶TPS、海藻糖-6-磷酸磷酸酶TPP、海藻糖酶THase）活性及基因表达变化情况。结果表明, 在干旱和低温胁迫下, 海藻糖含量表现出先升高后降低趋势, 均在处理2 d时海藻糖积累达到最大, 且干旱胁迫下海藻糖含量高于低温胁迫。TPS、TPP活性在干旱和低温胁迫下先升高后降低, 且干旱高于低温; THase活性在干旱和低温胁迫下均不断升高, 低温下的THase活性高于干旱。TPS、TPP、THase基因在干旱下的表达量均高于0 d对照, 低温下低于0 d对照。以上结果表明, 干旱和低温胁迫均能促使烟草体内海藻糖的积累, 干旱更能诱导相关基因的表达、相关酶活性及海藻糖含量的升高, 表明海藻糖对干旱响应更敏感。

无苞芥锌指蛋白基因OpZFP提高烟草耐盐性的研究

王崎崎,郭丹丽,吴晓庆,费春艳,黄先忠

2015, 31(10): 119-124. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.020

摘要 ( 323 )

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旨在研究C2H2型锌指蛋白在植物生长发育、非生物胁迫信号转导过程中的作用。前期从新疆无苞芥中克隆的一个单锌指基因OpZFP, 利用叶盘法将OpZFP基因转入普通烟草中。半定量RT-PCR表明, 在转基因植株中OpZFP基因能够高效表达。烟草耐盐性分析显示, 在高盐胁迫下, 转基因植株的根长要长于野生型植株, 且转基因烟草丙二醛（MDA）的含量要明显低于野生型植株; 并且高盐胁迫处理, 野生型烟草离体叶片叶绿素降解率高于转基因植株。这些结果表明, 过量表达OpZFP的转基因植株可以提高植物对盐胁迫的抗性。

木薯MeASR基因克隆及表达分析

胡伟,颜彦,韦运谢,王文泉,夏志强,卢诚,侯晓婉,彭明

2015, 31(10): 125-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.021

摘要 ( 372 )

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脱落酸-胁迫-成熟诱导蛋白（Abscisic acid-stress-ripening, ASR）在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。利用PCR技术从木薯中克隆了第一个ASR基因MeASR, 序列分析表明该基因开放阅读框（ORF）330 bp, 编码109个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有ASR家族蛋白的保守结构域, 与番茄ASR家族蛋白SlASR4具有较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明MeASR定位在细胞核, 实时荧光定量PCR分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和ABA诱导。结果表明, MeASR可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及ABA信号调节。

马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因（Dd-Gpx）的克隆与原核表达

刘洋,何旭峰,刘建喜,丁中

2015, 31(10): 131-139. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.022

摘要 ( 367 )

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旨在研究植物寄生线虫谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPX）的结构和功能, 通过RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）Gpx基因, 并成功克隆到pET-41b载体上进行融合表达。结果表明, 该基因cNDA全长950 bp, 含有1个681 bp的开放阅读框, 共编码226个氨基酸。生物信息学分析显示, 该蛋白N端有明显信号肽, 属于分泌蛋白。将其克隆到pET-41b载体在BL21（DE3）中进行原核表达, 结果显示, 在60 kD处有一条明显的带。经质谱鉴定, 此条带有7个肽段与马铃薯腐烂茎线虫GPX匹配。表明重组Dd-GPX蛋白表达成功。

小桐子赤霉素20氧化酶的基因克隆及低温下表达分析

王海波,邹竹荣,龚明

2015, 31(10): 140-148. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.023

摘要 ( 346 )

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赤霉素20氧化酶是植物赤霉素生物合成的限速酶, 决定有生物活性的GA₁与GA₄的合成量。基于先前获得的小桐子低温锻炼转录组数据, 以小桐子幼苗的根为材料, 采用RT-PCR技术克隆到小桐子赤霉素20氧化酶基因JcGA20ox的cDNA序列（GenBank登录号KJ670150.1）。该cDNA全长1 307 bp, 含有完整的开放阅读框（1 131 bp）, 编码376个氨基酸, 分子量为43 kD, 理论等电点为6.7。其推导蛋白属于2-ODD家族, 包含2-酮戊二酸双加氧酶结构域（Fe2OG_OXY）。半定量RT-PCR表达分析显示, JcGA20ox在小桐子各组织中都有表达, 但表达水平具有组织特异性, 在茎中表达量较高, 且受低温诱导表达最显著, 而在叶中表达量相对较低。

大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、序列分析及表达研究

梁慧芳,曾凡荣,毛建军

2015, 31(10): 149-156. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.024

摘要 ( 370 )

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旨在为研究大眼长蝽（Geocoris pallidipennis）卵黄原蛋白（Vitellogenin, Vg）分子特性及其基因生理功能。利用RT-PCR、RACE及ELISA方法对大眼长蝽Vg基因进行克隆、序列分析和表达研究。该基因cDNA全长5 667 bp（GenBank登录号：KP688587）, 编码1 848个氨基酸残基, N-末端的前19个氨基酸为信号肽。氨基酸序列中有两个保守的多聚丝氨酸区域和RXXR酶切位点, 接近C-末端有GLAG基序, 其后有5个保守的半胱氨酸残基, DGYR基序位于GLAG上游18个氨基酸残基处。该基因编码氨基酸序列与其它半翅目昆虫Vg氨基酸序列相似度较高, 氨基酸序列分析显示它有Vg的典型特征, 表明克隆的cDNA序列是大眼长蝽的Vg基因序列。ELISA检测发现随着发育时间的延长, 卵黄原蛋白表达量逐渐增加, 羽化后22 d达到高峰, 随后开始下降, 结果表明大眼长蝽雌虫卵黄原蛋白的表达量与大眼长蝽产卵量紧密相关。

虾夷扇贝热休克蛋白60基因克隆及表达特性研究

孔繁东,史井运,鲍相渤,高祥刚,赫崇波,刘卫东

2015, 31(10): 157-164. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.025

摘要 ( 312 )

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旨在探讨虾夷扇贝高温应激的分子机理并为解决该种夏季死亡问题打下基础。基于HSP60的转录组序列设计特异引物, 采用RACE技术成功克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白60（MyHSP60）cDNA全序列。其cDNA序列全长3 368 bp, 包括68 bp的5' UTR, 1 569 bp的3' UTR和1 731 bp的开放阅读框, 共编码576个氨基酸。利用基因步移技术扩增MyHSP60基因启动子区域序列并测序, 获得MyHSP60基因启动子区域序列1 236 bp, 该区域包含2个TATA盒, 4个CCAAT盒, 3个热激元件。基于氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达, 升温后肾脏中该基因的转录量升高极显著, 而肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中的转录量升高显著（P<0.05）, 说明该基因在热应激过程中发挥一定作用。

柴胡内生真菌鉴定与抑菌活性筛选

李玲玲,罗合春,张先淑

2015, 31(10): 165-170. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.026

摘要 ( 375 )

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从野生柴胡中分离内生真菌, 旨在寻找具广谱抗菌活性的内生真菌。对采自四川省甘孜藏族自治州的一株健康野生柴胡中的内生真菌进行分离, 以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠埃希菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为指示菌, 对分离到的内生真菌分别利用琼脂块法和双层平板法法进行抑菌活性的初筛和复筛。从其根、茎、叶中共分离出27株内生真菌, 经分类鉴定, 隶属于9个属, 其中青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）为优势属。26株内生真菌对两种或3种指示菌均具有一定的抑菌活性, 占分离菌株总数的96.30%, 其中5株（CHG-01、CHG-04、GHJ-10、CHY-01和CHY-03）对3种指示菌均有较强抑菌活性。柴胡内生真菌的次级代谢产物中存在着天然抑菌活性物质, 可为寻找新型抗菌物质提供资源。

产脂肪酶嗜酸性真菌的筛选、鉴定与产酶条件优化

赵军,赵淑琴,杨孝朴,刘晓丽

2015, 31(10): 171-176. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.027

摘要 ( 324 )

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旨在筛选获得高产脂肪酶菌株, 并鉴定其种属及确定最佳产酶条件。从兰州城区附近采集富含油脂的土壤, 通过维多利亚蓝与罗丹明B培养基进行菌株分离初筛。用改进铜皂-分光光度法测定酶活力值进行复筛, 获得一株产酶能力较强的菌株LZ-6。经形态学观察和分子生物学鉴定, 该菌株为雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）。经单因素实验与正交实验确定该菌株的最佳产酶条件为：酵母粉1%、橄榄油2%、MgSO₄·7H₂O 0.05%、（NH₄）₂SO₄0.1%、K₂HPO₄0.2%、温度30℃、pH5.0、接种量为2%、发酵5 d, 在此条件下, 产酶活力达13.35 U/mL, 比优化前提高了1.78倍。

铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选

张翠坤,常冬妹,杨洪江

2015, 31(10): 177-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.028

摘要 ( 382 )

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从多种来源筛选高产鼠李糖脂的菌株, 并研究菌种发酵特性和鼠李糖脂产物的理化性质。采用CTAB平板初步筛选鼠李糖脂合成菌株, 通过分析菌株的16S rRNA基因序列确定细菌种属, 采用薄层色谱、红外光谱分析产物性质。结果显示, 利用CTAB平板初筛获得163株阳性菌株, 初步发酵确定10株高产细菌鼠李糖脂的产量为12.2-17.7 g/L, 10株细菌均鉴定为铜绿假单胞菌。挑选产量最高的菌株B12, 分别以甘油、菜籽油、花生饼粉或葵花籽饼粉为碳源进行发酵, 发现菜籽油为合成鼠李糖脂的最佳碳源。进一步对比在35℃、37℃和40℃的发酵水平, 发现37℃条件下鼠李糖脂产量最高, 为26.8 g/L。最后, 对鼠李糖脂发酵产物进行了初步纯化, 并进行了薄层色谱和红外光谱分析。菌株B12能够合成较高水平的鼠李糖脂, 可能成为工业生产的候选菌株。

同步脱氮除硫菌的筛选鉴定及其生长特性研究

黄俊,张诗颖,王翻翻,李月寒,吴鹏,宋吟玲

2015, 31(10): 184-190. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.029

摘要 ( 369 )

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为促进反硝化脱硫工艺的工程化应用, 从稳定运行的反硝化脱硫UASB中筛选出2株高活性自养反硝化菌H3和H7, 并对其进行了鉴定和生长及反硝化特性的研究。结果表明, 2株菌均为革兰氏阴性菌, 16S rDNA序列分析表明, 分别与Pseudomonas stutzeri CONC12和 Pseudomonas stutzeri 19smn4相似性为99.6% 和98.9%。结合生理生化特性和16S rDNA序列分析, 确定两菌株都为Pseudomonas stutzeri。对两菌株的生长和反硝化特性研究表明, 菌株H3和H7的生长最适起始pH为6.94和6.88, 最适反硝化pH分别为6.77和6.56。H3和H7的最适生长温度为30.4℃和30.6℃, 最适反硝化温度分别为31.4℃和31.2℃, 两株菌种都为非耐盐菌株。

耐冷好氧亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性研究

何腾霞,李振轮

2015, 31(10): 191-198. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.002

摘要 ( 371 )

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旨在对获得的具有耐冷高效去除亚硝酸盐氮和总氮的好氧反硝化细菌进行分类地位及除氮特性研究。结合形态学观察、特异性磷脂脂肪酸检测和16S rRNA基因序列分析, 对实验室新分离获得的Y-9菌株进行鉴定, 在此基础上, 研究了温度、转速、pH、接种量、碳源和亚硝酸盐氮浓度等不同条件对该菌脱氮能力的影响。结果显示, 菌株Y-9属于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）, 还原亚硝酸盐氮的最适温度为15℃, 最佳溶解氧水平对应转速为100 r/min, 在该溶解氧水平下15℃、48 h内对亚硝酸盐氮和总氮的去除率高达100%和77.13%, 最佳pH为7, 100 mL反硝化培养基中最适接种量为1 mL OD₆₀₀为0.5的菌悬液, 碳源为柠檬酸钠, 适合治理低浓度的亚硝酸盐氮污染水体, 但对高浓度的亚硝酸盐氮具有一定耐受性。Y-9为一株耐冷反硝化细菌, 在亚硝酸盐污染的养殖水体, 尤其是冷水鱼类养殖水体中具有较大的应用潜力。

常压室温等离子体（ARTP）诱变快速选育高产DHA的裂殖壶菌突变株

袁军,赵犇,孙梦玉,王武,杨海麟

2015, 31(10): 199-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.030

摘要 ( 486 )

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旨在建立一种能够快速便捷的诱变选育高产DHA菌株的方法。出发菌株Schizochytrium sp. ATCC 20888悬浮液经过常压室温等离子体（ARTP）处理后, 涂布到2, 2&-联吡啶平上板培养。将所得的突变菌株摇瓶发酵培养, 通过磷酸香草醛油脂快速检测法和气相色谱分析从突变菌株中筛选得到DHA高产菌株。结果表明, 裂殖壶菌诱变选育条件为ARTP为处理时间15 s, 气量10 L/min, 电功率100 W; 2, 2&-联吡啶浓度为100 μmol/L。通过该方法可以获得高产DHA的菌株。其中D32菌株 DHA生产能力提升显著, 比初始菌株提升了29.8%, DHA产量达到7.31g/L。D32菌株与出发菌株相比, 主要的饱和脂肪酸含量显著下降（P<0.005）, 而不饱和脂肪酸含量显著增加（P<0.005）。经5次传代后性状稳定, 本方法快捷高效, 同时也为其他多不饱和脂肪的诱变选育方法提供参考。

山苍子油对白假丝酵母抗菌活性研究

梁青,李文茹,施庆珊,章卫民

2015, 31(10): 205-210. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.031

摘要 ( 456 )

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研究山苍子油对白假丝酵母菌的抗菌活性, 并阐明其可能的抗菌机制。通过水蒸馏法提取山苍子油, 并利用气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）分析其成分。通过琼脂平板稀释法测定山苍子油对白假丝酵母的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）, 并研究山苍子油对白假丝酵母的抗菌动力学; 同时利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察山苍子油对白假丝酵母细胞超微结构的影响。结果表明, 自提山苍子油主成分为柠檬烯（26.51%）, 柠檬醛（11.94%）和马鞭烯醇（11.84%）。山苍子油对白假丝酵母菌的MIC和MFC均为1.25 μL/mL; 其抗菌动力学研究表明浓度低于其MIC时, 山苍子油仅延长白假丝酵母的生长适应期, 并不能彻底杀死细胞; SEM结果表示, 山苍子易破坏正在出芽的细胞; TEM显示出山苍子破坏细胞壁, 细胞膜, 使细胞裂解。山苍子油具有优良的抗白假丝酵母活性, 且白假丝酵母在芽痕处对山苍子油比较敏感, 高浓度的精油（5.0 μL/mL）对细胞产生不可逆破坏; 山苍子油杀菌的靶标可能是细胞壁和细胞外膜, 使细胞内大分子外泄, 细胞器变形, 最终导致细胞死亡。

PFOS对再生东亚三角涡虫抗氧化酶活性的影响

苗自利,袁佐清

2015, 31(10): 211-215. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.032

摘要 ( 564 )

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为了探究全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate, PFOS）对再生涡虫抗氧化酶活性的影响, 以再生中的涡虫作为实验材料, 采用酶活性的测定的方法来探究PFOS对再生中东亚三角涡虫中抗氧化酶活性的影响。结果表明, PFOS刺激涡虫产生应激反应。在再生早期, PFOS胁迫会造成涡虫的氧化损伤和脂质的过氧化, 并表现出随着PFOS浓度的升高, 涡虫氧化损伤程度加剧的趋势; 再生5 d时, 机体产生抗氧化的反应来消除体内的氧自由基; 在再生的后期, 由于涡虫对药物的耐受作用, 涡虫的抗氧化反应不显著。

重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测

陆睿,宋绍征,祁正强,葛欣,邵宾,成勇

2015, 31(10): 216-221. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.033

摘要 ( 436 )

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人组织纤溶酶原激活剂（ht-PA）是临床血栓疾病治疗的主要生物药品, 应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道, 但重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K₁区位点缺失体为编码序列, 以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子, 构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA, 通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔, ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只（2♂, 3♀）, 其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂, rhPA浓度最高可达400 μg/mL, 表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明, 重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达, 表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。

豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定

杨刚刚,马诚凯,史世会,张全义,王泽,吕中原,王绪洋,许晓亚,崔晴晴,张继红,丁一,徐存拴

2015, 31(10): 222-229. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.034

摘要 ( 429 )

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豹蛙抗瘤酶（Onconase, ONC）, 又称豹蛙酶, 对多种肿瘤细胞和实体瘤具有显著杀伤作用, 为得到高表达的ONC, 利用HSA在毕赤酵母系统中的表达优势, 将HSA和ONC融合进行毕赤酵母表达并分离纯化。设计融合基因HSA-（Gly₄Ser₁）₃-ONC, 简称HSA-ONC, 构建至3种表达载体pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A 并分别转染X-33、GS115和SMD1168 3种宿主菌, 在摇瓶和10 L规模优化表达条件和双水相偶联柱层析分离纯化目的蛋白并测定其生物学活性。结果显示, 在1 L摇瓶规模下, pPICZα-A/X-33/HSA-ONC组合的表达量优于其他组合, 且在pH7, 温度23℃条件下诱导10 d, 表达量达到最高（235 mg/L）。在10 L规模进行不同培养基条件的发酵, rHSA-ONC于pH 7的低盐基础盐培养基（Low salt basic salt medium, LS-BSM）, 甲醇浓度0.25%条件下诱导10 d, 表达量达到最高（2.02 g/L）。经双水相萃取偶联DEAE离子交换层析可得到纯度≥95%、收率高于70%的rHSA-ONC。生物活性检测发现, rHSA-ONC在体外能抑制多种癌细胞增殖。rHSA-ONC的表达量较rONC提高1倍（同等摩尔量情况下）, 同时在体外抑制多种癌细胞增殖。

东北林蛙发育早期TLR2的表达及免疫应答特征

王泽,赫天一,陆宇燕

2015, 31(10): 230-235. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.001

摘要 ( 550 )

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旨在研究东北林蛙发育早期TLR2的表达特征及其针对不同PAMPs的免疫应答特征。免疫组化染色及RT-PCR对11期至42期东北林蛙TLR2进行定位和定量检测; 29期蝌蚪0.5 μg/mL的LTA, LPS, ZymoA, Poly I:C急性腹腔注射, RT-PCR检测24 h内TLR2 mRNA相对表达量变化。结果显示, TLR2在东北林蛙发育早期的组织中分布广泛, 11期TLR2 mRNA相对表达量0.187±0.021, 25期升至0.373±0.031后, 42期降至0.170±0.020。24 h内未检测到LPS组和Zymo A组TLR2 mRNA相对表达量显著性变化（P>0.05）, LTA组在4 h与12 h出现两次极显著性升高（P<0.01）; PolyI:C组于8 h至峰值（P<0.01）。东北林蛙发育早期TLR2的时空表达特征与其发育阶段的生境变化相适应, 29期东北林蛙的TLR2对4种PAMPs识别和应答兼具了鱼类和哺乳动物的特征, 体现了免疫系统在进化上的演变。

大型反应器内pH不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响

刘金涛,王星懿,范里,邓献存,刘旭平,谭文松

2015, 31(10): 236-241. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.003

摘要 ( 523 )

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为了研究大型反应器中pH不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响, 并将培养过程顺利地放大到生产规模, 根据大型反应器的混合特性, 构建了搅拌式反应器与平推流反应器串联的规模缩小装置用于模拟大型反应器中的pH不均一性。结果表明停留时间为30 s时, 整个培养过程和对照相比并无显著的差异, 这表明此时补碱所导致的pH不均一性并未对流加培养工艺造成影响。而随着停留时间的延长, 反应器内pH不均一的程度越大, 细胞生长和产物表达受到抑制越明显; 与此同时, 乳酸和氨的累积显著增加, 而关键质量属性唾液酸和生物学活性也随之降低。

ERK1/2在食管鳞状细胞癌中促进细胞增殖、抑制凋亡及其调控机制的研究

刘凤霞,刘文娟,李建勇,陈胜国

2015, 31(10): 242-248. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.035

摘要 ( 387 )

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探讨ERK1/2 在食管鳞状细胞癌（ESCC）中对肿瘤细胞增殖、凋亡的调控及其机制。平板克隆、细胞凋亡和细胞周期实验结果发现ERK1/2 MAPK通路抑制可减弱Eca109细胞克隆形成和增殖, 促进细胞凋亡, 减慢细胞周期; 进一步发现ERK1/2 MAPK通路抑制可以反转由miR-21过表达诱导的Eca109细胞增殖、凋亡和周期的变化; qRT-PCR和Western-blot免疫印迹结果发现ERK1/2 MAPK信号通路抑制可以下调内源性miR-21表达和反转外源性miR-21诱导的ERK1/2 MAPK信号通路活化。实验结果提示ERK1/2 MAPK通路抑制可能通过下调Eca109细胞中miR-21表达阻碍Eca109细胞增殖、促进细胞凋亡和减慢细胞周期, 最终导致ESCC细胞生长抑制。

基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛

袁梦,何志旭,舒莉萍,袁家侃,刘丰,李燕

2015, 31(10): 249-254. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.004

摘要 ( 469 )

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采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型, 进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sgRNA, 分别靶向ExonⅠ的192#位点, 244#位点及313#位点。化学合成sgRNA的寡核苷酸序列, 经过酶切克隆进pT7-gRNA质粒中, 构建gRNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的gRNA。将质粒pSP6-2sNLS-spCas9线性化然后在体外转录得到Cas9的mRNA并进行加A尾, 将以上靶位点的gRNA与Cas9的mRNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内, 提取基因组DNA, PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效, 最后将PCR产物连入pMD19-T simple 载体中, 挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定, 然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示, 靶位点的sgRNA寡核苷酸双链成功连入pT7-gRNA质粒中且序列正确; 其中靶向ExonⅠ的313#位点的sgRNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因, T7EⅠ检测其敲除效率高达26.5%, 并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型, 为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。

一种嵌合型调控元件在肿瘤靶向基因治疗中的应用

周培杰,高维强,方煜翔

2015, 31(10): 255-262. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.036

摘要 ( 350 )

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肿瘤靶向基因治疗成功的关键是调控治疗基因在肿瘤细胞中特异、高效地表达。首次构建一种嵌合型表达调控元件, 旨在转录水平、转录后水平和翻译水平上实现联合调控目的基因在肿瘤细胞中特异性表达。体外实验表明, 在前列腺癌细胞系LNCaP中, 该调控元件可将报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和荧光素酶（luciferase）的肿瘤表达特异性分别提高420%和480%。体外细胞存活实验表明, 运用该元件调控单纯疱疹病毒-1胸腺激酶（HSV-1 TK）的表达能特异性杀伤LNCaP细胞, 验证了该元件可成功用于治疗基因的肿瘤靶向表达。

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2015, 31(10): 777.

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