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2017年 第33卷 第9期    刊出日期：2017-09-01

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综述与专论

植物YSL家族基因研究进展

刘元峰,李素贞,郭晋杰,陈景堂

2017, 33(9):  1-9.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0375

摘要 ( 555 )   HTML   PDF (1852KB) ( 694 )  

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黄色条纹蛋白（Yellow stripe-like protein,YSL）是广泛存在于植物中的重金属吸收、转运蛋白,主要参与植物Fe3+的吸收及对Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+和Mn2+等金属离子的转运。目前,对于黄色条纹蛋白在植物体内的表达模式,亚细胞定位以及突变体等方面的研究揭示了其在植物生长发育过程中的作用。综述了近年来关于YSL基因在植物中的研究进展,旨为研究植物吸收铁的作用机理及生物强化谷物籽粒中的铁含量奠定基础。

黄瓜花叶病毒致病性研究进展

邱艳红,王超楠,朱水芳

2017, 33(9):  10-16.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0278

摘要 ( 401 )   HTML   PDF (1076KB) ( 495 )  

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黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）属于正义单链RNA病毒,寄主广泛,危害严重,是当前最具影响力的植物病毒之一,也是世界公认的重要植物病害。CMV自1916年报道以来,国内外学者从病毒基因、基因编码产物以及与寄主相互作用等多个方面展开了大量研究。随着高通量测序技术与蛋白质组学技术的发展,病毒相关致病机制也取得突破性进展。介绍了CMV编码蛋白,CMV相关的卫星RNA以及寄主因子在CMV侵染植物后的症状发展过程中的作用,并对今后的CMV致病性研究进行了讨论,旨为CMV的相关研究提供参考。

转基因植物生产疫苗和药物的研发进展

刘蓉蓉

2017, 33(9):  17-22.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0177

摘要 ( 380 )   HTML   PDF (1079KB) ( 743 )  

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与传统的生产方式相比,以转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白和疫苗,被认为是成本低廉、安全便捷的技术途径。目前,若干以转基因植物生产的药用蛋白已通过行政审批准予上市,一批转基因植物表达的人用或畜禽用疫苗也进入临床试验。综述了转基因植物生产疫苗和药用蛋白的研发进展与代表性案例,讨论了目前面临的问题与挑战,展望了未来技术发展方向。

鱼类基因组研究进展

徐钢春,杜富宽,卞超,石琼,徐跑,

2017, 33(9):  23-31.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0290

摘要 ( 394 )   HTML   PDF (1105KB) ( 983 )  

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鱼类基因组研究利用大规模测序获取有关物种的基因组序列信息,进而阐明鱼类生物学特性、表型变异与基因组结构之间的关系,在鱼类的种质鉴定、遗传育种、动物营养、环境毒理和病害防治等领域具有巨大的应用潜力。自2001年首先对斑马鱼的基因组测序起,到目前为止已有近40个鱼类物种的全基因组测序完成,且其相关的生物学特征、遗传进化规律等得到较全面的解析。将从鱼类全基因组测序技术发展历程和鱼类基因组解析两大部分对鱼类基因组研究进展进行综述,旨在进一步了解鱼类基因组的研究现状、发展趋势和应用前景,为后续鱼类基因组研究提供参考。

红色荧光蛋白的研究进展

王飞,杨海涛,王泽方

2017, 33(9):  32-47.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0401

摘要 ( 460 )   HTML   PDF (3854KB) ( 1471 )  

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从荧光蛋白的首次发现至今,其不断丰富的荧光光谱以及日益增多的光化学特性促使其在生物学研究中的地位不断提升。1999年出现的红色荧光蛋白以其卓越的优势在生物学研究中占领了重要地位。主要介绍了从红色荧光蛋白发现至今日趋重要的原因,以及它的显著优势。另外,重讨论了目前几种常见的红色荧光蛋白的特性及其在生物学研究中存在的优势和不足之处,为今后红色荧光蛋白的研究提供一个选择。

磁小体膜蛋白Mms6功能与应用研究进展

马坤,赵宏鑫,李倩,王嘉榕,孙红宾

2017, 33(9):  48-55.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0170

摘要 ( 364 )   HTML   PDF (2069KB) ( 570 )  

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磁小体是趋磁细菌的内膜内陷形成的一种特殊生物矿化产物。磁小体在细胞内呈现为链状,外部有一层生物膜包裹,内部是四氧化三铁纳米晶体。这些磁性纳米晶体有着高度均一的尺寸和形貌。目前大量研究结果表明磁小体膜上的蛋白与铁离子的富集、氧化还原反应以及晶体成核、生长有着重要的关系。综述了趋磁细菌从吸收铁离子到矿化形成磁性纳米颗粒过程中,磁小体膜蛋白的功能,重点介绍了六号特殊膜蛋白Mms6的结构特性与功能。同时总结了Mms6作为一种仿生的添加剂在新型磁性纳米材料中的应用,并且讨论了Mms6在磁小体形成中可能的分子调节机制,旨为进一步了解生物矿化机制提供思路。

乳铁蛋白抗菌机理研究进展

裴杰,褚敏,包鹏甲,阎萍,郭宪

2017, 33(9):  56-63.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0354

摘要 ( 343 )   HTML   PDF (2203KB) ( 700 )  

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乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）是发现于哺乳动物初乳中具有多种生物活性的单体糖蛋白,对幼体初期免疫具有重要作用。前人研究发现LF蛋白的酶解后其抗菌活性得到增强,是由于酶解后产生了比其本身抗菌能力更强的肽段。目前关于LF蛋白抗菌活性的报道很多,但其抗菌的具体分子机制尚不清楚。以LF蛋白与细菌细胞膜的结合能力和LF蛋白酶解产物的抗菌活性为切入点,揭示了LF蛋白行使抗菌功能的过程,认为LF蛋白与细菌表面相结合而发生结构变化,进而暴露出敏感的酶切位点,经酶解而释放抗菌活性肽,这些抗菌肽破坏细菌的细胞膜结构,达到抑菌或杀菌的目的。对LF蛋白抗菌机理的阐释将为研制抗菌能力更强的活性蛋白提供理论依据。

组蛋白去甲基化酶JMJD3研究进展

胡姗,韩聪,胡建宏,朱海鲸

2017, 33(9):  64-72.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0148

摘要 ( 300 )   HTML   PDF (2414KB) ( 1163 )  

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组蛋白甲基化状态是有不同类型的甲基转移酶和去甲基化酶来控制的。H3K27me2/3可以由多梳家族蛋白（如甲基转移酶EZH2）控制形成,其去甲基化后可以催化基因表达。目前共鉴定出JMJD3和UTX两种H3K27me3的去甲基化酶。大量研究发现,JMJD3可以促进细胞分化和衰老,参与调控肿瘤发生与发展。综述了JMJD3在胚胎发育及肿瘤发生、发展中的作用及其调节机制,并对其在肿瘤诊断和治疗方面的应用前景进行展望,旨为今后的研究工作奠定理论基础。

技术与方法

基于质谱的定量蛋白质组学技术发展现状

牟永莹,顾培明,马博,闫文秀,王道平,潘映红

2017, 33(9):  73-84.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0343

摘要 ( 531 )   HTML   PDF (2171KB) ( 2507 )  

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蛋白质组定量分析技术是支撑蛋白质组学研究的关键技术之一,随着蛋白质组定量分析技术的发展,基于质谱的定量蛋白质组学已成为蛋白质组学研究的重要分支。蛋白质组学定量技术可分为非靶向定量和靶向定量两类,靶向定量技术有MRM和PRM模式,非靶向定量技术有非标记定量和体内外标记定量模式,目前使用最多的同位素标记试剂是iTRAQ和TMT。蛋白质组定量技术按数据采集模式还可分DDA和DIA两类。通过对国内外相关文献收集和分析,系统介绍了蛋白质组质谱定量技术的主要特点和发展现状,旨在为生命科学研究者更好地应用定量蛋白质组学技术提供帮助。

PCR-DGGE技术监测自然发酵葛根中微生物菌群动态变化

冉淦侨,张红艳,任平

2017, 33(9):  85-93.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0251

摘要 ( 268 )   HTML   PDF (2411KB) ( 317 )  

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采用自然堆积发酵对葛根进行预处理,处理后葛根总异黄酮的提取量提高了5.7% 左右。随后,分别采用传统平板法和PCR-DGGE技术,对发酵过程中不同时期微生物菌群的变化进行分析,从而筛选出发酵中起主要作用的微生物。结果表明,自然发酵过程中的细菌呈升高-降低-再升高的变化趋势：升温期明显增多,高温期有所下降,降温期再次增多；真菌的数量在整个发酵过程中都呈持续升高的趋势。发酵过程中起主要作用的微生物也被初步确定,它们分别是地衣芽孢杆菌、桃色欧文氏菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、不可培养细菌、爪哇青霉、黑曲霉、溜曲霉、米根霉和不可培养曲霉。

菌丝霉素MP1106融合蛋白的复性及纯化方法

王鹏举,谭焕波,苏文成,张文宇,邹培建

2017, 33(9):  94-100.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0287

摘要 ( 323 )   HTML   PDF (3592KB) ( 533 )  

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旨在建立高效、快捷的菌丝霉素衍生物MP1106大肠杆菌表达系统。通过基因融合的方式构建生物表面活性剂-菌丝霉素衍生物（DAMP4-MP1106）融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中进行表达；并对目的蛋白MP1106进行分离纯化和分子内二硫键鉴定。结果显示,融合蛋白DAMP4-MP1106在大肠杆菌中以包涵体的形式成功表达,表达产物在变性条件下经Ni2+-NTA亲和层析纯化；经检测分析,摇瓶中DAMP4-MP1106的发酵产量为118 mg/L,纯度为94.7%；采用96孔板筛选并建立复性方法,获得水溶性融合蛋白DAMP4-MP1106；并经TEV蛋白酶酶切以及二次Ni2+-NTA亲和层析纯化,可获得纯度为99%的抗菌肽MP1106 18 mg/L,回收率达到了38.4%。通过简捷方法快速鉴定分子内的二硫键,初步证实了抗菌肽MP1106完成了分子内结构正确折叠。建立了高效快捷的菌丝霉素大肠杆菌表达系统。

利用定向进化提高基因工程大肠杆菌的甲醇利用能力

王晓璐, 王钰,刘娇,郑平,路福平

2017, 33(9):  101-109.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0369

摘要 ( 393 )   HTML   PDF (3473KB) ( 558 )  

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甲醇是一种重要的有机化工原料,价格低廉,碳还原度高,在生物化工中是糖质原料的理想替代原料。但是常用的工业微生物宿主如大肠杆菌不能利用甲醇作为碳源,这限制了甲醇在生物化工领域的应用。通过表达甲醇脱氢酶、3-己酮糖-6-磷酸合成酶和6-磷酸-3-己酮糖异构酶在大肠杆菌中构建可同化甲醇的核酮糖单磷酸途径。以基因工程菌作为出发菌株,通过连续传代和定向进化引入随机突变,突变株进行以甲醇为碳源的压力筛选,得到了2株可以利用甲醇生长的突变株。在以甲醇为辅助碳源的培养基中,25113ΔfrmA/pZWM1-13号突变株较原始菌株25113ΔfrmA/pZWM1菌体生长量增加27.6%。对25113ΔfrmA/pZWM1-13号突变株进行13C示踪分析检测蛋白质合成氨基酸,结果表明氨基酸中13C比例有明显提高。其中,甲硫氨酸13C标记含量增加7.236%。因此,定向进化有效地提高了基因工程大肠杆菌的甲醇利用效率。

研究报告

控制水稻叶形基因CLF1的图位克隆

邢豹,陈振华,张治国

2017, 33(9):  110-115.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0694

摘要 ( 279 )   HTML   PDF (2442KB) ( 486 )  

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分蘖、株高、植株形态是水稻理想株型的3个主要农艺性状。目前对水稻理想株型的分子调控机制认识还非常有限。而叶片形态建成是决定植株形态特征的主要因子,鉴定控制水稻叶片形态建成的关键基因至关重要。本研究通过筛选水稻突变体库,获得一份光合效率显著提高的突变体（curly leaf 1,clf1）,其形态学特征表现为叶片适度卷曲,经石蜡细胞学切片发现,突变体clf1近轴面的泡状细胞明显增多是导致叶片卷曲和光合效率提高的主要原因。利用图位克隆,将CLF1基因缩小在2个分子标记InDel51与InDel57之间,该区间包含44个基因。通过生物信息学分析,确定了LOC_OS02G45250为CLF1的候选基因。对LOC_OS02G45250基因进行测序,在clf1突变体中,LOC_OS02G45250基因的第六外显子缺失20 bp,造成编码产物提前终止。该基因与已报道的水稻卷叶基因Roc5（Rice outermost cell-specific gene5）为等位基因,Roc5编码产物为一个具有GL2类同源异型结构域的转录因子,不同于已报道的突变体oul1（对应于Roc5基因）,突变体clf1农艺性状表现优良,具有较大的生产应用潜力。

水稻核不育突变体gsl5花粉壁单糖组分研究

刘启明,陈振华,韩霄

2017, 33(9):  116-119.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0696

摘要 ( 252 )   HTML   PDF (1048KB) ( 296 )  

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水稻花粉壁在花粉发育、适应环境和授粉识别过程中具有重要作用。花粉壁的发育异常会导致水稻雄性不育。在水稻花粉壁发育过程中,胼胝质层形成、初生外壁沉积和孢粉素的生物合成是关键步骤。目前对花粉初生外壁胼胝质层的研究较多,但对于水稻花粉壁的单糖组分缺乏整体性研究。我们利用花粉胼胝质层缺失的水稻突变体gsl5与野生型进行比较,对花粉壁单糖组分进行了色谱分析,初步研究了胼胝质层缺失对水稻花粉外壁组分的影响。

黄花草木樨MoSOS1基因克隆及表达分析

黄坤勇,李杉杉,郭强,毛培春,田小霞,孟林

2017, 33(9):  120-130.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0364

摘要 ( 289 )   HTML   PDF (3352KB) ( 547 )  

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植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因SOS1是植物耐盐性必需的基因之一,在抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。以黄花草木樨叶片总RNA为模板,通过RT-PCR结合RACE方法克隆得到黄花草木樨MoSOS1基因全长序列,命名为MoSOS1。序列分析表明该基因全长为3 931 bp,开放阅读框（ORF）为2 874 bp,编码957个氨基酸,分子量为112.8 kD,等电点为5.31。TMHAM软件跨膜区的预测分析表明,黄花草木樨MoSOS1蛋白具有8个跨膜结构区域,N端和C端都位于细胞外。氨基酸序列分析表明,MoSOS1蛋白含有1个Na+/H+ Exchanger superfamily和一个cNMP（Cyclic nucleotide-monophosphate）结合位点以及1个CAP_ED（Catabolite gene activator protein-effector domain）superfamily结构域。生物信息预测显示,MoSOS1的编码蛋白为不稳定酸性蛋白,不存在信号肽,二级结构多为α-螺旋和无规则卷曲。荧光实时定量RT-PCR分析表明：随着NaCl浓度的增加,黄花草木樨地上部和根中MoSOS1基因表达水平呈增加趋势,根中表达量大于地上部,表明MoSOS1基因的表达受盐胁迫诱导和调节。

CRISPR/Cas9系统介导敲除CSN2基因奶山羊胎儿成纤维突变细胞的制备

贾启鹏,申培磊,张欢,张勇

2017, 33(9):  131-138.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0218

摘要 ( 339 )   HTML   PDF (4119KB) ( 338 )  

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旨在研究β-酪蛋白（β-casein,CSN2）对奶山羊泌乳性能的影响,利用CRISPR/Cas9系统敲除奶山羊胎儿成纤维细胞（GFFs）CSN2基因,为转基因动物模型构建提供核供体。针对CSN2第二号、八号外显子设计5个靶向CSN2基因sgRNA（T1、T2、T3、E1和E2）,与PX330-eGFP载体连接,构建PX330-eGFP-sgRNA敲除表达载体,经T7E I酶切实验评估敲除效率；选择第八号外显子敲除效率最高sgRNA,构建PX330-Neo-sgRNA敲除载体,将PX330-eGFP-sgRNA T 及PX330-eGFP-sgRNA E与PX330-Neo-sgRNA E组合转染细胞,经流式分选、G418药筛获得敲除CSN2基因细胞。Western blot测定转染细胞CSN2表达情况。测序结果表明各sgRNA均正确连入PX330表达载体中,T7E 1酶切实验表明sgRNA T1、sgRNA E2敲除效率最高达34.9%和25.9%；经荧光定量PCR及免疫荧光检测结果表明,eGFP+Neo转染组CSN2敲除细胞比例显著高于eGFP+eGFP转染组（P<0.05）。综上表明,CRISPR/Cas9系统可有效应用于奶山羊胎儿成纤维细胞基因编辑,产生的突变细胞为制备CSN2基因敲除奶山羊提供核供体材料。

Osa在果蝇卵巢生殖干细胞分化中的功能研究

李敏,瞿杰,李梦婕,胡晓龙

2017, 33(9):  139-144.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0289

摘要 ( 279 )   HTML   PDF (3181KB) ( 246 )  

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果蝇卵巢生殖干细胞（Germline stem cell,GSC）是在活体（in vivo）研究干细胞命运调控的理想平台。表观遗传机制在果蝇卵巢GSC命运调控中发挥重要作用,其机理的探明需要研究并发现更多参与此过程的表观调控因子。为探究果蝇染色质重塑复合物BAP中特有的亚基Osa在果蝇卵巢GSC分化调控中的功能及其分子机理,利用GAL4/UAS二元表达系统结合RNAi技术在干细胞微环境组分护卫细胞（Escort cells,ECs）中特异性下调osa的表达,并通过免疫荧光染色法对相关指标进行检测。结果显示,敲减ECs中osa可致卵巢组织卵原区中未分化生殖细胞数目（Undifferentiated germ cells,UGCs）显著增多,同时BMP信号通路激活标志pMad、Dad-lacZ阳性细胞数目显著增多,并观察到EC细胞形态异常,不能有效包裹生殖系细胞。推论Osa以BMP信号通路依赖方式参与果蝇卵巢GSC的分化调控,其作用机理还可能涉及EC细胞特定的形态学过程。

利用“移树养苗”策略挖掘粤蓝链霉菌隐性活性次级代谢产物

林海州, 陈洲琴 王燕 郭俊 朱红惠 邓名荣

2017, 33(9):  145-152.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0276

摘要 ( 278 )   HTML   PDF (2551KB) ( 388 )  

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利用适当的策略激活粤蓝链霉菌中潜在的隐性次级代谢途径,以期获得新的活性物质。以粤蓝链霉菌突变株DMR1为研究对象,该突变株的主导产物榴菌素的关键生物合成基因gra-orf1-3被敲除,不能产生榴菌素。通过改变营养条件、添加诱导物和热激等方法处理菌株,利用琼脂糖扩散法及TLC-生物显影等方法检测发酵粗提物的抑菌活性。结果显示,突变株DMR1的高氏一号和ISP3培养基发酵粗提物对枯草芽孢杆菌ATCC6633、金黄色葡萄球菌ATCC6538以及耐药的金黄色葡萄球菌ATCC43300和206具有显著抑菌活性；添加3% DMSO诱导后,高氏一号和ISP3培养基的发酵粗提物不仅对上述菌株的抑制活性增强,还具有抑制大肠杆菌ATCC8739、白色念珠菌ATCC10231以及多株耐药菌大肠杆菌和沙门氏菌的活性。粤蓝链霉菌中新发现的活性物质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌具有广泛的抗菌活性,且部分发酵粗提物对所有测试的耐药菌均具有显著活性,有可能是新型的抗生素。结果也表明“移树养苗”策略能够提高隐性活性次级代谢产物的挖掘效率。

新型抗真菌活性物质农抗N2粗提物对水稻种子萌发的影响

吴志明,钟敏,鹿承建,朱曼宁,杜起风,李昆太,

2017, 33(9):  153-159.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0337

摘要 ( 235 )   HTML   PDF (2270KB) ( 380 )  

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为探究不同浓度新型广谱农抗N2粗提物对水稻种子萌发的影响及作用机制,采用紫外-可见分光光度法考察了农抗N2粗提物浸种对水稻种子多项萌发指标、淀粉酶活力、可溶性总糖、可溶性蛋白及丙二醛含量的影响。结果表明：农抗N2粗提物对水稻种子萌发的作用主要表现为低浓度促进,高浓度抑制。0.23-1.15 μg/mL农抗N2粗提物浸种均能有效增强种子活力,促进胚芽和胚根的生长,尤以0.58 μg/mL处理组效果最佳；此外,淀粉酶总活力、可溶性总糖和蛋白质含量相较CK分别提高了28.27%、7.73%与6.49%,且差异显著；同时,相比CK处理组,农抗N2粗提物浸种能显著降低种子中丙二醛的含量。因此,适宜浓度农抗N2粗提物浸种有利于促进水稻种子萌发,提高物质代谢能力,增强水稻种子的渗透调节与组织保护能力。

侧孢短芽孢杆菌A60的筛选及其对辣椒疫霉的室内防效测定

郝楠,仝赞华,邱德文

2017, 33(9):  160-165.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0210

摘要 ( 319 )   HTML   PDF (1598KB) ( 466 )  

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采用平板对峙法对分离自海南43份土样的700余株细菌进行筛选,获得一株对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）具有高效抑制活性的拮抗菌A60,根据形态特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析鉴定其为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）。分别在辣椒和甜椒上进行室内防效测定,结果表明,加入拮抗菌A60的辣椒,在第3天时未发病,对辣椒疫霉病的防效达100%,第5天时为95.71%,第7天仍可达到92.22%；加入拮抗菌A60的甜椒,在第3天时未发病,防效达100%,第5天时为75.26%,第7天仍达73.20%,说明拮抗菌A60能够明显的降低发病率和病情指数,具有较好的防病持效性。

不同除草剂对青稞田野燕麦的防除及对青稞生长的影响

闫栋,罗振华,胡有良,汪军成,司二静,任盼荣,姚立蓉,李葆春,马小乐,孟亚雄,王化俊,

2017, 33(9):  166-171.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0341

摘要 ( 311 )   HTML   PDF (1352KB) ( 333 )  

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为筛选出高寒地区青稞田适宜的除草剂种类,明确不同除草剂对青稞生长、产量及品质的影响。采用单因素随机区组试验设计,研究甘南州高寒地区大田条件下爱秀、燕麦畏、大骠马3种常用除草剂对青稞田主要杂草野燕麦的防效以及对青稞品种黄青1号的生长、产量和品质的影响。3种药剂处理后田间杂草野燕麦株数明显降低,同时部分青稞苗有轻微发黄现象,但半月后可自行恢复正常。于野燕麦三叶期喷施爱秀,防除效果最佳,平均株防效达82%,平均鲜重防效达87%；燕麦畏土壤处理防除效果次之,大骠马防除效果较差。不同药剂处理后青稞株高、穗长、穗粒数、千粒重等均显著或极显著高于对照；爱秀、燕麦畏处理增产效果良好；不同药剂处理的青稞蛋白质含量、水分含量、淀粉含量变化不显著。总体看来爱秀处理对野燕麦的防除效果较好,并有较为明显的增产效应且对青稞的品质无显著影响,认为其是高寒地区青稞田较为适宜的除草剂类型。

小桐子转化酶基因家族的生物信息学分析及表达特性

王海波,辛胡,刘潮,唐利洲

2017, 33(9):  172-178.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0303

摘要 ( 260 )   HTML   PDF (2278KB) ( 279 )  

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转化酶是植物蔗糖代谢与抗逆性形成的关键酶。基于小桐子基因组数据,鉴定到16个小桐子转化酶基因,并对其系统进化、基因结构、理化性质、保守基序及表达特性进行了分析。结果表明,小桐子转化酶基因家族聚类为3个亚家族,中性/碱性转化酶α亚组与酸性转化酶基因包含6或7个外显子,β亚组包含4或5个外显子。同时,酸性转化酶N端都包含信号肽序列,且都鉴定到GH32家族保守的-NDPNG/A-与-MWECV/P-基序。qRT-PCR表达分析显示,JcC-INVD基因在小桐子子叶中表达量最高,而在根中表达量较低,且在叶中属于低温诱导基因。

番茄环纹斑点病毒Gn蛋白的原核表达及多抗血清制备

郑宽瑜,尚卫娜,张洁,郑雪,董家红

2017, 33(9):  179-183.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0242

摘要 ( 305 )   HTML   PDF (2049KB) ( 408 )  

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通过生物信息学预测,番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,TZSV）Gn蛋白为跨膜蛋白,有3个跨膜结构域,抗原表位预测发现非跨膜区包含有较高的抗原指数区域,因此选择Gn蛋白的非跨膜区进行原核表达及多抗血清制备。用特异性引物,通过RT-PCR从感染TZSV的番茄中扩增出部分Gn基因片段,将获得的片段构建到原核表达载体pET-30a中,获得原核表达载体pET-30a-Gn,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,高效诱导表达了40 kD融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/16 384。利用制备好的抗血清对感染TZSV的病样进行Western blotting 检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清特异性良好,可用于TZSV Gn相关的免疫反应实验。

3-（4-羟基苯基）丙酸在酿酒酵母中的生物合成

江晶洁,庄以彬,殷华,刘涛,刘少伟

2017, 33(9):  184-190.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0208

摘要 ( 448 )   HTML   PDF (2793KB) ( 426 )  

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3-（4-羟基苯基）丙酸（HPPA）是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶（FjTAL）、拟南芥来源的对香豆酰辅酶A连接酶（At4CL）,同时利用酿酒酵母BY4742自身来源的超长链烯酰辅酶A还原酶（ScTSC13）、硫酯水解酶,实现了在酿酒酵母中从头合成HPPA,产量约为70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸为前体、半乳糖诱导FjTAL过表达、30℃发酵培养72 h的条件下,约36%的酪氨酸转化生成对香豆酸；在以4 mmol/L 对香豆酸或咖啡酸为前体,半乳糖诱导At4CL过表达,同时利用酵母内源ScTSC13、硫酯水解酶,30℃发酵培养72 h的条件下,约94% 的对香豆酸被还原成HPPA,约91% 的咖啡酸被还原成3,4-二羟基苯丙酸（DHPPA）,为进一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基础。

紫外诱变驯化提高酿酒酵母木糖发酵的抑制物耐受性

张译之,苟敏,汤岳琴

2017, 33(9):  191-199.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0285

摘要 ( 264 )   HTML   PDF (1588KB) ( 391 )  

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利用驯化和紫外处理结合驯化的手段对一株木糖发酵工业菌株的抑制物耐受性进行提升。在反复批次培养过程中不断提高含9种抑制物的混合抑制物浓度,使细胞的生长和发酵逐渐适应高浓度抑制物环境,分离突变菌株并进行评价。紫外处理结合驯化比直接驯化能更有效的提升细胞对高浓度抑制物的耐受能力；通过突变菌株分离和筛选,获得3株抑制物耐受能力高于出发菌株的突变菌株,它们在抑制物浓度100%MI（甲酸 1 g/L,乙酸 3.5 g/L,乙酰丙酸 1.5 g/L,糠醛 1.5 g/L,5-羟甲基糠醛 1.5 g/L,丁香醛0.1 g/L,香草醛 0.1 g/L,松柏醛0.025 g/L,肉桂酸 0.025 g/L）条件下的木糖消耗率比出发菌株高出11.3%-23.2%。紫外诱变处理结合驯化过程可以有效提高酿酒酵母对混合抑制物的耐受性。

产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌构建与发酵测试

杨静,李庆刚,徐国栋,郑小梅,郑平,牟海津

2017, 33(9):  200-209.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0310

摘要 ( 368 )   HTML   PDF (3272KB) ( 398 )  

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O-乙酰高丝氨酸（OAH）是具有潜在工业应用价值的前体化合物,可用于制备高丝氨酸与蛋氨酸等。以一株改造自苏氨酸产生菌的Escherichia coli ThrL为出发菌株,过表达OAH合成途径中的关键酶高丝氨酸脱氢酶基因thrA和高丝氨酸乙酰基转移酶基因metX,并利用不同强度的启动子组合优化这两个基因的表达水平,通过发酵培养基中的苏氨酸和酵母粉的浓度优化以提升OAH的产生菌株的生产性能。通过启动子组合优化结果发现,当thrA与metX均采用J23110启动子时,该重组菌株E.coli OAH4的OAH合成能力最强,摇瓶发酵50 h后,其OAH产量为1.54 g/L。当苏氨酸的浓度为2 g/L,酵母粉的浓度为6 g/L时,E. coli OAH4的发酵水平最高,摇瓶发酵50 h后,OAH的产量可进一步提升至1.98 g/L。本研究首次在E. coli中实现了OAH的合成,并通过发酵优化确定了OAH的最优发酵条件,为后续OAH生产应用研究奠定了基础。

毕赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病机理初探

罗琳,周泠璇,刘娅

2017, 33(9):  210-215.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0238

摘要 ( 313 )   HTML   PDF (2565KB) ( 444 )  

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针对新疆红提葡萄中分离的生防菌株——毕赤酵母G5,以葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）为靶标菌,研究了G5对葡萄灰霉菌孢子及对葡萄果实内5种关键酶活性的影响,初步探讨了G5拮抗葡萄采后灰霉病的机理。采用离体（in vitro）实验与活体（in vivo）实验的方法对毕赤酵母菌G5拮抗葡萄灰霉病的机理进行探究。结果发现,毕赤酵母菌株G5对葡萄灰霉菌孢子的萌发和菌丝生长均有抑制作用,对灰霉菌丝的抑制率最高为80.20%,对灰霉孢子抑制率达86.89%；两者间存在营养竞争关系,有重寄生现象产生,拮抗菌自身并不分泌抗菌物质。此外,该菌株能诱导果实体内过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的酶活性,使其酶活性有显著提高,说明毕赤酵母G5可以有效的诱导果实内抗病相关酶的活性,增强对灰霉病的抑制效果。毕赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病的机理主要包括营养竞争、诱导抗病性,是否有重寄生作用还需要进一步验证。

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

刘雁霞,李少杰,樊振川

2017, 33(9):  216-222.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0258

摘要 ( 279 )   HTML   PDF (3818KB) ( 290 )  

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构建pET-28a（+）-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入pET-28a（+）原核表达载体,并转入E. coli BL21（DE3）感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了pET-28a（+）-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6 × His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。

解淀粉芽孢杆菌AF1发酵液的抗菌活性与抗菌机理

杨艳红,余瑛,胡永强,余溪,李青青

2017, 33(9):  223-230.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0312

摘要 ( 316 )   HTML   PDF (3282KB) ( 302 )  

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测定解淀粉芽孢杆菌AF1发酵液的抗菌谱,对发酵液抗MRSA的活性稳定性及抗MRSA机制进行初步探究,为寻找新的抗MRSA化合物提供实验基础。以耐药金葡菌SA46为病原指示菌,不同pH、温度和蛋白酶处理后,考察AF1发酵液剩余抗菌活性。用显微镜和透射电镜观察经发酵液处理后的SA46形态变化,并用凝胶电泳分析SA46的蛋白质和DNA渗漏情况,初步探讨其抗菌机制。结果显示,AF1发酵液具有广谱抗菌活性：不仅对临床耐药金葡菌、一般临床大肠杆菌和金葡菌有很强抑菌作用,同时对大部分试验的植物病原菌也有较好抑菌作用。发酵液在pH 2.0-9.0,4-80℃,120 min后抗菌活性均保持95%以上；并且对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶稳定。SA46经发酵液（MIC）处理后,显微镜和透射电镜观察发现其细胞壁受到不同程度破坏；在DNA和蛋白质电泳图上,试验组SA46的DNA和蛋白质条带很清晰,即SA46蛋白质和DNA出现渗漏,而对照组均没有条带出现,初步推断AF1对MRSA的抗菌机理是破坏病原菌的细胞壁来抑制细胞生长的。菌株AF1可作为抗MRSA药物研发的潜在新来源。

冻干保护剂对假单胞菌菌粉存活率的影响

李丽,赵彭年,朱希坤

2017, 33(9):  231-234.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0215

摘要 ( 340 )   HTML   PDF (1320KB) ( 468 )  

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保护剂的添加对提高假单胞菌冷冻干燥菌粉的存活率和贮藏稳定性有显著效果。设计实验对冻干保护剂进行筛选和优化研究,通过单因素实验和正交实验筛选出了最佳保护剂组合：脱脂乳粉10%,山梨醇3%,甘油1%,L-抗坏血酸钠2%,假单胞菌冻干后的存活率可达90%,菌粉25℃存放6个月,存活率为50.2%。

转录组分析棒状链霉菌F613-1高产克拉维酸的分子基础

覃荣活,付加芳,宗工理,王志宇,曹广祥,

2017, 33(9):  235-243.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0275

摘要 ( 269 )   HTML   PDF (2560KB) ( 435 )  

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旨在探究S. clavuligerus工业菌株高产克拉维酸（CA）的分子基础。采用转录组高通量测序,对比标准菌株和高产CA的工业菌株F613-1之间的基因转录水平差异,结合菌株表型差异进行综合分析。结果表型比较显示,F613-1在固体培养基中生长速度、气生菌丝形态、孢子形成等方面与标准菌株存在差异。液体摇瓶培养中,菌体生长速度无明显变化,但F613-1的糖消耗量显著降低,同时CA产量比ATCC27064提高约11.7倍。转录组分析显示,F613-1中CA基因簇及其途径特异性调控基因的表达量显著升高,其副产物全霉素基因簇的表达量显著下降；CA合成原料精氨酸和3-磷酸甘油醛代谢相关基因的转录水平发生显著变化,精氨酸合成代谢基因上调,而3-磷酸甘油醛分解代谢基因下调；ABC转运系统中80多个基因的转录水平也发生明显变化,其中42个显著上调,38个显著下调。工业生产菌株高产克拉维酸的主要原因是CA基因簇及其调控基因表达量的升高、相关副产物基因簇的沉默及CA合成原料精氨酸和3-磷酸甘油醛的积累。

食神鞘氨醇杆菌（Sphingo spiritivorum）肝素酶的制备和性质研究

尹思远,白佳珂,李锂,马小来

2017, 33(9):  244-251.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1162

摘要 ( 290 )   HTML   PDF (2914KB) ( 530 )  

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筛选新型肝素酶产生菌,制备新型肝素酶并对其降解肝素能力进行测试。采用定向富集方法对土壤中的菌群进行培养,筛选分离产肝素酶的新种菌株,利用微生物发酵和蛋白纯化技术制备肝素酶,考察新型肝素酶的理化性质和酶切位点,之后使用新型肝素酶降解肝素并测试产物特征。筛选分离得到1株新的肝素酶产生菌,属食神鞘氨醇杆菌（Sphingo spiritivorum）。发酵后得到的粗酶,经多步柱层析纯化后得到的新型肝素酶SShepI和SShepII,用得到的酶降解肝素得到两种新型酶制低分子肝素。利用食神鞘氨醇杆菌中分离纯化得到的两种新型肝素酶SShepI和SShepII制备的新型酶制低分子肝素,有望开发成抗凝血效果更佳或具有新临床功能的低分子肝素药物。

大肠杆菌可溶性表达人鳞状上皮细胞癌抗原的制备及应用

陈春野,刘剑,朱瑞,李姝璇,叶江辉,王玮,潘德全,徐飞海,程通,夏宁邵

2017, 33(9):  252-258.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0228

摘要 ( 263 )   HTML   PDF (2705KB) ( 375 )  

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旨在建立基于大肠杆菌表达系统的高效可溶性表达人鳞状上皮细胞癌抗原（SCCAg）方法,获得具有较好活性的重组SCCAg抗原并应用于建立抗原检测方法。基于pGEX-6P-1载体和大肠杆菌E. coli ER2566菌株开展重组SCCAg抗原可溶性表达纯化方法研究,评价纯化抗原活性,筛选特异性单克隆抗体,初步建立并评价SCCAg抗原检测方法。结果显示,pGEX-6P-1载体和E. coli ER2566菌株可用于建立较高效的可溶性表达和纯化SCCAg抗原的方法,获得了具有较高纯度和活性的重组SCCAg抗原,筛选获得特异性单克隆抗体并初步建立了SCCAg管式化学发光检测方法。建立了有效的基于大肠杆菌表达系统的可溶性表达和纯化SCCAg的方法。

慢病毒介导沉默PD-L1基因在乳腺癌细胞中的表达

欧阳婧,孙园园,唐泽民,唐政山,李放军,杨寅柯

2017, 33(9):  259-266.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0181

摘要 ( 297 )   HTML   PDF (3230KB) ( 304 )  

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构建含细胞程序性死亡因子配体1（PD-L1）基因的慢病毒载体三质粒体系,并检测其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达情况。pMAGic 7.1慢病毒表达载体与质粒△8.91和pVSVG用聚乙烯亚胺（PEI）共转293T包装病毒,感染并筛选获得MDA-MB-231稳转细胞系,检测PD-L1表达情况。（1）MDA-MB-231在3种乳腺癌细胞中PD-L1表达量最高；（2）三质粒转染293T细胞48 h后荧光强度增强,达到90%以上；用病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h获得20%左右荧光强度；（3）经筛选的MDA-MB-231稳转细胞系在mRNA水平和蛋白水平低表达PD-L1,其中由pMAGic-sh1包装的病毒干扰能力最强；（4）分别加入病毒后,干扰组细胞增殖能力下降,pMAGic-sh1干扰组细胞在加入病毒7 d后生长速度约为阴性对照的64.77%；（5）混合淋巴实验显示,sh-1干扰组的肿瘤抑制率为35.8%,是正常组的3.06倍,且干扰组的T淋巴细胞活性显著增强。成功通过PEI转染试剂建立了三质粒慢病毒包装体系,该体系获得的慢病毒可有效干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中PD-L1的表达量,所得的干扰细胞株细胞增殖能力下降,可增强T细胞增殖活性及肿瘤细胞杀伤活性。

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2017, 33(9):  300. 

摘要 ( 131 )   HTML   PDF (1554KB) ( 126 )  

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2017, 33(9):  400. 

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2017, 33(9):  500. 

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