粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0258

生物技术通报 ›› 2017, Vol. 33 ›› Issue (9): 216-222.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0258

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

刘雁霞¹,李少杰²,樊振川¹

1. 天津科技大学大健康生物技术研究所天津市大健康生物技术国际联合研究中心天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457；
2. 中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室,北京 100101

收稿日期:2017-04-01 出版日期:2017-09-01 发布日期:2017-09-15
作者简介:刘雁霞,女,硕士,研究方向：大健康生物技术；E-mail：liuyanxia@mail.tust.edu.cn
基金资助:
国际遗传工程与生物技术中心联合研究项目（CRP/CHN15-01）

Prokaryotic Expression,Purification and Polyclonal Antibody Preparation of Neurospora crassa ERG-11 Protein Antigen

LIU Yan-xia¹,LI Shao-jie²,FAN Zhen-chuan¹

1. Institute of Health Biotechnology,International Collaborative Research Center for Health Biotechnology,College of Food Science and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457；
2. State Key Laboratory of Mycology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing 100101

Received:2017-04-01 Published:2017-09-01 Online:2017-09-15

摘要/Abstract

摘要： 构建pET-28a（+）-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入pET-28a（+）原核表达载体,并转入E. coli BL21（DE3）感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了pET-28a（+）-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6 × His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。

关键词: 粗超脉孢菌ERG-11基因, 克隆, 蛋白表达及纯化, 多克隆抗体

Abstract: This work aims to construct the recombinant plasmid pET-28a（+）-ERG-11 and express the 6 × His-ERG-11 fusion protein for preparing ERG-11 polyclonal antibody. The target fragment amplified by PCR was inserted into pET-28a（+）prokaryotic expression vector,and then transformed into the competent cells of Escherichia coli BL21（DE3）for expressing the fusion protein. Further,the fusion protein was purified by affinity purification and gel filtration chromatography,and then immunized to New Zealand white rabbit for preparing polyclonal antibody. Taking serum,the titer and specificity of the polyclonal antibody were detected through indirect ELISA and Western blot,respectively. As results,the pET-28a（+）-ERG-11 expression vector was successfully constructed. SDS-PAGE showed that the 6 × His-ERG-11 fusion protein was induced successfully in the inclusion form. After two-step purification,the antigen with high purity was obtained. ELISA showed that the polyclonal antibody titer reached 1∶512 000,and Western blot confirmed its high specificity. Conclusively,the prokaryotic expression of ERG-11 gene was successfully conducted,and a polyclonal antibody against Neurospora crassa ERG-11 was prepared,providing a foundation for further study on the genetic structure and function of ERG-11 in N. crassa.

Key words: Neurospora crassa ERG-11, cloning, protein expression and purification, polyclonal antibody

刘雁霞,李少杰,樊振川. 粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备[J]. 生物技术通报, 2017, 33(9): 216-222.

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粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

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