Separation,Purification,and Enzymatic Properties of Thermo-tolerant β-glucosidase from Tridchoderma viride

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.025

Abstract

Abstract: This study aims to separate and purify the β-glucosidase of Tridchoderma viride and to investigate its enzyme characterization. T. viride GIM3.139 was fermented in shaking flask,and the enzymatic properties of the purified β-glucosidase by centrifugal ultrafiltration and Sephadex G-200 gel chromatography were studied. Further,the separated and purified constituents were tested by PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）,and it reached the electrophoretic-purity. The results showed that the optimal reaction temperature was 80℃ and it was still in a high enzymatic activity for a long time in the range of 75-95℃;also the β-glucosidase presented a strong stability under acidic and alkaline conditions and its optimal pH value was 6.5. Some metal ions including Fe³⁺,Mg²⁺,and K⁺ inhibited the activity of β-glucosidase,among which Fe³⁺did it the most significantly. However,Fe²⁺ and Mn²⁺activated the enzyme,and Mn²⁺did it the most significantly. Organic solvents such as methanol and acetone increased the enzymatic activity,and methanol did it the most significantly. However,the ethyl acetate showed obvious inhibition effect. In conclusion,electrophoretic-purity β-glucosidase was separated and purified from T. viride and the enzymatic properties were characterized as well.

Key words: Tridchoderma viride, β-glucosidase, separation and purification, enzymatic properties

PENG Li-sha^{1, 2}, ZHANG Yong-xiang^{1, 2}, YAN Qing^{1, 2}, WANG Xiang^{1, 2}, LI Jun^{1, 2}. Separation,Purification,and Enzymatic Properties of Thermo-tolerant β-glucosidase from Tridchoderma viride[J]. Biotechnology Bulletin, 2016, 32(9): 189-196.

References

[1] 张慧芳. 混菌发酵产纤维素酶的分离纯化及其酶学性质研究[D]. 晋中：山西农业大学, 2014.
[2] Willis JD, Oppert B, Oppert C, et al. Identification, cloning, and expression of a GHF9 cellulase from Tribolium castaneum（Coleop-tera：Tenebrionidae）. [J]. Journal of Insect Physiology, 2011, 57 （2）：300-306.
[3] Percival Z, Michael EH, Jonathan RM. Outlook for cellulase improv-ement screening and selection strategies[J]. Biotechnology Advances, 2006, （24）：452-481.
[4] Himmel ME, Ruth MF, Wyman CE. Cellulase for commodity products from cellulosic biomass[J]. Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10（10）：358-64.
[5] 朱凤妹, 彭丽莎, 李军. β-葡萄糖苷酶基因克隆及在丝状真菌中高效表达的研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2014, 5（10）：3052-3058.
[6] 张静茹. 康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质[D]. 广西：广西大学, 2014.
[7] 张继泉, 王瑞明. 绿色木霉生产纤维素酶的进展[J]. 山东食品发酵, 2001（4）：12-15.
[8] 姜绪林. 绿色木霉固态发酵产纤维素酶的研究[D]. 无锡：江南大学, 2005.
[9] 白利涛, 张丽萍. 酶及蛋白质分离纯化技术研究进展[J]. 安徽农业科学, 2012, 40（14）：8018-8020.
[10] 董梅. 酒类酒球菌31MBRβ-D-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究[D]. 西安：西北农林科技大学, 2014.
[11] 杨晓东, 刘进元. 用免疫亲和层析法纯化萝卜PHGPx天然蛋白[J]. 生物化学与生物物理进展, 2005, 32（8）：794-799.
[12] 郭会灿. 双水相萃取技术及其在药物分离中的应用[J]. 河北化工, 2011, 34（8）：42-43.
[13] 齐玉, 孙波, 等. 聚乙二醇/磷酸氢二钾双水相体系萃取蛋清溶菌酶方法的建立[J]. 中国家禽, 2013, 35（5）：22-26.
[14] 刘颖, 韩春然, 张帅, 等. 绿色木霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质[J]. 食品科学, 2014, 35（5）：150-155.
[15] 张晓勇, 陈秀霞, 高向阳. 纤维素酶的蛋白质工程[J]. 纤维素科学与技术, 2006, 14（2）：55-58.
[16] 杨盛, 侯红萍. 高效降解纤维素混合菌的筛选及其产酶条件的研究[J]. 中国酿造, 2008（21）：20-23.
[17] Gunasekaran K, Nussinov R. How different are structurally flexible and rigid binding sites? Sequence and structural features discriminating proteins that do and do not undergo conformational change upon ligand binding[J]. Journal of Molecular Biology, 2007, 365（1）：257-273.
[18] 崔乐芳. 产β-葡萄糖苷酶菌株诱变选育及酶的分离纯化[D]. 大连：大连理工大学, 2013.
[19] 马腾. 高产耐热β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株选育及其基因克隆[D]. 秦皇岛：河北科技师范学院, 2012.
[20] 宋晓青. 蜡梅花β-葡萄糖苷酶的活性分析、分离纯化与性质的初步研究[D]. 武汉：华中农业大学, 2005.
[21] Kengen SW, Luesink EJ, Stams AJ, et al. Purification and characterization of an extremely thermostable beta-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus[J]. European Journal of Biochemistry, 1993, 213（1）：305-312.
[22] 常军, 周斌, 胡娜. 黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 安徽农业科, 2011, 39（19）：11374-11376.
[23] Michlmayr H, Schümann C, da Silva NM, et al. Isolation and basic characterization of a beta-glucosidase from a strain of Lactobacillus brevis isolated from a malolactic starter culture[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108（2）：550-559.
[24] 张玉梅. 绿色木霉β-葡萄糖苷酶的酶学性质及其基因的体外扩增[D]. 秦皇岛：河北科技师范学院, 2014.
[25] 刘畅, 李军, 等. 黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育[J]. 河北科技师范学院学报, 2012, 26（1）：72-76.
[26] 甘淋, 李娟, 何涛, 等. 几种蛋白质含量测定方法的比较研究[J]. 泸州医学院学报, 2004, 27（6）：500-502.
[27] 刁金山, 陈振, 王丽, 等. 黑曲霉诱变菌株产β-葡萄糖苷酶的酶学性质以及分离纯化的初步研究[C]. 第六届全国化学工程与生物化工年会, 2010.
[28] 王剑锋, 陈今朝, 等. 黑曲霉水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质[J]. 菌物学报, 2010, 29（5）：683-690.
[29] 常军, 周斌, 胡娜. 黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 安徽农业科学, 2011, 39（19）：11374-11376.
[30] 侯红萍, 杨盛. 黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 酿酒科技, 2014, （8）：25-28.
[31] 徐星, 肖华, 等. 黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究[J]. 天津科技大学学报, 2015, 30（5）：15-19.
[32] 章建国, 余顺火, 李先祥, 等. 两步法生产栀子蓝色素工艺条件的研究[J]. 食品科学, 2008, 29（11）：186 -188.
[33] 张慧, 邱日永, 刘明杰, 等. 极耐热性β-葡萄糖苷酶基因克隆、超量表达及其在天然蓝色素工业化生产中的应用[J]. 江苏农业科学, 2013, 41（7）：19-22.
[34] 李斌. （一）耐热β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达、纯化、性质分析和低乳糖巴氏牛奶的生产工艺研究（二）Dihydro-CDDO-trifluoroethyl amide通过靶向激活Nrf2负性调节LPS诱导的炎症反应[D]. 济南：山东大学, 2014.
[35] 邹争争. 耐热β -葡萄糖苷酶的基因挖掘和催化性能研究[D]. 上海：华东理工大学, 2012.
[36] 张梁, 洪剑辉, 石贵阳, 等. 在 GPD1 中整合表达 bglII 基因改善酒精发酵[J]. 微生物学通报, 2006, 33（4）：15-20.
[37] 廖德芳. 耐热β -葡萄糖苷酶细菌的筛选、基因的克隆与表达[D]. 无锡：江南大学, 2010.
[38] 李淑彬, 陆广欣, 林如妹, 等. 嗜热菌—工业用酶的新来源[J]. 中国生物工程杂志, 2003, 23（7）：67-71.
[39] Hong MR, Kim YS, Park CS, et al. Characterization of a recombi- nant β-glucosidase from the thermophilic bacterium Caldicellulosi-ruptor saccharolyticus[J]. Journal of Bioscience and Bioengine-ering, 2009, 108（1）：36-40.
[40] 陈卫红, 李多川. 嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析[J]. 应用于环境生物学报, 2009, 15（4）：549-553.