目的 人类线粒体DNA突变与多种疾病相关，但其全长序列在原核宿主中不稳定，体外制备大片段环状DNA也较困难，亟需一套新策略来高效制备环状全长线粒体DNA，以突破线粒体遗传操作的关键技术瓶颈。 方法 首先，为有效克服传统原核克隆系统的宿主毒性问题，利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）高效的同源重组系统将全长人线粒体基因组稳定克隆至酵母载体中；同时，通过定点编辑去除了内源的Eco RI限制性酶切位点，为克隆的mtDNA提供遗传筛选标记。随后，开发一种基于错位线性化片段的体外热循环连接新策略，以解决线性PCR产物的环化难题。该方法利用耐热连接酶在变性-复性循环中驱动异源双链黏性末端的形成，从而实现长片段DNA的高效环化。 结果 利用该策略成功制备了大小为16.6 kb的全长人线粒体基因组。限制性内切酶图谱分析及外切酶抗性实验证实，合成产物为序列正确、无缺口的共价闭合环状DNA。 结论 建立的“酵母辅助编辑-体外循环组装”技术体系，不仅解决了高质量环状全长mtDNA制备的难题，也为线粒体疾病模型的构建、人工线粒体合成以及线粒体基因治疗载体的开发提供了通用的遗传操作平台。
