生物技术通报

细菌耐药性的系统性防控：从新机制到新策略

孙坚, 刘雅红

2022, 38(9): 1-3.

摘要 ( 392 )

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细菌耐药：生化机制与应对策略

刘成程, 胡小芳, 冯友军

2022, 38(9): 4-16. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0759

摘要 ( 841 )

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抗生素的过度使用以及滥用加速了细菌耐药性的产生及蔓延。细菌耐药性俨然已成为导致人类死亡的第三大原因,严重威胁了全球公共健康。因此,当下亟需加强细菌耐药的机制研究,并探索应对耐药性的新型防控策略。针对几类重要耐药细菌,本文就细菌耐药的主要生化机制：药物渗透障碍、药物作用靶位改变、药物失活以及主动外排进行了总结;并对其防控策略：抗菌肽疗法、免疫疗法、噬菌体疗法、抗菌光动力疗法、益生菌疗法、抗菌纳米颗粒技术、反义寡核苷酸和基因编辑技术、宿主导向疗法等进行了归纳。该综述致力于为细菌耐药性进行科普,并为耐药性的相关研究提供参考。

基于功能宏基因组学挖掘抗生素耐药基因研究进展

鲁兆祥, 王夕冉, 连新磊, 廖晓萍, 刘雅红, 孙坚

2022, 38(9): 17-27. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0537

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随着各类抗生素被广泛用于治疗细菌感染以及抗生素在临床上的大量使用,驱动了各类抗生素耐药基因的不断进化,导致了耐药问题日趋严重。耐药基因与耐药细菌的广泛传播与普遍流行严重威胁公共卫生体系并引起了巨大的经济损失。值得注意的是,抗生素的广泛施用不仅造成了动物体内耐药细菌的产生,还提高了对环境中微生物的选择压力,间接推动了耐药基因的发展与进化,使环境微生物成为耐药基因新的储库。因此对耐药细菌的广泛监测与新型耐药基因的提前发掘具有重要的临床意义与研究价值。但是传统的耐药性调查手段过度依赖对耐药细菌的培养,难以全面的展现固定生态位中微生物耐药性的全貌。而功能宏基因组学技术利用其表型筛选和高通量测序相结合的优势,不依赖于对携带目标基因的特定细菌的培养,因此在发掘新型功能基因方面有着巨大的优势。本文综述了功能宏基因组在抗生素耐药方面的研究进展,讨论了功能宏基因组学方法在检测新型基因研究中的意义及存在的问题,为后续深入开展对抗生素耐药机制的探究提供了坚实的理论基础。

细菌黏菌素耐药性及其逆转机制研究进展

胡功政, 崔小蝶, 翟亚军, 贺丹丹

2022, 38(9): 28-34. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0384

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黏菌素（colistin,COL）目前被认为是治疗多重耐药（multidrug-resistant,MDR）革兰氏阴性菌感染的最后一道防线。而随着COL使用的增长,世界范围内细菌COL耐药性也日益增长。研制具有新作用靶点的新抗菌药异常艰难,而逆转耐药性的联合用药是与MDR细菌斗争的经济有效策略。抗生素佐药针对细菌的非必须功能,并增强抗生素活性,可提供经济有效的方法逆转细菌耐药性。本文在概述COL作用机制、细菌耐药机制基础上,重点论述佐药对细菌COL耐药性的逆转作用及其逆转机制。目前已报道的COL耐药性逆转佐药有60余种,细菌被膜损害、外排泵机制、mcr-1基因的表达水平降低或MCR-1蛋白抑制被证明是重要的逆转机制。对COL耐药性逆转及逆转机制研究存在的问题进行了分析,并对其发展方向进行了展望。高效逆转佐药筛选、逆转作用的量效关系及其深入的机制研究,将是未来重要的发展方向。

质粒接合转移及其抑制剂的研究进展

刘艺云, 邓利敏, 岳慧颖, 岳超, 刘健华

2022, 38(9): 35-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0688

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随着细菌耐药性快速发展且不断出现新的耐药菌,临床抗感染治疗可选择的抗菌药物越来越少,不通过直接杀灭病原菌而寻求控制耐药基因的传播正成为一种新的耐药性防控策略。质粒是耐药基因最重要的载体之一,通过接合转移可在不同来源（如动物、人和环境）细菌间传播,对耐药性传播发挥了重要作用,因而抑制质粒接合转移被认为是防控耐药性传播的有效策略之一,受到越来越多研究者的重视。本文在简要介绍耐药性传播机制的基础上,阐述质粒接合转移过程及其机制,并总结了目前质粒接合抑制剂的研究进展,以期为耐药性防控新策略的研究提供参考和借鉴。

CLSI、EUCAST和中国耐药判定标准概述

阮紫涵, 黄安雄, 王秀娟, 黄玲利, 郝海红

2022, 38(9): 47-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0695

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制定耐药判定标准的意义在于对药敏试验结果进行解释,以选择合适的药物和最佳的给药方案对动物进行治疗,是控制耐药性产生的重要手段。目前许多发达国家都成立了制定耐药判定标准的机构,其中最具影响力和权威的是美国临床和实验室标准协会以及欧盟药敏试验标准委员会两大机构。中国耐药性监测的研究起步较晚,主要借鉴美国临床和实验室标准协会所设立的耐药判定标准。2017年,在欧洲临床微生物和感染病学会和欧洲药敏试验委员会的支持下中国成立了华人药物敏感性试验委员会。近年来,在中国兽医药品监察所的带领下,各研究机构人员在耐药判定标准及耐药性监测方面也取得了突破性的进展,为控制中国抗菌药物耐药性的发展奠定了坚实的基础。本文首先介绍了耐药判定标准的定义和意义,为微生物研究者提供基本的理解;然后分别综述美国临床和实验室标准协会与欧盟药敏试验标准委员会的基本情况,并比较两者在兽用抗菌药物耐药判定标准制定上的差异;最后对中国兽用抗菌药物耐药性监测和耐药判定标准制定方面的成果进行分析总结。总体来说,中国在兽用抗菌药物耐药性控制方面处于稳步增长状态,已经制定的许多耐药判定标准对控制耐药性的发展具有重要意义。但仍有许多兽用抗菌药物缺乏相应的耐药判定标准,需要更多的研究者在未来找到更加快速、简便和准确的方法,不断填补、更新兽用抗菌药物的耐药判定标准。

大肠埃希菌异质性耐药的研究进展

赵艳坤, 刘慧敏, 孟璐, 王成, 王加启, 郑楠

2022, 38(9): 59-71. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0854

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大肠埃希菌（Escherichia coli）是人类和动物中常见细菌病原体,E.coli已对多种抗菌药物产生耐药,且由于抗菌药物选择压力越来越大,致使菌株的适应性和致病性更强,耐药的传播更快、定植率更高,给全球流行病学和临床治疗带来极大的挑战。近年来,E.coli的异质性耐药（heteroresistance,HR）相关研究相继被报道,异质性耐药是指细菌中的同源亚群对某种抗菌药物表现出不同的敏感性,是敏感菌进化为耐药菌的中间阶段,不同于完全耐药,异质性耐药在临床上不易及时检出,常导致临床抗菌药物治疗失败。因此,为有效防控E.coli感染及耐药的演变,深入剖析E.coli异质性耐药的流行特征及可能的机制尤为重要,本文就E.coli的异质性耐药研究进行了梳理,并对异质性耐药从表型特征、检测方法和可能的机制等方面进行了概述。旨在加强对E.coli异质性耐药的认识和研究,以期为全面了解E.coli耐药过程及发生机制、优化抗菌药物使用策略、减缓完全耐药菌种的出现提供参考。

沙门氏菌中主要毒力因子的研究进展

刘理慧, 储锦华, 隋雨欣, 陈杨, 程古月

2022, 38(9): 72-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0687

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沙门氏菌是一种最常见的食源性致病菌,是全球细菌性胃肠炎的主要病因之一。其血清型众多,目前已报道超过2 600种,不同血清型沙门氏菌对人和动物的致病性不同。其致病性与毒力因子密切相关。本文系统介绍了沙门氏菌主要的毒力因子以及各自编码的分泌系统和/或毒力基因及其功能,进一步分析了毒力基因与毒力的关系,同时讨论了全基因组测序（WGS）预测毒力水平的可行性,有助于探究沙门氏菌中各种毒力因子与宿主相互作用的机制,从基因层面上理解沙门氏菌病,在源头上控制沙门氏菌,从而为沙门氏菌病预防和治疗提供新思路。

氟喹诺酮类抗生素及耐药基因污染控制的研究进展

李柳, 穆迎春, 刘璐, 张洪玉, 徐锦华, 杨臻, 乔璐, 宋金龙

2022, 38(9): 84-95. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0497

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氟喹诺酮类抗生素属于喹诺酮类抗生素,是一类人畜通用的抗生素。近年来,被广泛应用于人类和畜牧、水产等养殖业领域,然而其大量使用,造成在环境中的不断残留和累积,给自然环境和人类健康造成了较大威胁。现有研究表明,微生物降解是有效去除氟喹诺酮类抗生素残留污染的有效方法之一。本文总结和介绍了近年来氟喹诺酮类抗生素微生物降解单株菌和混合菌群、微生物降解酶、降解途径以及微生物降解氟喹诺酮类抗生素的实际应用,并对目前氟喹诺酮类抗生素微生物降解研究中存在的问题进行了分析,以及对未来氟喹诺酮类抗生素微生物降解研究的重点进行了探讨,以期为后续的研究提供参考。

非抗生素类活性物质抗幽门螺杆菌研究进展

刘晓黎, 童真艺, 赵亮, 尹丽, 刘晨光

2022, 38(9): 96-105. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0089

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幽门螺杆菌感染与多种胃部相关疾病（如胃溃疡、胃癌等）密切相关,是一种严重威胁人类健康的全球性流行病。过去临床上主要通过三联或四联疗法治疗幽门螺杆菌感染,然而由于抗生素的长期使用,幽门螺杆菌不断产生耐药性,导致临床治愈率逐年下降。针对这一问题,近年来非抗生素类抗菌活性物质由于不易诱导耐药性而逐渐受研究者更多关注。本文综述了非抗生素类活性物质（包括植物天然产物、糖脂、多不饱和脂肪酸、抗菌肽、尿素代谢抑制剂和益生菌）在抗幽门螺杆菌感染领域的研究概况和进展,重点介绍了不同活性物质的抗菌机制（如破坏细胞膜、抗生物膜、抑制幽门螺杆菌脲酶、竞争性抑制细菌粘附和分泌细菌素等）和对宿主机体的影响（如抗炎、抑制凋亡、促进黏膜和溃疡的修复及调节消化道菌群等）,同时还比较了它们在临床上应用途径的差异。最后,提出了该领域未来需要解决的关键问题,以期为这类物质开发为药物并用于临床提供理论依据与参考。

同时产碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的猪源大肠埃希氏菌的鉴定及耐药性研究

李海利, 郎利敏, 张青娴, 游一, 朱文豪, 王治方, 张立宪, 王克领

2022, 38(9): 106-115. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0073

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为了解携带碳青霉烯酶NDM-1及其亚型在猪场的流行情况,对来自猪场产房仔猪腹泻病例分离鉴定的87株大肠杆菌进行了碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的耐药基因扩增及测序。从87株大肠杆菌中分离鉴定出一株同时携带碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的大肠埃希菌（Escherichia coli）,并命名为HN2106。为深入了解HN2106全基因组及其携带的质粒和耐药基因情况,对NH2106进行了16S rRNA菌种鉴定,bla_NDM耐药基因确认,全基因组测序,应用BLAST和MEGA软件对序列进行生物信息学分析、系统进化树分析。结果显示,该菌株含有7个质粒（plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmid F 和plasmid G）,3种类型,分别为Col、IncFII、IncQ1。同时携带NDM-1和NDM-5基因,属B族β-内酰胺酶,其中bla_NDM-1位于质粒pNDM-HN2106（plasmid C）上,bla_NDM-5位于质粒pNDM5-HN2106（plasmid B）上,分别介导bla_NDM-1和bla_NDM-5耐药基因,是耐药菌传播的重要载体。全基因组耐药基因预测HN2106同时还携带21种类型的抗生素耐药基因。对HN2106菌株进行了85种抗菌药物敏感性测试,结果显示,HN2106菌株对亚胺培南、青霉素G等均耐药,对磺胺甲恶唑、头孢美唑等敏感。研究结果表明,养殖场NDM-1耐药质粒是NDM-1及其亚型耐药基因的重要载体,对养殖产业健康养殖和公共卫生安全带来较大隐患和威胁,应加强抗菌药物的合理应用和感染的防控措施,重视细菌耐药性的监测工作,以期为临床耐药菌株感染的防治提供理论参考。

不同施肥处理农田土壤中噬菌体与细菌携带抗生素抗性基因的比较

胡雪莹, 张越, 郭雅杰, 仇天雷, 高敏, 孙兴滨, 王旭明

2022, 38(9): 116-126. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1544

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为了揭示有机肥和化肥长期施用对农田土壤噬菌体携带的抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）多样性和丰度的影响,并与土壤细菌携带的ARGs进行对比,本文将土壤抗生素抗性分为细菌和噬菌体两个部分,利用微滴数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）技术定量分析了土壤噬菌体和细菌DNA中25种ARGs亚型和I类整合子（intl1）的丰度。结果表明,土壤噬菌体中ARGs的检出率和总丰度以及intl1丰度均低于土壤细菌,其中噬菌体中检测到20种ARGs亚型,在不施肥、单施化肥和单施有机肥土壤的噬菌体中,目标ARGs的检出率分别为68%、72%和76%。土壤噬菌体中ARGs的总丰度在有机肥施用土壤中显著高于不施肥和化肥施用土壤（P<0.05）,其中多耐药类、大环内酯-林肯酰胺-链阳性菌素B（MLSB）类和β-内酰胺类抗性基因丰度占显著优势。除了β-内酰胺类抗性基因blaTEM,噬菌体中其他ARGs亚型的丰度均显著低于细菌（P<0.05）。噬菌体与细菌携带ARGs在不同施肥处理中均存在显著正相关（P<0.05）。冗余分析结果显示,施肥可能通过改变土壤pH、重金属和营养因子水平来影响细菌和噬菌体中ARGs的赋存特征。本研究结果表明,噬菌体是除细菌之外的农田土壤另一个重要ARGs储存库,施用有机肥能同时显著提高土壤细菌和噬菌体中ARGs的多样性和丰度。

一株新的多重耐药福氏志贺菌噬菌体生物学特性及基因组分析

文畅, 刘晨, 卢诗韵, 许忠兵, 艾超凡, 廖汉鹏, 周顺桂

2022, 38(9): 127-135. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1549

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抗生素的大量使用和滥用造成细菌耐药性问题愈发严峻,噬菌体疗法作为一种精准治疗多重耐药病原菌的有效方法开始被人们日益重视。采用双层琼脂平板法从活性污泥中分离出多重耐药福氏志贺菌（Shigella flexneri）噬菌体P003,鉴定为肌尾噬菌体科（Myoviridae）。通过生物学特性测定表明P003的最佳感染复数为10,潜伏期约10 min;在4-70℃、pH 3.0-10.0的条件下保持活性。全基因组测序表明,噬菌体基因组长约68 721 bp,GC含量46.14%,预测编码99个开放阅读框（open reading frame,ORF）,未发现已知耐药基因和毒力基因。全基因组多序列线性与进化树分析结果表明,P003与大肠杆菌噬菌体有较近的亲缘关系,但不能侵染大肠杆菌。从活性污泥原位分离到一株新的多重耐药福氏志贺菌噬菌体P003,为利用噬菌体疗法防治多重耐药病原菌S. flexneri感染提供了新的菌种资源。

无色杆菌77的基因组构成及其趋化和耐药特性

李霁虹, 荆玉玲, 马桂珍, 郭荣君, 李世东

2022, 38(9): 136-146. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0112

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无色杆菌77（Achromobacter sp. 77）是黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum,Foc）菌丝际优势细菌,可随Foc菌丝迁移且状态活跃。为明确菌株77在Foc菌丝际的定殖机理,本研究在分析菌株77全基因组构成基础上,研究了其趋化特性和耐药性。Illumina Hiseq+PacBio测序分析表明,菌株77基因组全长5 868 070 bp,仅含1条染色体,GC含量为65.89%。在KEGG、COG和GO数据库分别注释到2 696、4 862和4 212个基因。菌株77基因组中含mcp、che、mot等重要趋化基因;通过CARD数据库注释,发现含有drr、emr等抗生素耐药外排泵基因、抗生素耐药基因簇以及多种抗生素的抗性基因。抗生素敏感性实验表明,菌株77对浓度低于300 µg/mL的氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素以及浓度低于50 µg/mL的四环素均有抗性,是一株多重耐药菌株。采用改良的游动平板法测定菌株77的趋化特性,结果表明,菌株77对1 mmol/L对羟基苯乙酸、水杨酸、α-酮戊二酸、延胡索酸、琥珀酸、苹果酸等多种根分泌物和真菌分泌物组分具有明显的趋化响应;0.5 mmol/L的上述化合物和0.5-1 mmol/L的镰刀菌酸可促进菌株77的生长。上述研究结果说明菌株77对根分泌物或真菌分泌物具有趋化和利用能力,是连作条件下无色杆菌属细菌在枯萎病菌菌丝际丰度升高的重要原因。

ε-聚赖氨酸对阪崎克罗诺杆菌细胞结构与生物被膜形成的影响

石成龙, 汪锡武, 李安琪, 钱森和, 王洲, 赵世光, 刘艳, 薛正莲

2022, 38(9): 147-157. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0396

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ε-聚赖氨酸（ε-polylysine,ε-PL）作为一种抗菌活性强、安全性高、热稳定性好的阳离子型天然多肽,已作为安全的食品防腐剂受到关注。以阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）为供试菌株,揭示ε-PL的抑菌机理,为细菌耐药性和食品防腐措施研究提供理论支持。研究了ε-PL作用下对阪崎克罗诺杆菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）、细胞膜壁通透性、细胞表面疏水性及运动性等生理特性的影响,并利用透射电子显微镜对ε-PL作用下的细菌细胞形态变化进行了观察,在此基础上,探究了ε-PL对阪崎克罗诺杆菌生物被膜（biofilm,BF）的抑制和清除作用效果,并利用荧光染色显微观察清除后被膜菌通透性的改变。ε-PL对阪崎克罗诺杆菌的抑菌活性具有浓度依赖性,ε-PL对阪崎克罗诺杆菌ATCC51329的MIC为256 μg/mL。ε-PL能够增强细胞膜壁通透性,使其细胞内容物如核酸、碱性磷酸酶等大量渗出,从而表现对阪崎克罗诺杆菌的杀菌作用。同时ε-PL能够降低阪崎克罗诺杆菌的表面疏水性和运动性,进而影响阪崎克罗诺杆菌生物被膜的形成。ε-PL对阪崎克罗诺杆菌生物被膜抑制和清除的作用效果显著,结合物理振荡,可大大提高生物被膜清除效率。ε-PL能够破坏阪崎克罗诺杆菌的细胞结构,从而达到抑菌效果。ε-PL能够降低阪崎克罗诺杆菌细胞表面的疏水性、运动性,进而ε-PL能够抑制生物被膜的形成,对成熟生物被膜也具有清除作用。

水稻盐敏感突变体ss2的鉴定与基因功能分析

陈光, 李佳, 杜瑞英, 王旭

2022, 38(9): 158-166. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1444

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通过盐胁迫筛选EMS诱变的粳稻突变体库,挖掘盐逆境响应关键基因,鉴定出一个盐敏感突变体。在100 mmol/LNaCl处理下,突变体严重萎蔫,叶片褪绿黄化,地上部Na⁺的积累显著高于野生型。盐胁迫后,突变体叶片的光合速率和叶绿素含量均显著低于野生型,并且源叶中的蔗糖含量增加,而根中的蔗糖只有野生型的83%。突变体源叶中参与糖转运的几个关键基因表达下调,进一步表明糖分向库器官根系的分配受抑制。突变体库组织中较低的蔗糖含量不能满足生长发育对碳营养的需求,导致水稻耐盐性降低。通过图位克隆确定候选基因,将其命名为SS2,互补实验可以恢复突变体的盐敏感表型,盐胁迫下生长的互补转基因株系与野生型植株无显著差异。综上所述,SS2通过调控体内糖分转运,对水稻的生长和盐胁迫响应起重要作用。

核桃CONSTANS-Like基因家族全基因组鉴定及表达分析

袁星, 郭彩华, 刘金明, 亢超, 全绍文, 牛建新

2022, 38(9): 167-179. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1459

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基于核桃基因组鉴定核桃COL（CONSTANS-Like）家族成员,并对其进行分析,以揭示核桃COL家族的分子进化和潜在功能。以‘新新2号'（Juglans regia cv. Xinxin No. 2）为材料,对COL基因家族全基因组进行鉴定及生物信息分析,并分析其在不同组织及不同时间雌花芽的表达。结果表明,核桃基因组中共存在55个COL基因,不均匀地分布在16个染色体和1个Scaffold上,依次命名为JrCOL1-JrCOL55,氨基酸为117-789 aa,分子量为12.99-86.08 kD,等电点为4.00-8.94,进化树分析将其分为3个亚族,且同一分支基因的保守基序和基因结构位置相似。启动子区的顺式作用元件分析发现JrCOL基因含有大量与光信号、植物激素、胁迫等相关的顺式作用元件。‘新新2号'中JrCOL家族基因具有组织特异性表达,其中JrCO1、JrCO7a-c、JrCO8、JrCOL23、JrCO31a-c、JrCO33、JrCOL35和JrCOL50a-f在叶片中表达量最高。对‘新新2号'雌花芽不同时间JrCOL基因的RT-qPCR分析表明,JrCOL1、JrCOL35、JrCOL50a-f和JrCOL52在‘新新2号'雌花芽中,具有一致的表达趋势,其中JrCOL50a-f在‘新新2号'雌花芽分化过程中起到重要作用。在核桃基因组中鉴定出55个COL家族基因,分为3个亚家族,不均匀地分布在16个染色体和1个Scaffold上,结构进化保守,组织表达模式多样。推测JrCOL家族基因在核桃叶片发育过程中发挥重要功能。

基于PacBio三代测序的香瓜茄（人参果）基因组的组装

司诚, 钟启文, 杨世鹏

2022, 38(9): 180-190. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0344

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香瓜茄又名人参果,具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等多种生物活性。为丰富茄科作物基因组信息及进化发育历程,获取香瓜茄全基因组序列信息,同时为香瓜茄相关分子研究奠定基础。以香瓜茄植物组织为试验材料,基于Illumina HiSeq构建小片段文库进行基因组特征评估,利用PacBio三代测序技术、Hi-C技术构建及组装香瓜茄全基因组数据库。利用生物信息学方法对获得的基因组序列进行组装、功能注释以及进化分析研究。结果表明,获得54.11 Gb Illumina HiSeq数据;获得55.08 Gb PacBio数据,reads平均长度为14 179 bp;获得Hi-C数据量约143 Gb;拼接得到该基因组contig序列总长为1.16 Gb,Hi-C纠错后contig N50为22.63 Mb;Hi-C挂载染色体,共有1.12 Gb长度的序列可以挂载到12条染色体上,占比97.16%;其中,能够确定顺序和方向的序列长度为1.08 Gb,占定位染色体序列总长度的96.11%,得到基因组大小1.25 Gb;预测有64.22%的重复序列,41 571个基因,99.06%的基因可以注释到NR、GO、KEGG等数据库中;预测得到4 360个tRNA、5 677个rRNA、154个miRNA;得到449个假基因。香瓜茄与马铃薯的进化时间大约在12.82 MYA。

雪莲SikCDPK1启动子的克隆和活性分析

史光珍, 王兆晔, 孙琦, 朱新霞

2022, 38(9): 191-197. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0570

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旨在克隆雪莲（Saussurea involucrata）SikCDPK1 启动子并分析其活性,为进一步解析雪莲 SikCDPK1基因的转录调控机制奠定基础。通过TAIL-PCR技术从雪莲中克隆SikCDPK1启动子,利用PlantCARE分析启动子区顺式作用元件,构建全长启动子或5'端缺失启动子驱动的GUS重组表达载体 P0∷GUS、P1∷GUS、P2∷GUS和P3∷GUS,转入根癌农杆菌中进行瞬时转化试验,通过GUS组织化学染色分析不同长度启动子的活性,分别测定低温和干旱胁迫下的GUS酶活。结果显示,获得了1 042 bp的SikCDPK1启动子序列,pSikCDPK1具有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还含有多个与逆境、激素、光响应等相关的顺式作用元件。转化的烟草叶片经GUS染色之后均显蓝色,启动活性依次为P0>P1>P2>P3,低温、干旱处理后GUS酶活性发生变化。SikCDPK1启动子被成功克隆,具有驱动下游报告基因表达的活性。

马缨杜鹃Rd3GT1的克隆及对矮牵牛花色形成的影响

孙威, 张艳, 王聿晗, 徐僡, 徐小蓉, 鞠志刚

2022, 38(9): 198-206. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0510

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类黄酮3-O-糖基转移酶（3GT）是花色素苷生物合成途径末端的酶,负责将糖基供体转移至花青素的3-OH位置,在增加花色素苷的稳定性与水溶性方面发挥重要作用。研究马缨杜鹃3GT在花色素苷生物合成中的功能,为马缨杜鹃花色形成及调控研究奠定基础。运用 RT-PCR 技术克隆获得马缨杜鹃3GT基因（Rd3GT1）全长CDS序列,并对其进行生物信息学分析,再利用DNA重组技术完成植物表达载体pBI121-Rd3GT1的构建,利用农杆菌介导法对矮牵牛进行遗传转化,同时对再生植株进行转基因及表型鉴定,并完成基因表达量及花色素苷检测分析。结果表明,Rd3GT1全长CDS序列为1 395 bp,编码464个氨基酸。蛋白多序列比对和系统进化分析表明,Rd3GT1属于3GT家族成员。与野生型相比,转Rd3GT1的矮牵牛植株花色由白色变为粉色,花色素苷与黄酮醇的积累显著增加,同时多个类黄酮合成相关基因表达显著升高。综上,Rd3GT1在花色素苷合成过程中发挥重要功能,可用于其它植物花色改良研究。

一种松材线虫醛脱氢酶的基因克隆及其生化性质

李文硕, 王林松, 杜桂彩, 郭群群, 张廷婷, 杨宏, 李荣贵

2022, 38(9): 207-214. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1450

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松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是松萎蔫病的病原,可引起数十种松属树种的毁灭性破坏。通过RT-PCR 成功克隆了松材线虫体内一种醛脱氢酶基因aldh,aldh的长度为1 353 bp,编码451 个氨基酸残基,前期研究表明,杀线剂甲吡唑处理能使aldh表达水平显著上调。序列比对表明,与大多数其他醛脱氢酶中依靠半胱氨酸（Cys）残基发挥催化功能不同,aldh 编码的蛋白质保守的位置是亮氨酸（Leu）残基,但其C-端紧邻Leu残基的是组氨酸残基（His）,而不是常见的Leu残基。构建了表达载体pET-15b-aldh并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导aldh在工程菌中实现了高表达,重组醛脱氢酶通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行表征。以甲醛为底物的醛脱氢酶Km为27.87 mmol/L,最适pH值为7.5,最适温度为25℃,Fe³⁺和Ni²⁺可提高酶活性,Ca²⁺、Mn²⁺、Na⁺和K⁺可降低酶活性。重组醛脱氢酶对5种醛类化合物显示出不同的催化活性,其中香草醛是其最佳底物。该研究为深入了解醛脱氢酶在松材线虫致病过程中的作用打下了基础,也为新型工业用醛脱氢酶的研究提供了参考。

烟曲霉A-16产纤维素酶工艺优化及酶学特性

张开平, 刘燕丽, 涂绵亮, 李继伟, 吴文标

2022, 38(9): 215-225. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1507

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分离筛选高效降解稻草的菌株,研究菌株产纤维素酶工艺条件及酶学性质。采用刚果红染色法从腐败木质下的土壤中分离筛选到一株产纤维素酶菌株,结合菌株的形态特征和18S rDNA序列同源性比较进行鉴定;通过单因素试验和响应面分析法确定菌株最适产酶条件,并对纤维素酶的稳定性进行研究。分离纯化得到的菌株命名为烟曲霉（Aspergillus fumigatus A-16）;响应面实验结果表明,最优产纤维素酶工艺参数为：稻草粉添加量7 g/100 mL,pH 6.0,温度65℃,发酵时间5 d;在此最优条件下,该菌产生的羧甲基纤维素酶（CMCase）和滤纸酶（FPA）活力分别为2 954.76 U/mL和1 086.37 U/mL;其总活力较优化前提高了26.4%。该纤维素酶的适宜反应温度为70℃,适宜pH 6.0。在80℃热处理90 min条件下酶活力可保持在80%以上,说明该酶热稳定性较好。同时,在pH 5.0-7.0范围内比较稳定,放置1 d后可保持70%以上的酶活力。该研究可为利用富含纤维素的生物质原料开发洁净能源及食品级葡萄糖资源提供了基础支撑。

芘降解菌Pseudomonas sp. PR3的植物促生特性及其对芘胁迫下水稻生长的影响

高晓蓉, 丁尧, 吕军

2022, 38(9): 226-236. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0539

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农田中不断积累的多环芳烃不仅严重影响作物生长,同时增加粮食安全风险。筛选兼具促进植物生长特性和降解污染物功能的微生物菌株是解决上述问题的一种有效手段。从油田附近生长的植物根表分离得到一株具有芘降解能力,同时还具有溶磷、产吲哚乙酸和铁载体等植物促生特性的菌株PR3,经16S rDNA序列同源性分析确定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。菌株PR3在无机盐培养液中生长14 d后,对芘（20 mg/L）的降解率可达94%,对萘（50 mg/L）、菲（50 mg/L）、苯并（a）芘（10 mg/L）的降解率也分别达到92%,84%和47%。同时,该菌株7 d内最大溶磷量为756.25 mg/L,2 d内IAA合成量可达14.46 mg/L,4 d内生成铁载体的活性单位可达58.53%。在不同芘污染浓度处理下的盆栽实验表明,接种PR3可有效促进水稻生长并提高根际土壤中芘的降解,去除率可达72.02%-86.22%,同时显著降低水稻根及地上部中的芘含量,分别为21.81%-53.01%和49.81%-57.17%。因此,菌株PR3有助于实现芘污染土壤的生态修复以及降低作物芘暴露的风险。

两株PGPR菌株的花生定殖及对根际细菌群落结构的影响

李颖, 龙长梅, 蒋标, 韩丽珍

2022, 38(9): 237-247. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1577

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为探讨2株根际促生菌耐酪氨酸束村氏菌P9和吡咯伯克霍尔德氏菌P10对花生的促生机制。利用GFP及利福平对2个菌株进行标记、结合扫描电镜观察,追踪了2株PGPR菌株在花生组织中的定殖动态;并通过16S rRNA全长测序对菌株接种花生根际土壤的细菌多样性进行分析。结果表明,利福平标记的P9和P10菌株具有良好的遗传稳定性,其生长和促生特性与原始菌株基本一致。GFP标记菌株可在花生的根尖及其分生区定殖;利福平标记菌株可稳定定殖在土壤及花生的根、茎部,且接菌30 d后定殖数仍保持在10⁴CFU/g数量级。与未接菌植株根际土壤相比,P9、P10及混合菌株接种组的细菌群落相似性更高;接菌组的Flavihumibacter、unidentified_Rhizobiaceae的相对丰度显著增加,芽孢杆菌属、链霉菌属等的丰度较CK有不同程度增加,溶杆菌属、无色杆菌属及假黄单胞菌属等的丰度降低。2株PGPR菌株均可通过直接定殖在植株组织中、间接影响土壤细菌群落结构而发挥对花生的促生作用,混合菌株接种效果更优。研究结果明析了2株促生菌的促生机制,并为菌株的应用提供了科学依据。

玉米小曲酒糟发酵饲料对育肥猪肠道菌群的影响

王松, 简晓平, 潘婉舒, 张永光, 王涛, 游玲

2022, 38(9): 248-257. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0273

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旨在研究玉米小曲酒糟全价发酵饲料对育肥猪肠道菌群的影响。以常规饲料为对照,比较发酵饲料对育肥猪增重,以及肠道菌群多样性、种属构成及功能的影响。饲喂47 d后,发酵饲料对育肥猪增重及猪肉水分含量、肌内脂肪、pH无显著影响（P >0.05）。从育肥猪肠道菌群看,小肠中的伯克氏菌属（Burkholderia）在群体中的丰度从2.6%增加至50.0%,罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、草螺菌属（Herbaspirillum）、乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）的丰度等也有明显增加,而布劳特氏菌属（Blautia）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、芽殖菌属（Gemmiger）、梭菌属（Clostridium）、巨型球菌属（Macrococcus）丰度明显下降。KEGG分析发现,发酵饲料对育肥猪肠道菌群生态系统功能的影响主要在于物质代谢的相对增强及细菌增殖的相对减少,促进小肠内物质转化。本研究为玉米小曲酒糟全价发酵饲料的在生猪养殖中的推广应用提供了科学依据。

原花青素对体外培养绵羊卵泡颗粒细胞增殖的影响

杨小峰, 秦小伟, 郭泽媛, 吕丽华

2022, 38(9): 258-263. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1177

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旨在研究原花青素对体外培养绵羊卵泡颗粒细胞增殖的影响。不同浓度梯度（20、30、40、50、60、70和80 μg/mL）原花青素的完全培养基中培养绵羊卵泡颗粒细胞,培养时间分别为24、48和72 h,通过MTT法测定颗粒细胞的增殖率;通过RT-qPCR法检测细胞周期相关基因p21、p27和细胞凋亡相关基因caspase-8的表达。结果表明,培养48 h,在原花青素浓度为50 μg/mL时,颗粒细胞的增殖率最高,细胞周期相关基因p21、p27和细胞凋亡相关基因caspase-8这3个基因的表达量均显著降低（P<0.01）。综上所述,原花青素对体外培养绵羊卵泡颗粒细胞有一定的促进增殖效应,并且在相关基因mRNA水平上得到验证。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

胡海洋, 应婉琴, 何军, 吕芷贤, 谢小平, 邓仲良

2022, 38(9): 264-270. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1529

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利用酶促重组等温扩增（enzymatic recombinase amplification,ERA）技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10³ copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。

畜禽养殖粪污中典型致病菌的三重微滴式数字PCR定量检测方法的建立

程深伟, 张克强, 梁军锋, 刘福元, 郜兴亮, 杜连柱

2022, 38(9): 271-280. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0944

摘要 ( 344 )

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为精准、快速检测畜禽养殖粪污中典型致病微生物,减少人畜共患病的传播风险,以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌（O157：H7）和肠炎沙门氏菌3种常见致病菌为研究对象,通过筛选其特异性引物与探针、优化反应系统,建立起快速、稳定的多重微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）反应体系。通过检测不同菌株验证该体系的特异性,并确定畜禽养殖废弃物致病菌的检出限,开发出多重微滴数字PCR快速检测方法。研究结果表明,各对引物探针对目标菌株均能扩增,ddPCR体系内未出现交叉反应,检测肠炎沙门氏菌的绝对定量检测低限为0.68 copies/µL;检测金黄色葡萄球菌的绝对定量检测低限为0.79 copies/µL;检测大肠埃希氏菌的绝对定量检测低限为1.02 copies/µL。研究建立的方法可实现对畜禽养殖粪污中3种典型致病菌的高效率、高精度的检测。

2022, 38(9): 281-281.

摘要 ( 101 )

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