生物技术通报

转基因成分低水平混杂问题的现状

柳方方, 董美, 李凯, 宛煜嵩, 金芜军, 李亮

2017, 33(3): 1-5. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.001

摘要 ( 282 )

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近20年来,转基因作物的种植面积持续增加,转基因产品的流通量和流通速度呈迅速上升趋势。在不同国家与地区间,非转基因产品内出现低含量转基因成分的问题,即转基因成分低水平混杂日趋严重。以此问题为立脚点,比较全面的阐述了7个不同国家与地区（组织）的转基因成分低水平混杂的定义,分析了共同特点;总结了各国的现行政策与允许值的规定;概述了低水平混杂问题对进出口贸易方面产生的影响,旨为我国制定低水平混杂的相关政策及检测标准提供基础资料。

植物耐重金属的分子生物学研究进展

迟春宁, 丁国华

2017, 33(3): 6-11. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.002

摘要 ( 313 )

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重金属污染对我国经济发展、人身健康造成重大负面影响,已经成为当今研究热点。综述了近年来重金属对植物的毒害及植物耐性机制等方面的研究进展,主要包括金属对植物的生长发育影响,植物抵抗重金属毒害的防御方式及抵抗重金属胁迫的相关基因和蛋白等,旨在为该领域的相关研究提供资料和借鉴。

分泌蛋白质组学在肿瘤标志物中的研究进展

余乐正, 柳凤娟, 吴正雨, 冉小强

2017, 33(3): 12-21. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.003

摘要 ( 376 )

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在肿瘤发生、发展过程中,肿瘤细胞会分泌出大量蛋白质,而一些分泌蛋白已作为肿瘤标志物被用于肿瘤的临床检测与预后判断。随着蛋白质组学技术的快速发展,分泌蛋白质组学应运而生,并为肿瘤研究提供了新的思路与方法。现就分泌蛋白质组学在肿瘤标志物研究中的策略及进展做一综述,旨在为研究人员在肿瘤标志物发现及筛选方面提供借鉴。

黄单胞菌属细菌非编码小RNA的研究进展

严玉萍, 钟晰, 王雪峰

2017, 33(3): 22-28. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.004

摘要 ( 292 )

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黄单胞菌属（Xanthomonas）是一类能引起多种单子叶和双子叶植物感病的革兰氏阴性细菌,严重危害水稻、甘蓝、番茄、柑橘等多种作物,其入侵和增殖依赖于三型分泌系统（Type III Secretion System,T3SS）和其他毒素因子。细菌非编码小RNA能通过与靶mRNA互作,在转录后水平调控基因的表达,或直接与蛋白互作,影响细胞的各种生理功能。主要介绍了细菌非编码小RNA的分类、及其对细菌蛋白调节、生长代谢、基因转录以及毒力调控等方面的研究进展,并重点对黄单胞菌属细菌已鉴定的非编码小RNA及其生物学功能进行综述,以期为黄单胞菌引起的作物病害防控提供新的思路。

miR-1246在疾病上的研究进展

胡煜, 王玲, 毕武, 谭林, 邢丹, 左福元

2017, 33(3): 29-36. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.005

摘要 ( 244 )

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miRNAs是一类具有转录调控功能的小分子非编码RNA,参与了组织代谢和细胞增殖、分化、凋亡及基因表达,在许多生理和病理过程中扮演着重要的角色。目前,研发有效的miRNA激活剂或抑制剂来挽救和诊断病理状态,已成为医学研究领域的新方向和切入点。最新发现的miR-1246受P53调控,并与产生疾病的分子机制息息相关。综述了miR-1246序列结构特点及分子作用机制,对近年来miR-1246在癌症、埃博拉病毒传染病、唐氏综合症等疾病上的应用潜能进行了总结,并对该领域今后的发展前景作了展望,旨为医学研究提供理论参考。

草莓红中柱根腐病的研究进展

陈哲, 黄静, 赵佳, 梁宏

2017, 33(3): 37-44. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.006

摘要 ( 243 )

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草莓红中柱根腐病是由宿主特异性强的草莓疫霉菌（Phytophthora Fragaria）侵染所致。该病的发生呈逐年上升的趋势,特别是在连续种植草莓的重茬地块,严重时可造成整个草莓种植地的毁灭,已成为草莓产业发展的主要障碍之一。从草莓红中柱根腐病的发现与危害、病原菌的病原物生物学以及分子检测手段、病害症状及防治方法等方面全面阐述了国内外草莓红中柱根腐病的研究进展,并对今后的研究方向进行展望,以期为相关研究提供一些参考和理论依据。

小麦诱发突变技术育种研究进展

于沐, 周秋峰

2017, 33(3): 45-51. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.007

摘要 ( 252 )

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诱发突变育种技术是利用射线、离子、中子等物理辐射因素及空间环境诱变种子或植物离体组织,获得有益突变体,缩短育种周期的育种技术。据国际诱变育成品种数据库的不完全统计,截至2016年5月,世界上60多个国家在214种植物上诱变了超过3 200个正式发布的突变品种,21个国家诱变了254个小麦突变体,其中我国诱变小麦164个,占总量超过64%而位居世界第一。综述了诱变技术在小麦育种方面的成就,概述了获得的小麦农艺性状、产量、品质等性状突变,并对今后小麦诱变育种的目标及方法进行了展望。以期为小麦诱变育种的进一步发展提供借鉴,促进现代物理农业的应用及发展。

植物细胞程序性死亡检测技术研究进展

邓雨青, 李平, 周彦, 熊克才, 李中安

2017, 33(3): 52-57. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.008

摘要 ( 276 )

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细胞程序性死亡（PCD）是一种细胞生物学反应,广泛存在于植物的生长发育与抗逆过程,是当今生命科学的研究热点之一。从形态学、生物化学和分子生物学等方面综合分析了植物细胞 PCD 检测方法的研究进展,并对现有植物 PCD 检测技术的不足和解决途径进行了讨论与展望,以期为后续 PCD 研究和应用提供借鉴。

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在真菌中的应用

殷朝敏, 范秀芝, 史徳芳, 高虹

2017, 33(3): 58-65. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.009

摘要 ( 329 )

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CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。其中II型CRISPR/Cas系统已被改造成为一个简便、高效的基因编辑工具,并在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改良中得到广泛应用。简述了CRISPR/Cas系统的结构、作用机理及分类情况,归纳总结了CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母和其他丝状真菌中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行了展望,以期为真菌基因编辑研究提供参考。

鸡血藤愈伤组织培养过程中内源激素变化研究

张亚芳, 何钢, 荣广天, 刘贤桂, 倪尚格, 张世良

2017, 33(3): 66-70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.010

摘要 ( 271 )

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旨在建立密花豆组织培养再生体系并测定其再生过程中内源激素的动态变化。利用酶联免疫吸附法（ELISA）对密花豆嫩叶愈伤组织诱导与不定芽分化过程中的4种内源激素：生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、玉米素（ZT）和赤霉素（GA₃）的含量进行测定和分析。结果表明,在愈伤组织的诱导过程中,IAA的含量始终处于较高水平,并在愈伤组织生长最旺时达最大,而ABA、ZT和GA₃的含量一直保持在较低水平;IAA/ABA对愈伤组织的诱导与生长有着重要的调节作用。在愈伤组织的分化过程中,IAA的含量呈先降后升,并在分化成芽期达到最高,且高于愈伤组织诱导期,介于1.15-1.87 μg/g之间;ZT和ABA的含量均呈先升后降趋势,而GA₃则一直呈上升趋势;IAA/ABA呈先降后升趋势,对芽的分化与生长有着重要的促进作用;GA₃/ABA和ZT/ABA呈先降后升趋势,协同促进鸡血藤愈伤组织成功分化出不定芽。内源激素对愈伤组织的诱导和分化成芽有着重要的影响,合适的浓度和比例能有效的促进外植体的脱分化与再分化,并协同促进细胞的分裂、分化和生长。

离体培养条件下GA对烟草胚柄PCD的诱导研究

罗岸, 陈克强

2017, 33(3): 71-77. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.011

摘要 ( 205 )

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细胞程序性死亡（PCD）对于植物的正常生长至关重要,涉及整个生命周期中的诸多发育事件,其中植物激素是植物细胞PCD的一种重要调控因子。本研究建立了有效的烟草胚珠和胚胎离体培养体系。通过设置不同的赤霉素（GA）浓度梯度和不同的培养天数进行比较,认为100 μmol/L的GA浓度和不超过3 d的培养时间对于研究比较合适。胚胎离体培养表明外源GA能够有效诱导烟草胚柄细胞PCD的发生;且随着GA浓度的增加,胚柄细胞PCD的比例会逐步上升。但过高的GA浓度和过长的培养时间也会导致胚体细胞出现异常的PCD现象。

木薯栽培种ZM-Seaside和花叶变种块根蛋白组学分析

宋雁超, 安飞飞, 薛晶晶, 秦于玲, 李开绵, 陈松笔

2017, 33(3): 78-85. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.012

摘要 ( 191 )

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为研究木薯栽培种ZM-Seaside（高产种质）和花叶变种（低产种质）块根产量差异的原因,从农艺性状和蛋白质组学角度对以上2个种质进行分析,为选育高产木薯品种提供理论依据。试验中采用旋光法测定淀粉含量;硝酸银滴定法测定氢氰酸含量;苯酚抽提法提取蛋白质;双向电泳技术分离蛋白质;Delta2D软件确定差异蛋白质点;质谱技术鉴定差异蛋白质点,结合KEGG数据库将其功能分类;利用Western blot技术对部分差异蛋白质进行验证;String在线软件构建蛋白质互作调控网络。结果显示,ZM-Seaside块根淀粉含量为29.18%,显著高于花叶变种的25.83%;两种木薯鲜薯薯肉氢氰酸含量均低于50 mg/kg,属可食用木薯种质。ZM-Seaside干物率为40.28%,显著高于花叶变种的37.16%。以花叶变种块根的全蛋白质为对照,ZM-Seaside的块根存在39个差异蛋白质点,其中上调表达23个,下调表达16个;经质谱技术成功鉴定到其中28个,其功能涉及到碳水化合物和能量代谢（7个）、分子伴侣（8个）、解毒和抗氧化（2个）、蛋白质合成（1个）、结构蛋白（3个）及未知功能蛋白质（7个）。STRING代谢网络显示：热激蛋白Heat shock protein和分子伴侣Molecular chaperone Hsp90-1互作关系最多,是整个互作调控网络的枢纽。推测这2个蛋白质是影响ZM-Seaside和花叶变种块根产量差异的关键蛋白质,这些蛋白质有可能成为选育高产木薯种质的标记蛋白质。

橡胶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂HbCYS2的克隆与表达分析

龙翔宇, 梁启福, 戚继艳, 方永军, 唐朝荣

2017, 33(3): 86-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.013

摘要 ( 232 )

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半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin,CYS）广泛参与植物的生长发育调控、生物与非生物胁迫应答过程。从橡胶树中获得1个CYS基因,ORF长度为687 bp,编码1个由228个氨基酸残基组成的蛋白,生物信息学分析发现该蛋白含有2个CYS结构域,以及1个含有30个氨基酸残基的信号肽,为分泌蛋白,推测属于植物CYS II型,命名为HbCYS2（GenBank：KX161925）。表达分析发现HbCYS2在胶乳中高表达,并且受割胶和产量调节剂ET调控;在叶片组织中,HbCYS2对多主棒孢侵染表现出明显应答。由此推测,胶乳中HbCYS2在橡胶树胶乳再生、以及割胶伤害应答中发挥一定的调控作用,叶片中HbCYS2参与橡胶树棒孢落叶病的防御或抵抗。

盐藻蛋白酶体亚基PSMD7在鞭毛解聚后的表达分析

石科, 梁瑞峰, 杨亮

2017, 33(3): 93-99. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.014

摘要 ( 206 )

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为了研究盐藻19S蛋白酶体亚基PSMD7和鞭毛解聚的关系,用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导盐藻鞭毛解聚,实时荧光定量PCR检测PSMD7在鞭毛解聚后的mRNA表达变化。同时通过原核表达和蛋白纯化得到高纯度的盐藻PSMD7蛋白,制备盐藻PSMD7的山羊多克隆抗体,Western blot检测PSMD7蛋白在鞭毛解聚后的表达情况。结果显示IBMX诱导鞭毛解聚后PSMD7的mRNA表达水平增高,其中在鞭毛解聚后30 min达到最大值。成功制备了盐藻PSMD7的山羊多克隆抗体,Western blot结果显示PSMD7蛋白在鞭毛解聚后表达增加,说明蛋白酶体亚基PSMD7参与盐藻鞭毛的解聚。

一株水稻促生长内生真菌的绿色荧光蛋白基因标记与示踪

陈楠, 于飞, 何艳柳, 卜宁

2017, 33(3): 100-105. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.015

摘要 ( 227 )

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将绿色荧光蛋白基因（gfp）转入到碱蓬内生真菌JP4-1中并检测菌株在水稻幼苗中的定殖情况。采用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化方法将携带gfp基因的pCT74质粒与菌株基因组整合获得转化子,用转化子侵染水稻幼苗,荧光显微镜下示踪JP4-1菌株及其侵染特性。转化子经连续传代6次仍能发出绿色荧光且荧光强度良好,能够稳定遗传;经PCR验证gfp基因已成功转入JP4-1菌株和水稻幼苗植株内并表达。转化可获得稳定表达GFP的JP4-1转化子,JP4-1菌株可定殖于水稻幼苗的根、茎、叶,定殖位置为细胞间隙,其促生作用与野生型菌株无明显差别。

麦芽糖诱导海藻糖合成酶基因在B.subtilis WB800n中的表达

刘强, 王腾飞, 汪俊卿, 王希晖, 王瑞明

2017, 33(3): 106-115. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.016

摘要 ( 220 )

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运用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖诱导型启动子调控元件,构建得到麦芽糖诱导海藻糖合成酶的安全表达系统,使其制备的海藻糖能够广泛应用于食品医疗行业。以来源于恶臭假单胞杆菌KT2440（Pseudomonas putida KT2440）的海藻糖合成酶基因TreS为报告基因,以cre序列定点突变（CG碱基突变为AT碱基）优化后的麦芽糖诱导型的枯草芽孢杆菌操纵元启动子Pglv为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒PHT01为载体骨架,通过BamH I和AatII限制酶酶切替换,构建得到高效表达载体Pglv-PHT01-TreS,将质粒电转化到B.subtilis WB800n并验证其表达效果。成功构建了海藻糖合成酶高效表达质粒Pglv-PHT01-TreS,并实现了该重组质粒在B.subtilis WB800n中的表达。利用基础发酵培养基优化发酵条件验证结果表明,菌体生长到发酵液吸光值OD₆₀₀达到1.2时加入终质量分数4.5%的麦芽糖,37℃诱导18 h后胞内的海藻糖合成酶的粗酶活力达到18.9 U/mL。为了提高海藻糖合成酶的表达量,还构建了通过单交叉互换方法敲除了α-淀粉酶基因amyE的重组菌株B.subtilis WB800n（ΔamyE）,减少了胞外α-淀粉酶对麦芽糖的降解成葡萄糖,提高了麦芽糖的诱导表达效果以及减少葡萄糖的反馈抑制,表达质粒在麦芽糖诱导条件下在该重组菌中海藻糖合成酶酶活提高到了29.2 U/mL。首次成功实现了麦芽糖诱导海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为获得制备安全高效的海藻糖合成酶表达系统奠定了基础。

两株好氧反硝化聚磷菌的筛选、鉴定及水质净化研究

聂毅磊, 贾纬, 曾艳兵, 罗立津, 陈星伟, 庄鸿, 陈宏

2017, 33(3): 116-121. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.017

摘要 ( 191 )

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旨在从环境样品中筛选对富营养化水体具有良好脱氮除磷效果的好氧反硝化菌。采集福州某养猪场污水处理池中的水样。通过反硝化细菌培养基培养、BTB培养基平板分离、硝酸盐还原试验和蓝白斑筛选法、异染颗粒以及聚-β-羟基丁酸（PHB）颗粒染色试验,筛选获得两株具有脱氮除磷特性的菌株,命名为N1和N2。经16S rRNA 基因序列分析,N1和N2分别属于无色杆菌属（Achromobacter.sp）和短波单胞菌属（Brevundimonas.sp）。将菌株N1和N2复配,获得脱氮除磷复合菌FIM-1。考察了菌株对人工合成污水和富营养化水体脱氮除磷的效果。结果表明,两株菌在含磷量较低的水体中,对磷的去除率较高,相对于单菌,复合菌表现出更佳的脱氮除磷效果。

石楠锈孢锈菌重寄生拟盘多毛孢的分离鉴定及抑菌活性

李靖, 谢津, 李向楠, 周稚凡, 刘风路, 陈玉惠

2017, 33(3): 122-127. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.018

摘要 ( 244 )

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重寄生拟盘多毛孢因其特殊生境,可产生区别于内生或病原拟盘多毛孢的次生代谢产物,是有待开发的真菌资源。为了获得活性较好的石楠锈孢锈菌重寄生菌,采用组织分离法,从患有锈病的球花石楠叶片上分离纯化出3株疑似拟盘多毛孢真菌,它们形态特征差异明显,通过回接实验证实其均为石楠锈孢锈菌的重寄生菌。对3 菌株在不同培养基上的培养性状和显微特征作了描述,并对ITS 序列进行了扩增和序列分析。形态学和分子鉴定结果证实这3 株真菌均为拟盘多毛孢属真菌。抑菌实验结果表明,3株重寄生菌除了对石楠锈孢锈菌的锈孢子有破坏作用外,对其他10种常见植物病原真菌也有一定的抑制作用。

不同品种酿酒葡萄表皮微生物群落多样性分析

张世伟, 陈曦, 钟其顶, 黄占斌, 孟镇, 罗金学, 石玲, 白志辉

2017, 33(3): 128-137. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.019

摘要 ( 207 )

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葡萄酒酿造是多种微生物参与代谢的过程,其中的微生物在没有外源接种的情况下通常认为源自酿酒葡萄本身。应用高通量测序技术,分析沙城地区不同品种酿酒葡萄表皮的微生物群落,旨在从源头上了解葡萄酒酿造原料的品质,为研究酿酒葡萄微生物对酿酒品质的影响提供理论依据。结果显示,无论细菌还是真菌丰富度最大的均为雷司令,细菌主要分布在变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）等8个门,优势细菌主要是欧文氏菌属（Erwinia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）等6个属。真菌仅分布在子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和接合菌门（Zygomycota）3个门,链格孢菌属（Alternaria）、枝孢属（Cladosporium）、茎点霉属（Phoma）、镰孢属（Fusarium）等9个主要的属。细菌中心OTU最相似菌种分别为节杆菌（Arthrobacter sp.）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）等,真菌为枝孢菌（Cladosporium sp.）、茎点霉（Phoma sp.）、链格孢菌（Alternaria sp.）以及大量未知种属的OTU。研究表明,葡萄品种是影响微生物群落的最重要的因素,推测酿酒葡萄上的一些微生物会对葡萄植株的健康、葡萄果实的品质以及葡萄酒酿造产生有益或有害的影响。

内生真菌对油樟挥发油积累及生理生化特性的影响

严宽, 陈放, 魏琴, 冯瑞章, 周万海, 周敏

2017, 33(3): 138-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.020

摘要 ( 192 )

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旨在研究内生真菌对油樟挥发油积累及生理生化特性的影响。以4株内生真菌（2J1、3J1、5J2、YB）作为材料,将内生真菌孢子悬浮液均匀喷洒在油樟叶片上进行处理后,提取油樟叶片中的挥发油,利用GC-MS测定挥发油中1,8-桉叶油素、α-松油醇的量。结果显示,采用2J1和3J1两种内生真菌对油樟进行处理,在处理21 d时挥发油含量达到最大值,其主要成分1,8-桉叶油素分别比对照高出201.53%、174.47%,α-松油醇高出364.14%、307.29%,且过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MOD）的含量有显著提高;由5J2和YB处理的油樟挥发油含量、POD与CAT活性以及MOD含量与对照相比差异均不显著。采用2J1和3J1处理油樟植株,能有效提高油樟挥发油的含量。

利用杨木水解液制备细菌纤维素

陈慧慧, 刘玉, 王慧梅

2017, 33(3): 144-150. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.021

摘要 ( 216 )

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选用杨木木屑水解液为发酵基质,利用木醋杆菌发酵制备细菌纤维素。研究还原糖浓度、初始pH值、接种量、发酵温度和发酵时间对细菌纤维素产量、持水性和复水率的影响。结果表明,生产细菌纤维素的适宜条件为：杨木木屑水解液还原糖浓度为2.5%,初始pH为6.0,接种量为6%,发酵时间6 d,发酵温度30℃,在此条件下,细菌纤维素产量为3.14 g/L,持水性为98.72%,复水率为86.69%。采用扫描电镜、红外光谱、热失重分析法等技术分析了所制备的细菌纤维素的结构与性能,结果表明合成产物为超微细网状结构,且产物中含有的基团与纤维素结构相符合。

高原鼢鼠组织中透明质酸提取工艺及分子表征

魏琳娜, 汪洋, 魏登邦, 魏莲, 王宁, 索有瑞

2017, 33(3): 151-161. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.022

摘要 ( 228 )

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旨在建立高原鼢鼠组织中透明质酸（Hyaluronic acid,HA）提取工艺。采用单因素试验确定粗提、酶解和除杂等工艺的最佳条件,通过响应面法进一步优化粗提和酶解工艺条件。通过红外分光光度法确定HA的分子结构,Bitter-Muir法确定其葡萄糖醛酸的含量,黏度法和体积排阻色谱法确定透明质酸的分子量。高原鼢鼠最佳粗取工艺∶液料比4 mL/g（水/动物组织,V/W）,提取温度26℃,提取时间1.6 h;最佳酶解工艺：酶解温度37℃,pH8.7,加酶量0.7%（1∶250 胰蛋白酶/动物组织,W/W）;最佳除杂工艺为：氯苯体积20%（氯苯/HA水溶液,V/V）,以3倍体积95%乙醇沉淀,以7%活性碳（活性碳/HA水溶液,W/V）除杂,透析时间3 h。在此工艺条件下,每500 g 高原鼢鼠组织可得到（144±3.61）mg HA粉末。平均回收率为72.73%。红外图谱显示提取物具有与Sigma公司的HA标准品一致的吸收峰,葡萄糖醛酸的质量分数为45.60%,蛋白质含量为0.11%,其分子量达到3×10⁶Da。本工艺提取的高原鼢鼠组织来源的HA回收率好,纯度高;高原鼢鼠组织中HA分子量大,含量高。

齐口裂腹鱼CDH5基因特性及其对温和气单胞菌感染的应答

段荟芹, 王利

2017, 33(3): 162-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.023

摘要 ( 188 )

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探讨齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）血管内皮黏附分子（Cadherin 5,CDH5）的基因特性。用生物信息学软件分析齐口裂腹鱼CDH5基因序列,用Real-time PCR检测CDH5基因在齐口裂腹鱼感染温和气单胞菌后0 h、24 h和 48 h的表达变化。获得CDH5基因全长cDNA序列,GenBank登录号为KT329441。该序列长4 825 bp,开放阅读框长2 313 bp,编码770个氨基酸。蛋白预测结果显示,该蛋白相对分子量为85.19 kD,等电点为5.01。存在信号肽序列,二级结构以随机卷曲、延伸链、α-螺旋为主。齐口裂腹鱼CDH5氨基酸序列与斑马鱼同源性达74%,与人的相似性为43%。CDH5在感染温和气单胞菌后在各组织中均有表达。脾脏中CDH5基因在24 h表达量显著高于0 h和48 h（P<0.05）。肝脏、肾脏和肌肉中CDH5在48 h的表达量均显著高于24 h（P<0.05）。心脏和肠道中CDH5基因在48 h的表达量显著高于0 h（P<0.05）。CDH5基因在可能参与了齐口裂腹鱼抗温和气单胞菌感染的免疫应答,为深入研究CDH5在齐口裂腹鱼中的功能奠定基础。

猪细小病毒1型VP2基因的原核表达及反应原性分析

欧云文, 马小元, 张杰, 丁耀忠, 张永光, 贾宁

2017, 33(3): 169-174. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.024

摘要 ( 227 )

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旨在研究猪细小病毒1型（PPV1）VP2蛋白（第155-439位氨基酸）的抗原性,为开发PPV1的检测方法奠定基础。以PPV1型AV31株的DNA为模板,扩增获得849 bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a（+）原核表达载体,构建pET30a-PPV1-VP2（155-439 aa）重组质粒,转入大肠杆菌BL21（DE3）;在37℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDS-PAGE分析表明,该VP2编码基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为39 kD;Western blot检测结果表明,该重组蛋白与PPV1阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PCV2阳性血清不发生交叉反应。该实验成功构建了PPV1-VP2（155-439 aa）原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性。

miR-124靶向TNF-α促进猪皮下脂肪细胞分化

李虹仪, 李家标, 郑艺林, 吉卢琳, 张茂, 郑恩琴

2017, 33(3): 175-179. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.025

摘要 ( 208 )

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前期研究中采用双萤光素酶报告基因验证了miR-124与脂解因子猪TNF-α之间的靶关系,以此为基础研究miR-124是否影响猪皮下脂肪细胞的分化。采用miR-124 模拟物mimics和抑制物inhibitor 分别转染猪脂肪前体细胞并诱导其分化成成熟脂肪细胞,检测细胞的聚脂情况,甘油及甘油三酯的含量变化,荧光定量检测脂肪细胞关键转录因子PPARγ,脂肪合成和分解的主要酶FASN和HSL基因的表达变化。结果显示,过表达miR-124 能抑制TNF-α蛋白的表达,脂肪细胞脂滴多于对照组,甘油三酯（TG）含量显著增加（P<0.01）,甘油含量亦显著增加（P<0.05）,PPARγ、FASNT和HSL的表达显著上调（P<0.01）;抑制细胞miR-124的表达脂滴则较少,TG含量显著减少（P<0.05）,PPARγ和FASN的表达均显著下调（P<0.05）。miR-124可能通过抑制TNF-α调节猪脂肪细胞的分化,为后续研究miR-124调节脂肪代谢的相关机制奠定基础。

过表达MicroRNA-199a促进TNFα诱导的脂肪细胞凋亡

齐仁立, 王琪, 吴永江, 王敬, 黄金秀, 杨飞云

2017, 33(3): 180-185. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.026

摘要 ( 197 )

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旨为探明microRNA-199a（miR-199a）对脂肪细胞凋亡的影响及核转录因子κB（nuclear factor κB,NF-κB）在其中的作用。培养3T3-L1脂肪细胞,使用肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNFα）诱导细胞凋亡。在此基础上分别使用NF-κB阻断剂PDTC和miR-199a mimic处理细胞,判断过表达miR-199a对TNFα诱导的脂肪细胞凋亡的影响及NF-κB在其中的作用。使用流式细胞仪分析细胞凋亡率,试剂盒检测Caspase3/7酶活,双荧光素酶报告系统检测NF-κB活性,qRT-PCR 检测miR-199a的表达水平,Western blotting检测NF-κB相关蛋白变化。结果显示,TNFα可以诱导分化的脂肪细胞凋亡并同时激活NF-κB,激活的NF-κB在TNFα诱导的脂肪细胞凋亡中发挥负调控作用。在脂肪细胞过表达miR-199a明显抑制NF-κB的激活进而显著促进TNFα诱导的凋亡。miR-199a通过调控NF-κB活性参与TNFα诱导的脂肪细胞凋亡。

LAMP技术快速诊断布鲁氏菌病的研究

谢文萍, 肇慧君, 张琳, 姜红旭, 吴斌, 孙浩

2017, 33(3): 186-192. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.027

摘要 ( 204 )

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旨在应用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）对布鲁氏菌进行研究。针对布鲁氏菌保守基因16S rDNA设计LAMP引物,通过浊度法对LAMP反应条件进行优化,应用建立好的LAMP反应条件进行特异性及灵敏性试验。结果显示：（1）优化后的反应条件是62℃恒温60 min,内引物1.50 µmol/µL、外引物0.20 µmol/µL、环引物1.0 µmol/µL。（2）该LAMP方法与3株布鲁氏菌均发生了扩增反应,达到阳性浊度值,而与小肠耶尔森（ATCC9510）、大肠杆菌（ATCC25922）、沙门氏菌（ATCC10708）和金黄色葡萄球菌（ACTT33591）等标准菌株没有扩增反应。（3）浊度法和实时荧光法两种方法的检测最低限分别为4.36 fg/µL和436 fg/µL,其灵敏度均高于普通PCR的最低检出值4.36 pg/µL。LAMP检测技术用于布病临床诊断具有快速、高效、便捷等特点,对于基层布病的病原学诊断具有实用价值。

人抗酶抑制因子-1的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

吕亚丰, 杨建林, 秦宇, 王艳林

2017, 33(3): 193-198. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.028

摘要 ( 176 )

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原核表达纯化人抗酶抑制因子-1（（antizyme inhibition factor-1,AZIN1）,制备并鉴定抗AZIN1多克隆抗体。pET-28a/AZIN1表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后,IPTG诱导蛋白表达,利用Ni-NTA 树脂于变性条件下亲和层析纯化人AZIN1蛋白。将重组AZIN1蛋白用作抗原免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测抗AZIN1抗体效价,Western bloting、细胞免疫荧光、细胞免疫化学方法检测抗体的应用。结果显示,重组pET-28a/AZIN1表达质粒经酶切及测序鉴定构建正确。细菌内重组AZIN1蛋白可被IPTG诱导表达并以包涵体的形式存在。用亲和层析法能有效纯化原核表达的AZIN1蛋白,该蛋白在小鼠体内能够诱导抗AZIN1特异性抗体产生,血清效价达到1640 000。制备抗体能够特异性识别和结合人及小鼠瘤细胞中表达的AZIN1蛋白,并可有效用于AZIN1的Western blotting、细胞免疫荧光和细胞免疫化学分析。成功原核表达和纯化了人AZIN1蛋白并制备了抗AZIN1多克隆抗体,为深入研究AZIN1在调控细胞增殖及在疾病防治中的作用提供了研究基础。

尿微量白蛋白荧光免疫层析定量检测试剂的研制及性能评价

张赛, 洪裕好, 李凯, 何小维, 李文美

2017, 33(3): 199-204. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.029

摘要 ( 247 )

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旨在建立一种快速定量检测人尿液中微量白蛋白的荧光免疫层析方法。以羧基荧光微球标记的抗人白蛋白单克隆抗体及羊抗兔IgG为标记抗体,人白蛋白和兔IgG分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。结果显示,所制备检测试剂的线性范围为5-300 mg/L,检测限为2.3 mg/L,批内和批间变异系数（CV）分别为6.4%-9.3%和6.5%-12.3%,平均回收率为102.3%。试剂与尿液中20种干扰物质无交叉反应,实时稳定性试验表明试剂盒有效期>12月。临床样本测试,与Orion QuikRead U-ALB试剂相关性较好（r=0.993,P<0.01）,Bland-Altman分析表明两种方法的诊断结果具有较好的一致性。所制备的荧光免疫层析检测试剂提供了一种简单、快速、准确的定量检测尿液中微量白蛋白的方法。

磁性Fe₃O₄/聚苯胺纳米纤维的制备及其固定漆酶研究

刘友勋, 王耀坤, 闫明阳, 黄娟

2017, 33(3): 205-212. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.030

摘要 ( 202 )

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合成优良的漆酶固定化载体有利于其进一步应用。通过将磁性纳米颗粒包埋在苯胺的聚合物中形成磁性Fe₃O₄/聚苯胺纳米纤维,作为漆酶固定化载体。透射电镜和红外图谱分别显示了载体的形态结构特征。不同比例的Fe₃O₄与苯胺对载体结构没有明显影响,但会影响酶的负载量。合成载体最大酶负载量为210 mg/g,固定漆酶后的载体导电性能发生变化。固定化漆酶最适pH从4偏移到3.5,在酸性pH范围保持较高的酶活性,最适温度为60℃;在50℃下孵育240 min,能保持约50%的酶活性,于4℃下保存30 d能保持约60%的酶活性;重复使用8次后还能保留70%的酶活性;结果证实了磁性Fe₃O₄/聚苯胺纳米纤维成功合成,对酶有较高的负载量。随着Fe₃O₄的比例增加,载体对漆酶的负载量却减少;漆酶与载体间存在有一定电子交流。固定化漆酶的最适pH向酸性偏移可能和聚苯胺的导电性有关,合成载体显示出良好的热稳定性、储存稳定性和重复使用稳定性,表明磁性Fe₃O₄/聚苯胺纳米纤维是一种优良的酶固定化载体,可以实现酶的高效固定化。

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2017, 33(3): 300.

摘要 ( 109 )

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