当期目录

2016年 第32卷 第4期    刊出日期：2016-04-25

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综述与专论

辣椒胞质雄性不育及其育性恢复研究进展

魏兵强,张淼,王兰兰,陈灵芝,张茹,侯栋,张建农

2016, 32(4):  1-5.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.001

摘要 ( 271 )   HTML   PDF (1049KB) ( 503 )  

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利用植物胞质雄性不育系生产杂交种子，不仅无需人工去雄，还能降低制种成本、确保杂交种子纯度，是植物杂种优势利用的重要途径。简要综述了辣椒雄性的败育时期、能量代谢、物质差异、激素变化，并分别从遗传分析、QTL定位和分子生物学等方面综述了辣椒胞质雄性不育及其育性恢复的机理。

植物MicroRNA介导的基因调控在作物改良中的应用潜能

刘伟灿,周永刚,王兴超,王法微,王南,董园园,李晓薇,李海燕

2016, 32(4):  6-15.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.001

摘要 ( 275 )   HTML   PDF (1597KB) ( 899 )  

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植物MicroRNAs（miRNAs）是长度约22个核苷酸的內源、单链、非编码、小分子RNA，通过降解或抑制靶mRNA介导转录后沉默。随着高通量测序技术及各种研究技术的进步，越来越多的microRNA被测序和验证，为利用基因工程手段进行作物改良提供了丰富的候选基因资源。综述了miRNAs在生物胁迫、非生物胁迫和植物生长发育等方面的最新研究进展，同时分析了miRNAs介导的基因调控在作物改良中的应用潜能，并介绍了几种基于miRNA作用机制的植物基因工程改良作物的转基因新技术，如靶基因RNAi，人工miRNAs（amiRNAs），Target Mimics（TM），超表达miRNA-resistant tagerts；也讨论了基于miRNA作用机制的转基因技术所面临的风险和挑战。

植物DNA甲基化与基因表达的关联性研究进展

赵倩,王巍,孙野青

2016, 32(4):  16-23.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.002

摘要 ( 276 )   HTML   PDF (1271KB) ( 1201 )  

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DNA甲基化是真核生物基因组最重要的修饰方式之一。就植物DNA甲基化模式、建立、维持机制及其特征进行了综述，并且着重解释了植物DNA甲基化影响基因表达的机制。总结了在胁迫环境下单基因甲基化状态发生改变对于基因表达的影响，并对当前利用高通量测序技术分析植物全基因组范围内DNA甲基化与基因表达的关联分析研究进行综述。

真菌漆酶的性质、生产及应用研究进展

刘家扬,焦国宝,有小娟,廖祥儒,孙利鹏

2016, 32(4):  24-33.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.003

摘要 ( 308 )   HTML   PDF (1476KB) ( 1400 )  

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作为一种含铜的多酚氧化酶，真菌漆酶比细菌漆酶、植物漆酶等具有更好的热稳定性、金属离子耐受性及更高的底物催化氧化性，在工农业及环境领域的应用中得到了较高的关注。目前普遍认为，限制漆酶广泛应用的因素在于漆酶的生产规模、成本与性质。真菌漆酶的生产模式包括固态发酵和液体发酵，工业生产基本以液体发酵为主。除了在染料脱色、染织废水处理、纸浆漂白等过程中的应用，最新的研究不断拓展了漆酶新的用途，对近年来真菌漆酶的发酵生产、酶学性质及应用研究中的最新结果进行了概述。

诱导多能干细胞在血液系统疾病中的研究进展

范荻,孙筱放

2016, 32(4):  34-38.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.004

摘要 ( 190 )   HTML   PDF (1064KB) ( 515 )  

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造血干细胞移植（hemopoietic stem cell transplantation，HSCT）用于血液系统疾病的治疗已取得迅猛发展。但由于供体有限及配型效率不高等问题，严重阻碍了其在临床上的广泛应用。因此，人们迫切地寻求更为安全、经济和有效的造血干细胞的资源。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）在体外可被诱导分化为多种细胞，其中对体外诱导分化为造血干细胞的研究尤为深入。该文就iPS细胞在体外定向分化为造血干细胞及移植研究的最新进展作一综述。

技术与方法

高选择性和高灵敏度的microRNA检测技术的研究进展

陈珍珠,李蕊,田飞,沈彦婷,葛芹玉

2016, 32(4):  39-47.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.005

摘要 ( 228 )   HTML   PDF (1763KB) ( 867 )  

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microRNA（miRNA）是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，在多种细胞过程中起重要的调节作用，如细胞发育、脂肪代谢、器官生成、细胞分化及细胞凋亡等。研究表明，miRNA的表达水平变化与肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生发展密切相关，因此对于miRNA表达水平进行准确快速的检测是对其进行深入研究的前提。目前miRNA的检测分析技术众多，但是对于miRNA多态性和突变的检测技术还不甚成熟，而且生物样本中微量miRNA检测技术的灵敏度亦需要进一步的发展与突破。就近年来miRNA的高选择性和高灵敏度的检测方法进行了综述，旨为相关的检测技术进一步研究提供重要帮助。

适配体在食源性致病菌检测中的应用进展

解沛燕,朱龙佼,许文涛

2016, 32(4):  48-62.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.006

摘要 ( 271 )   HTML   PDF (3152KB) ( 923 )  

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适配体建立在仿生学基础上，是在体外从单链核酸随机序列库中筛选出的对某种靶物质具有高亲和度的寡聚核苷酸（DNA或RNA）片段。相较于食源性致病菌的常规检测手段，适配体具备特异性强、稳定性好及易于修饰等优点，因此在该领域得到了关注和应用。但前人对适配体与靶物质结合的原理认识尚不够深入，对食源性致病菌的适配体筛选及应用总结还存在许多不足。结合食源性致病菌的自身结构特点，介绍了该类物质的适配体筛选特点和检测领域中的最新研究进展，提出了目前存在的问题及发展趋势。

含双酚A废水植物修复技术研究进展

王琳,隋春晓,王晋

2016, 32(4):  63-67.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.007

摘要 ( 208 )   HTML   PDF (1094KB) ( 341 )  

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

双酚A作为一种重要的生产原料，近几十年，在环境中的含量剧增。双酚A是一种内分泌干扰激素类物质，环境激素类物质能够模拟、强化和抑制激素作用，在某些情况下，引发组织或者器官增生和肿瘤。植物修复技术是近年来发展起来的一种环境污染修复技术，是生物修复领域的一个热点。在阅读大量文献的基础上，对修复双酚A植物的筛选进行了概括，从植物糖基化修饰效应、根系分泌酶催化降解、植物根际与微生物联合代谢作用三个方面阐述植物修复双酚A的主要机理，对国内外近年来植物修复技术在含双酚A废水修复中的应用、研究成果进行了综述，并对今后的该领域的研究进行了展望，旨在为双酚A废水的植物修复技术提供参考和借鉴。

普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化

席海秀,艾可筠,佟少明

2016, 32(4):  68-73.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.008

摘要 ( 270 )   HTML   PDF (1599KB) ( 912 )  

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

以7日龄小麦幼苗的叶肉细胞为材料，采用正交试验分析了纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解时间、甘露醇浓度对原生质体分离时的产量和活力的影响；采用瞬时表达技术通过PEG-Ca2+介导法转化小麦的原生质体，分析了PEG浓度对转化效率的影响。结果表明，小麦叶片原生质体分离的最佳条件为纤维素酶1.5%，离析酶 0.75%，甘露醇0.4 mol/L，酶解时间3 h，得到的原生质体的产量可达到7.2×106个/g·FW，活力超过95%；瞬时表达实验结果表明，在25% PEG浓度下，小麦原生质体的转化效率最高。

莲藕根尖染色体制片与免疫荧光染色技术的优化

王海燕,朱之轩,金晶,丁毅

2016, 32(4):  74-79.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.009

摘要 ( 278 )   HTML   PDF (1894KB) ( 502 )  

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在细胞遗传学研究中，莲藕根尖染色体制片比较困难，研究了莲藕根尖染色体制片过程中适宜取材的根尖长度、有丝分裂指数、预处理试剂和处理时间、固定时间、酶解与低渗时间等相关因素，并对莲制片进行了免疫荧光染色。结果表明：根尖长为1.5 cm左右时有丝分裂指数最高，预处理采用冰水冷冻处理24 h分裂相较多，染色体形态清晰；用4%多聚甲醛固定1h，染色体形态较好；采用2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶混合液37℃消化30 min，酶解较彻底，细胞质残留少，染色体分散良好；1×PBS低渗30 min，染色体形态较好；免疫荧光染色后经检测可观察到较强的信号。

研究报告

海岛棉GbHCT基因克隆及生物信息学分析

崔雪,加得拉·吐留汗,于月华,陈全家,申丽婕,叶佳丽,杨飓立,陶顺,倪志勇

2016, 32(4):  80-86.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.010

摘要 ( 215 )   HTML   PDF (3201KB) ( 572 )  

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克隆海岛棉木质素合成关键酶基因GbHCT全长cDNA序列，分析其在纤维不同发育时期的表达情况。根据海岛棉转录组数据中的HCT序列设计引物，采用RT-PCR技术克隆基因，通过生物信息学方法分析GbHCT的cDNA序列和氨基酸序列。通过分析转录组数据研究GbHCT在纤维不同发育时期的表达。从海岛棉中克隆了1个编码HCT的基因GbHCT，开放阅读框长度为1 311 bp，编码436个氨基酸，蛋白质分子量为48.58 kD，等电点为6.03。GbHCT氨基酸序列中含有HTLGD和DFGWG 2个保守基序。GbHCT氨基酸与陆地棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉HCT一致性较高，与其他植物中的HCT氨基酸的一致性为55.7%-60.7%。转录组数据分析发现GbHCT在纤维不同发育阶段都有表达，在5 DPA的纤维中表达量最高，表明该基因可能参与棉花纤维的发育。

三个绵羊群体MC4R基因多态性及生物信息学分析

刘娇娇,马友记

2016, 32(4):  87-93.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.011

摘要 ( 257 )   HTML   PDF (2293KB) ( 396 )  

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旨在探讨绵羊黑素皮质素受体-4（melanocortin-4 receptor，MC4R）的分子机理，采用PCR-SSCP方法对3个绵羊群体（甘肃肉用绵羊新品种群、小尾寒羊和湖羊）的MC4R基因外显子进行多态性检测和生物信息学分析。结果表明，3个绵羊群体均存在3种基因型AA型、AB型和BB型，优势基因型为BB，其中优势等位基因为B；测序结果表明，野生型BB型和突变型AB型相比，AB型个体在该基因编码区第511位点发生G→A突变，第495位发生C→T突变；AA型个体在该基因编码区第511位点发生G→A突变，出现AA的纯合，第495位发生C→T突变，出现CC纯合；3个绵羊群体中小尾寒羊的多态信息含量属于中度多态（0.25

三疣梭子蟹nm23基因克隆及在卵巢发育中的表达分析

徐晴,朱冬发,谢熙,邱锡尔,沈锡权,

2016, 32(4):  94-101.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.012

摘要 ( 181 )   HTML   PDF (2291KB) ( 297 )  

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Nm23基因编码的核苷二磷酸激酶（NDPK）参与调控生物体的多项生理功能，包括生长、发育、分化和肿瘤转移等。根据三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）转录组数据库中的nm23同源序列，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）首次克隆获得了三疣梭子蟹nm23基因的全长cDNA序列（GenBank登录号：KP027331）。该序列全长777 bp，编码一个151个氨基酸的蛋白，该蛋白包含一个典型的核苷二磷酸激酶（NDPK）区域，具有NDPK活性位点和多肽结合位点。推导的氨基酸序列与已知甲壳动物的nm23一致性达到90%以上，与脊椎动物第一类nm23的一致性也达到70%以上。系统进化树分析发现第一类nm23与第二类nm23分别聚为一支，甲壳动物nm23属于第一类，且与nm23-1和nm23-2亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析了三疣梭子蟹nm23的组织差异表达及其在卵巢发育过程中的表达水平变化，结果表明nm23在三疣梭子蟹各组织内均有表达，其表达水平在眼柄、肌肉和Y器中最高，卵巢和肝胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢发育过程中，卵巢中nm23的表达水平在Ⅰ期最高，之后随着卵巢发育的进行，其表达水平逐渐下降，并在成熟期降至最低，这表明nm23可能参与调控三疣梭子蟹的卵巢发育。

花生温度诱导载脂蛋白基因AhTIL1的克隆和表达研究

钟瑞春,李婷婷,唐荣华,王兴军,李翠,侯蕾,赵传志

2016, 32(4):  102-109.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.013

摘要 ( 236 )   HTML   PDF (2407KB) ( 446 )  

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温度诱导的载脂蛋白（temperature induced lipocalins，TILs）与植物在热、冷、光、氧化等胁迫下的稳定性相关，旨在克隆花生中的温度诱导的载脂蛋白基因，分析其在响应低温、高温中的作用。从花生cDNA文库中筛选到一个TIL候选基因，命名为AhTIL1，通过PCR扩增获得了其基因组和候选启动子的序列，并利用实时定量PCR等方法检测了该基因在花生不同组织、种子不同发育时期和温度胁迫下的相对表达量。序列分析结果表明，该基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）为 558 bp，编码185个氨基酸。生物信息学分析显示，推测的AhTIL1蛋白质相对分子质量为21.4 kD，等电点为6.78。序列比对结果显示，该蛋白氨基酸序列同其他物种TIL蛋白显示出很高的同源性。对候选启动子预测结果表明，该基因的候选启动子包含ACE、Box4、G-box、GAG-motif等与光反应相关的调控元件以及与ABA、水杨酸、赤霉素、厌氧等相关的顺式调控元件。基因芯片和RNA-Seq结果表明，该基因在花生的根、茎、叶、花、果针、种子中均有表达，在花中表达量最高，茎中次之，在根中表达量最低；AhTIL1在果针入土后表达量下降，随着荚果的膨大和种子的成熟，AhTIL1的表达量逐渐增加。实时定量PCR结果证明，AhTIL1在高温和低温诱导3、6、12和24 h后上调表达，在48 h后表达量下降。AhTIL1可能在花生响应低温、冷胁迫中发挥着重要的作用。

盐芥TsGPX3基因的克隆、亚细胞定位与原核表达

王宁,陈静,高飞,李华云,隋欣,周宜君

2016, 32(4):  110-115.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.014

摘要 ( 219 )   HTML   PDF (1971KB) ( 353 )  

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以盐芥（Thellungiella salsuginea）为材料，获得TsGPX3的cDNA全长序列，其开放阅读框（ORF）序列长591 bp，编码196个氨基酸，具有GPXs家族的3个保守的特征结构域。系统进化分析显示，TsGPX3与同属于十字花科的萝卜RsGPX3、油菜BnGPX3和花椰菜BoGPX3等具有较高的同源性。构建植物表达载体pRTL2-TsGPX3-GFP，利用PEG转化拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达，发现TsGPX3蛋白主要定位在细胞膜上。构建原核表达载体pET-TsGPX3，采用不同浓度IPTG对转入E.coli BL21（DE3）的pET-TsGPX3进行诱导表达，获得了分子量约为27 kD的蛋白，该蛋白在37℃、诱导培养5 h时可获得较高的表达量。

野生大豆根瘤GmGS1γ基因序列分析及原核表达

杨美英,岳胜天,韩红,孙合美,刘晶晶,卢冬雪

2016, 32(4):  116-120.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.015

摘要 ( 199 )   HTML   PDF (1973KB) ( 355 )  

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旨在明确大豆谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因家族各成员的结构特点及功能。利用同源克隆的方法从野生大豆根瘤克隆GmGS1γ基因。生物信息学分析表明，ORF为1 071 bp，与大豆GS1γ（AF363022.1）部分序列的相似性为100%，与序列号为X81700.1相似性为99%。该序列具备植物GS的两个保守结构域，GS beta-Grasp功能区（17-97 aa）和GS催化功能区（103-350 aa）。系统发生树表明该基因编码的GS可能属于胞质2型同工酶。该基因可以在大肠杆菌DE3.0中表达，蛋白分子量为44 kD。

盐穗木金属硫蛋白HcMT在大肠杆菌中高效表达及金属离子结合能力的检测

孟红恩,杜荣俸,徐鑫,刘忠渊

2016, 32(4):  121-127.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.016

摘要 ( 212 )   HTML   PDF (2134KB) ( 317 )  

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旨在研究盐穗木金属硫蛋白HcMT基因原核表达情况及结合金属离子的能力。从盐穗木中克隆获得的金属硫蛋白（HcMT）基因亚克隆至pGEX-6p-2原核表达载体上，在大肠杆菌BL21中表达，分离纯化融白蛋白GST-HcMT，通过原子吸收分光光度法测定融合蛋白GST-HcMT结合金属离子的量以判断其与金属离子的结合能力。结果显示，诱导表达的融合蛋白GST-HcMT分子量在34 kD左右，与预期一致，且通过Western blot进一步得到验证；原子吸收结果表明其具有结合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的能力，融合蛋白结合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的量分别是对照的25倍、10倍、4倍和2倍，其结合能力大小为Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析

张海晨,李彩霞,王元忠,张晓东

2016, 32(4):  128-136.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.017

摘要 ( 209 )   HTML   PDF (2822KB) ( 400 )  

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旨在克隆滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因GrDXS，并进行表达分析。以滇龙胆转录组为基础，采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrDXS基因，并进行原核表达和组织特异性表达分析。滇龙胆GrDXS基因（登录号：KJ624995）全长2 145 bp，编码714个氨基酸；GrDXS蛋白相对分子质量76.75 kD，pI为6.93；属于DXS家族成员，可能定位于叶绿体；主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；具有DXS蛋白的4类保守结构域：焦磷酸硫胺素结合折叠域（IPR029061，69-425、366-555、87-268、315-407、407-558）、类转酮酶嘧啶结合结构域（IPR005475，394-559、394-555）、转酮酶C端/丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结构域II（IPR009014，568-704，572-704）、转酮酶C端结构域（IPR005476，573-696）和1个转酮酶结合位点（IPR020826，500-516）；与长春花CrDXS蛋白亲缘关系最近；GrDXS基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为100 kD，与预期蛋白大小一致；GrDXS基因主要在叶中表达。

13个中国葡萄优新品种的分子身份证构建

王慧玲,闫爱玲,孙磊,张国军,王晓玥,徐海英

2016, 32(4):  137-142.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.018

摘要 ( 182 )   HTML   PDF (1515KB) ( 388 )  

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以近年来选育的13个葡萄优新品种为试材，进行亲缘关系分析，构建分子身份证，为中国葡萄品种鉴定和新品种保护提供一定的参考。利用国际通用的9对引物对供试葡萄品种进行SSR分析，并根据引物对不同品种扩增条带分子量的大小进行赋值编码。结果表明，该9对引物在供试葡萄品种间共检测出48个等位基因，每对引物平均检测到等位基因数为5.3个；期望杂合度的范围在0.435-0.811之间；多态性信息含量变幅为0.401-0.784。同时基于SSR分析结果得到编码各异的品种分子身份证，该分子编码可以将13个葡萄品种进行有效区分。聚类分析显示13个品种根据亲缘关系远近聚为不同类别。

油梨基因组DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

周海兰,李绍鹏,李卫亮,贺军虎,包冬红,李茂富

2016, 32(4):  143-150.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.019

摘要 ( 222 )   HTML   PDF (1911KB) ( 635 )  

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

旨在建立稳定可靠的油梨（Persea americana Mill）叶片DNA的提取方法和SSR-PCR反应体系及筛选出稳定的油梨SSR多态性引物，为开展油梨种质SSR分子标记提供遗传研究的基础。以油梨叶片为试材，比较3种油梨叶片DNA提取方法；利用L16（45）正交实验设计对油梨SSR-PCR反应体系进行优化；利用优化的反应体系筛选引物；同时，选取5对多态性引物对45份油梨种质进行PCR扩增，进一步检测该优化体系的稳定性。结果表明，常规2×CTAB法、改良2×CTAB法和植物DNA提取试剂盒法等3种DNA提取方法中，改良2×CTAB法对油梨基因组DNA的提取效果最佳；获得最优反应体系为：20 μL总反应体系中，含约40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物；以此体系为基础进行引物筛选，从73对油梨SSR引物中筛选出了30对扩增条带清晰的多态性引物，说明该反应体系可用于油梨SSR标记的进一步研究；稳定性检测获得的谱带清晰，表明该优化反应体系是稳定可靠的。由此可见，改良的2×CTAB法可用于油梨叶片DNA的大量样本提取，优化后的SSR-PCR反应体系及筛选出的30对多态性引物可用于油梨SSR标记的进一步研究。

海带种质资源遗传多样性的RAPD分析

李言,刘延岭,崔翠菊,李晓捷,梁广津,彭捷,田萍萍

2016, 32(4):  151-158.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.020

摘要 ( 196 )   HTML   PDF (1794KB) ( 443 )  

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利用RAPD分子标记技术对种质库中保存的19个海带品种（系）的36个海带配子体进行了遗传多样性分析。从100条引物中筛选出16条可扩增出清晰条带的引物，在36个海带配子体中共扩增出362条DNA条带，其中多态性条带比例达99.45%。遗传相似性分析表明，这36个配子体之间的遗传相似性范围为0.682-0.978，以0.756为最低遗传相似系数，可将36个种质材料分为6个大类，UPGMA聚类分析结果表明同一品系的雌雄配子体大部分能聚在一起，品系间遗传多样性较高。

滇杨遗传多样性的SRAP分析

颜璐茜,李佳蔓,员涛,周安佩,纵丹,李旦,辛培尧,何承忠

2016, 32(4):  159-167.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.021

摘要 ( 220 )   HTML   PDF (1920KB) ( 338 )  

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采用SRAP标记分析滇杨的遗传多样性和遗传结构。用筛选出的7对引物组合分析来自7个居群共208个样本，共扩增得到条带146条，多态性条带73条，多态带百分率为50%。滇杨物种水平上的观测等位基因数（Na）为1.500 0，有效等位基因数（Ne）为1.230 9，Nei’s基因多样性指数（H）与Shannon’s信息指数（I）分别为0.136 6与0.210 0。遗传分化系数（Gst）为0.529 4，基因流（Nm）为0.444 4，表明居群间的遗传变异大于居群内，其基因交流处于中等水平。AMOVA分析也表明居群间的变异占总变异的55.61%。UPGMA、PCoA和Bayesian聚类分析结果一致，均显示丽江与曲靖居群、楚雄与昭通居群的亲缘关系较近。Mantel test结果表明滇杨居群间的遗传距离与地理距离不相关。

一株异养硝化菌的筛选及生长特性研究

郝明辉,于鲁冀,李廷梅,刘攀龙

2016, 32(4):  168-174.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.022

摘要 ( 168 )   HTML   PDF (2269KB) ( 519 )  

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从郑州市纳污河流贾鲁河中筛选出一株能高效去除氨氮的细菌，并对其生长特性进行研究。采用传统的微生物分离纯化的方法对所采集的样品进行筛选，用分子生物学的方法对菌株进行鉴定，并通过单因素实验对所选菌株的培养条件进行初步优化。结果显示，所筛选菌株为假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas sp.），命名为C2。该菌株能在有机物存在的条件下进行异养硝化作用，并快速繁殖，当接种量为10%时，培养4 h后即进入对数生长期。该菌株异养硝化的最佳接种量为3%，最适碳源为丁二酸钠，最适pH为 6-9，适宜的温度范围为25-30℃，摇床转速对氨氮的去除效果影响不大。菌株C2对氨氮的去除效果较好，对于河水中氨氮的去除具有一定的应用价值。

一株高效铁锰氧化细菌P1的分离鉴定及氧化条件优化

樊星,王淑婷,李春艳

2016, 32(4):  175-183.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.023

摘要 ( 171 )   HTML   PDF (2315KB) ( 296 )  

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利用富集培养技术从富含铁锰的地下水井淤泥中分离得到1株能够氧化铁锰的细菌，命名为P1。经形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，将菌株P1鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。利用单因素实验探讨菌株P1的生长及氧化特性；采用响应面分析方法考察接种量、温度、pH值3个因素对菌株P1氧化特性的影响，进一步优化菌株的氧化条件。结果表明，菌株P1的最佳氧化条件：温度28.54℃，pH7.23，接种量4.35%。在此条件下，菌株P1在锰含量为200 mg/L、铁含量为800 mg/L的选择性培养液中培养3 d后，锰氧化率达 93%以上，铁氧化率达100%。

红提葡萄内生细菌的分离鉴定及灰霉病拮抗菌的筛选

周泠璇,刘娅

2016, 32(4):  184-189.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.024

摘要 ( 186 )   HTML   PDF (1672KB) ( 514 )  

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旨在从新疆红提葡萄的不同部位中，分离筛选出对葡萄灰霉病具有较强拮抗作用的内生细菌。采用组织分离法对红提葡萄不同部位的内生细菌进行分离，同时进行16S rDNA序列测定及同源性分析，并采用平板对峙法和滤纸片法进行筛选，研究其对葡萄灰霉菌的抑制作用。结果表明，在分离得到的18株内生细菌中，有5株具有良好的拮抗效果，分别为NR4-1、NR5-1、NG4-1、NP1-1和PG1，抑菌率可达68.7%。

大肠杆菌氮代谢调节蛋白GlnG与固氮施氏假单胞菌氮代谢调节蛋白NtrC的功能互补研究

柯琪,陈清华,战嵛华,陆伟,燕永亮

2016, 32(4):  190-197.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.025

摘要 ( 202 )   HTML   PDF (2235KB) ( 790 )  

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旨在围绕大肠杆菌DH10B（Escherichia coli DH10B）中氮代谢调节蛋白GlnG与施氏假单胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）中氮代谢调节蛋白NtrC在一般氮代谢调控网络中是否存在功能互补展开研究。利用DH10B菌的glnG基因回补A1501菌的ntrC突变株，以及A1501菌的ntrC基因回补DH10B菌的glnG突变株，对所获得的功能互补株分别展开生理生化表型测定。结果表明，在以硝酸钾或尿素为唯一氮源的培养条件下，DH10B glnG基因可以回补A1501 ntrC突变株的氮源利用能力，并且部分恢复ntrC突变株的固氮酶活性（约为野生型A1501固氮酶活性的45%）；与DH10B glnG突变株相比，A1501菌的ntrC基因回补了DH10B glnG突变株以精氨酸为唯一氮源的生长能力。以上结果说明DH10B菌的GlnG蛋白与A1501菌的NtrC蛋白不仅在进化关系上紧密联系而且在所测试的氮代谢途径中存在功能互补。

阿扎霉素F产生菌链霉菌211726基因转移系统的建立

马艳玲,刘富来,张敏,孙宇辉,洪葵

2016, 32(4):  198-202.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.026

摘要 ( 226 )   HTML   PDF (1279KB) ( 752 )  

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旨在建立阿扎霉素F产生菌链霉菌211726的基因转移系统，以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。以整合型质粒pSET152和pIB139为出发质粒，通过接合转移构建了阿扎霉素F产生菌链霉菌211726的基因转移系统。结果显示25μg/mL阿泊拉霉素可有效筛选接合子。经PCR验证，质粒成功整合到菌株链霉菌211726基因组中，接合子经多次传代后，导入的质粒 pSET152和pIB139仍稳定整合于接合子基因组上。

Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因无痕敲除方法的建立

毛灵琪,李存治,闫达中

2016, 32(4):  203-209.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.027

摘要 ( 216 )   HTML   PDF (3409KB) ( 543 )  

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旨在建立一种适合环己胺降解菌NyZ12基因无痕敲除的可靠方法。通过overlapping PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pEX18km上，将重组质粒转化到大肠杆菌S17 pir中，再通过接合转移到假单胞菌NyZ12菌株内，经pEX18km质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株并通过PCR方法和测序鉴定。结果显示，成功构建了假单胞菌NyZ12菌株orf4637的基因突变株（NyZ12Δ4637）。通过自杀载体同源重组可以成功获得敲除的无痕突变株，且突变株基因组上没有任何抗性筛选标记残留，为环己胺降解菌NyZ12基因功能研究提供了可靠的基因敲除技术。

稳态和时间分辨荧光光谱法检测pBR322质粒中十字形结构

夏岚,张旭，

2016, 32(4):  210-216.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.028

摘要 ( 195 )   HTML   PDF (2509KB) ( 428 )  

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在目的DNA不被酶切成不同片段的情况下，应用光谱方法探测pBR322质粒中十字形结构DNA的形成。吡咯脱氧胞苷（Pyrrolo deoxycytidine，PdC）取代dC掺入到pBR322质粒的特定位点（3 195，3 222或3 281位点）。应用稳态和时间分辨荧光法研究十字形结构DNA的形成。结果显示：（1）稳态荧光特性表明，当PdC掺入到pBR322质粒的3 222位点，PdC-pBR322超螺旋荧光强度大约是松弛型PdC-pBR322的4倍；与此同时，其时间分辨荧光寿命大约比松弛型PdC-pBR322长约0.3 ns。当PdC掺入到3195或3281位点时，稳态荧光光谱和荧光寿命（两位点处约1.42 ns）并没有显著变化。（2）随着盐浓度的增大，荧光寿命略微有变化，但不是很明显。通过检测和分析pBR322质粒的荧光光谱和荧光寿命，表明能够形成在非配对环状部分3222位点含有dC的十字形结构。在一定的盐浓度（0-100 mmol/L）条件下，十字形结构能够保持其稳定性。

一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析

王海娟,戴雨珂,苏森森,王英,潘渠

2016, 32(4):  217-221.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.029

摘要 ( 157 )   HTML   PDF (1888KB) ( 498 )  

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从融合魏斯氏菌（WeissellaconfusaQJ012）中发现一个隐蔽质粒（pQJ012），测序结果显示该质粒大小为1489bp，碱基G+C含量为42.8%。BLAST结果显示该质粒的核苷酸序列同pJY33和pKLCA的同源性分别为93%、92%。ORF1编码一个282个氨基酸残基的复制蛋白（Rep），其氨基酸序列与质粒pJY33和pKLCA的同源性分别为91%、85%。根据复制蛋白、dso和sso的序列特征，推定pQJ012的复制方式为滚环复制，是滚环复制pT181家族成员。质粒pQJ012可能构建为良好的表达载体。

合成多肽对结核分枝杆菌的胞内抑制作用

陈吉,殷玉和,李玲玲,金浩,唐铭一,吴丛梅

2016, 32(4):  222-227.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.030

摘要 ( 179 )   HTML   PDF (1844KB) ( 515 )  

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评价合成多肽对人白血病单核巨噬细胞THP-1的毒性和对结核分枝杆菌H37Rv的胞内抑菌作用。 通过多肽的不同给药浓度，确定多肽对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度（MIC），利用流式细胞术方法和MTT法检测2号肽对细胞THP-1的毒性作用，同时采用CFU方法检测其对H37Rv菌株的胞内抑菌作用。筛选的4条多肽均有抑菌作用，其中2号肽的最小抑菌浓度（MIC）最小，为200 μg/mL。2号肽与细胞THP-1作用时，浓度为1 200 μg/mL时表现出细胞毒性，与 INH细胞毒性无显著差别。对于胞内H37Rv，2号肽抗结核作用具有时间和剂量依赖效应，随给药时间和剂量的增加H37Rv菌落数明显下降。2号肽不仅对巨噬细胞THP-1的毒性小，而且具有较好的抗胞内结核分枝杆菌活性，是一种潜在的抗结核新型药物。

Mecp2在斑马鱼胚胎神经发育中对NOTCH信号通路的调控

何丽番,高海

2016, 32(4):  228-233.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.031

摘要 ( 189 )   HTML   PDF (2556KB) ( 299 )  

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旨在探讨Mecp2在斑马鱼胚胎神经发育过程中的调控及机制。利用Notch转基因鱼，通过原位杂交技术和激光共聚焦显微技术发现Mecp2在胚胎发育过程前期广泛表达，随后逐渐表达在脑部。在敲低Mecp2的胚胎中，Notch信号的表达明显降低，注射Mecp2-RNA和胞内NICD-RNA均能够恢复这种表型，标记神经成熟的神经因子Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map和RNA结合蛋白HUC表达下调。在敲低Mecp2后其靶分子转录抑制因子Hey2表达下调，敲低Mecp2阻碍了神经细胞的正常分化成熟，结果表明Mecp2能够通过Notch-Hey2信号通路来调控斑马鱼神经细胞的分化。

PTEN mRNA编辑的间充质干细胞对神经胶质瘤U251细胞杀伤作用研究

郭兴荣,王小莉,袁雅红,涂汉军

2016, 32(4):  234-241.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.032

摘要 ( 192 )   HTML   PDF (2148KB) ( 365 )  

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间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有向肿瘤组织迁移趋化的特性，所以它被认为是一种携带特殊基因进行肿瘤的靶向治疗的理想载体。与不同形式的DNA载体相比，体外合成的mRNA更容易转染并且不会引入突变。利用间接共培养方法研究PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）mRNA编辑的MSCs对U251-Luc细胞杀伤作用。体外转录合成PTEN mRNA，转染到MSCs，利用Western blot方法检测转染后PTEN蛋白表达情况，transwell共培养方法分析转染PTEN mRNA对MSCs肿瘤细胞迁移趋化性影响。利用活体成像仪和荧光显微镜检测在间接共培养条件下PTEN mRNA编辑的MSCs对U251-Luc细胞杀伤作用。体外成功合成PTEN mRNA，转染到U251-Luc细胞后能正确表达PTEN蛋白，并且在转染24 h表达最高。与对照组相比，转染PTEN mRNA后能一定程度提高MSCs细胞对肿瘤迁移能力（P<0.05）。PTEN mRNA编辑的MSCs培养上清能显著抑制U251-Luc细胞生长（P<0.05）。体外合成抑癌基因mRNA的方法为MSC介导的靶向基因治疗神经胶质瘤提供新思路。

微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响

陈以衡,陶姝宇,刘旭平,谭文松

2016, 32(4):  242-250.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.033

摘要 ( 237 )   HTML   PDF (2939KB) ( 668 )  

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选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率，优化微载体培养体系猪睾丸细胞（Swine testicle cells）的贴附生长与维持。使用DMEM补加10%血清、LSM（Low serum medium）两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对细胞生长维持的影响，进而比较ST细胞在不同条件下对Cytodex 1微载体的利用率。结果显示，使用LSM在T150方瓶中连续传代培养30 d，平均比生长速率为0.626 d-1，是DMEM补加10%FBS培养基的1.15倍。选择10×105 cells/mL细胞接种3 g/L Cytodex 1搅拌瓶体系，最大细胞密度为38.3×105 cells/mL，微载体利用率上升到58.8%。在灌注培养体系中培养ST细胞15 d，最终细胞密度达到36.6×105 cells/mL，扩增了13.6倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于ST细胞的贴附与生长，实现高密度生长，另一方面增加了微载体的使用成本，选择合适的微载体浓度、细胞接种密度，能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的最优生长。

东北传统豆酱发酵过程中微生物的多样性

高秀芝,易欣欣,刘慧,王晓东,崔宗均

2016, 32(4):  251-255.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.034

摘要 ( 211 )   HTML   PDF (1627KB) ( 582 )  

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以东北传统发酵豆酱为研究对象，分析豆酱发酵过程中微生物群落的动态变化。分别选择发酵豆酱0、35、65、75和105 d（成品豆酱）作为研究材料，通过PCR-DGGE分析微生物多样性，检测了豆酱发酵过程中蛋白质和氨基酸态氮的变化。结果表明，豆酱发酵过程中主要优势细菌为芽孢杆菌和乳酸菌，芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的近缘种等；主要乳酸菌为乳球菌、明串珠菌、魏斯氏菌等种属细菌的近缘种；东北豆酱发酵过程中优势真菌为米曲霉、散囊菌和谢瓦氏曲霉的近缘种，随发酵时间延长数量逐渐减少；粗蛋白相对含量先略有平稳上升后下降，最后成品酱粗蛋白含量下降为24.76％；氨基态氮含量一直在增加，成品酱中为101.2 g/kg。

山楂提取物对急性损伤线虫的保护作用

赵江,陈纯,王轶菲,王红,黄杰,王浩

2016, 32(4):  256-260.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.035

摘要 ( 201 )   HTML   PDF (2144KB) ( 354 )  

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以秀丽隐杆线虫（Canorhabditis elegans）为模式生物研究山楂提取物（Haworth fruit extract，HFE）对其急性氧化损伤的保护作用及其可能的作用机制。饲喂线虫于含有不同浓度（0、25、50和100 μg/mL）HFE的NGM（Nematode growth medium）培养基中，研究HFE对线虫急性应激耐受能力的影响。结果显示，饲喂HFE后，秀丽线虫表现出比正常组更高的寿命，并且在胡桃醌氧化应激、热应激及紫外辐射应激实验中寿命均明显延长，荧光显微镜观察发现HFE组线虫的脂褐素自发荧光明显减弱，并且与HFE浓度呈剂量依赖效应。 HFE能够显著延长秀丽隐杆线虫的寿命，同时对多种氧化损伤具有较好的保护作用，改善机体的抗氧化能力，有效延缓衰老。

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2016, 32(4):  300. 

摘要 ( 99 )   HTML   PDF (860KB) ( 212 )  

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2016, 32(4):  400. 

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2016, 32(4):  500. 

摘要 ( 74 )   HTML   PDF (252KB) ( 220 )  

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