番茄环纹斑点病毒Gn蛋白的原核表达及多抗血清制备

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0242

生物技术通报 ›› 2017, Vol. 33 ›› Issue (9): 179-183.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0242

番茄环纹斑点病毒Gn蛋白的原核表达及多抗血清制备

郑宽瑜¹,尚卫娜²,张洁¹,郑雪¹,董家红¹

1. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所云南省农业生物技术重点实验室农业部西南作物基因资源与种质创新重点实验室,昆明650223；
2. 浙江大学生命科学研究院,杭州 310058

收稿日期:2017-03-28 出版日期:2017-09-01 发布日期:2017-09-15
作者简介:郑宽瑜,女,副研究员,研究方向：植物病理学；E-mail：zhengkuanyu@126.com；尚卫娜,女,实验师,研究方向：植物病理学；E-mail：wnshang@zju.edu.cn。尚卫娜与郑宽瑜为共同第一作者
基金资助:
国家自然科学基金项目（31660508,31371919,31060237）

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antiserum Preparation of Gn Protein in Tomato Zonate Spot Virus（TZSV）

ZHENG Kuan-yu¹,SHANG Wei-na²,ZHANG Jie¹,ZHENG Xue¹,DONG Jia-hong¹

1. Institute of Biotechnology and Germplasm Resources,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Yunnan Province Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,Key Lab of the Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation,Ministry of Agriculture,Kunming 650223；
2. Life Sciences Institute,Zhejiang University,Hangzhou 310058

Received:2017-03-28 Published:2017-09-01 Online:2017-09-15

摘要/Abstract

摘要： 通过生物信息学预测,番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,TZSV）Gn蛋白为跨膜蛋白,有3个跨膜结构域,抗原表位预测发现非跨膜区包含有较高的抗原指数区域,因此选择Gn蛋白的非跨膜区进行原核表达及多抗血清制备。用特异性引物,通过RT-PCR从感染TZSV的番茄中扩增出部分Gn基因片段,将获得的片段构建到原核表达载体pET-30a中,获得原核表达载体pET-30a-Gn,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,高效诱导表达了40 kD融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/16 384。利用制备好的抗血清对感染TZSV的病样进行Western blotting 检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清特异性良好,可用于TZSV Gn相关的免疫反应实验。

关键词: 番茄环纹斑点病毒, Gn蛋白, 原核表达, 抗血清

Abstract: Bioinformatics prediction showed that Gn protein in tomato zonate spot virus（TZSV）is a transmembrane protein consisting of 3 transmembrane domains. Antigen epitope prediction showed that there was a high antigen index region,thus non-transmembrane region of Gn was selected to conduct the prokaryotic expression and to prepare polyclonal antiserum. The Gn gene fragment of TZSV was amplified from TZSV-infected tomato sample by RT-PCR,and then cloned into prokaryotic expression vector pET-30a. The recombinant plasmids pET-30a-Gn were transformed into Escherichia coli BL21（DE3）,and then induced to express with IPTG. The result of SDS-PAGE analysis showed the specific fusion protein with molecular weight of 40 kD was highly expressed. Using the purified fusion protein,rabbit was immunized to obtain polyclonal antiserum against TZSV Gn protein. The titer of antiserum was 1/16384 determined by ID-ELISA. The specific band was detected by Western blot while applying the prepared antiserum to the TZSV-infected samples. These results reveal that the specificity of the antiserum is fine,and it is applicable for immune-reaction test related to TZSV Gn.

Key words: tomato zonate spot virus, Gn protein, prokaryotic expression, antiserum

郑宽瑜,尚卫娜,张洁,郑雪,董家红. 番茄环纹斑点病毒Gn蛋白的原核表达及多抗血清制备[J]. 生物技术通报, 2017, 33(9): 179-183.

ZHENG Kuan-yu,SHANG Wei-na,ZHANG Jie,ZHENG Xue,DONG Jia-hong. Prokaryotic Expression and Polyclonal Antiserum Preparation of Gn Protein in Tomato Zonate Spot Virus（TZSV）[J]. Biotechnology Bulletin, 2017, 33(9): 179-183.

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番茄环纹斑点病毒Gn蛋白的原核表达及多抗血清制备

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antiserum Preparation of Gn Protein in Tomato Zonate Spot Virus（TZSV）

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