兰州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息学分析

摘要/Abstract

摘要：

克隆兰州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶MAPK13基因，并分析其序列及其编码蛋白的生物学特性，为研究绵羊MAPK13基因的功能和生产应用提供参考。根据绵羊MAPK13基因CDS序列设计特异引物，利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因全长序列，并结合生物信息学方法分析其生物学特性。克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因cDNA 序列全长1 397 bp，其CDS区片段长1 102 bp，编码367个氨基酸。预测兰州大尾羊MAPK13蛋白分子量为42.29 kD，理论等电点为8.82，为非跨膜的疏水性蛋白，亚细胞定位主要在细胞质中，无信号肽，不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有19个磷酸化位点，3个糖基化位点，3个磷酸化功能结构域，4个其他结构域，1个LCR片段，二级结构以α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13 mRNA序列（登录号：NM_001139455.1）相比，其第852位发生碱基转换（CA），导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换（ST），同时，第951位发生碱基转换（TG），但其所编码氨基酸不变。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。兰州大尾羊与其他物种MAPK13基因在结构上相似性较高，说明该基因具有高度的保守性，其序列包含的S_TKc结构域可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上，导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化，为进一步研究MAPK13基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。

关键词: 兰州大尾羊, MAPK13基因, cDNA, 末端快速扩增, 生物信息学

Abstract:

The objective of this study is to reveal the biological function of mitogen-activated protein kinases（MAPK）gene in sheep and provide theoretical data for application by cloning MAPK and analyzing its sequence as well as genetic features. The specific primers on the CDS template of MAPK13 gene were designed and then the MAPK13 gene sequence of Lanzhou fat-tail sheep was cloned using RACE and RT-PCR technology. After that, its genetic characteristics were analyzed by bioinformatics methods. The 1 397 bp full-length cDNA of MAPK13 of Lanzhou fat-tailed sheep was obtained, in which the length of CDS is 1 102 bp. It encodes 367 amino acids in total. It was predicted that the molecular weight of MAPK13 protein of Lanzhou fat-tail sheep is 42.29 kD and its theoretical isoelectric point is 8.82. It is a non-transmembrane hydrophobin with no signal peptide, which locates mostly in cytoplasm by the result of subcellular level prediction and does not belong to the secretory protein. Its amino acid sequence contains 19 phosphorylation sites, 3 glycosylation sites, 3 phosphorylation domains, 4 other domains and 1 LCR domain. Also, its secondary structure is mainly randomly curly. Nucleotide sequence analysis revealed that the gene nucleotide sequence of Lanzhou fat-tail sheep has some different from the known sheep MAPK13 mRNA（Genbank No.：NM_001139455.1）. Base transition occur in the 852th site is（C vs. A）, respectively, the corresponding amino acids in the 265th is（S vs. T）. Base transition occur in the 951th site is（T vs. G）, but the corresponding amino acids do not change.The phylogenetic tree indicates that Lanzhou fat-tail sheep is close to bos. The fact that the structure of MAPK13 of Lanzhou fat-tail sheep highly similar with other species indicates that the gene is highly conservative. The S_TKc domain in the sequence can transfer the gamma phosphoryl of ATP to the serine / threonine residues of protein, leading to function imbalance and expression change in a series of obesity related gene.

Key words: Lanzhou fat-tailed sheep, MAPK13 gene, RACE, Bioinformatics analysis

金方园, 徐红伟, 达小强, 臧荣鑫, 柏家林, 曹忻, 蔡勇, 冯玉兰, 杨具田. 兰州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息学分析[J]. 生物技术通报, 2014, 0(8): 94-101.

Jin Fangyuan, Xu Hongwei, Da Xiaoqiang, Zang Rongxin, Bai Jialin, Gao Xin, Cai Yong, Feng Yulan, Yang Jutian. Cloning and Bioinformatics Analysis of MAPK13 Gene in Lanzhou Fat-tailed Sheep[J]. Biotechnology Bulletin, 2014, 0(8): 94-101.

参考文献

［1］范衡宇, 佟超, 孙青原. 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的研究进展［J］. 动物学杂志, 2002, 37（5）：98.
［2］刘玉鲲, 李德全. MAPK级联途径调控植物细胞胞质分裂［J］.中国生物化学与分子生物学报, 2008, 24（12）：1085-1091.
［3］赵芳, 孙莹璞. MAPK信号转到通路及其在脂肪细胞分化中的作用［J］. 国际生殖健康/计划生育杂志, 2009, 28（5）：301-304.
［4］夏吉鹏, 张永升, 孟圣杰, 等. 濒危物种兰州大尾羊调查分析［J］. 中国科技论文在线http：//www.paper.edu.cn, 2006, 5.
［5］丁绍殿, 吴筱华, 李性明. 兰州大尾羊调查报告［J］. 中国畜牧杂志, 1986, 1：20-21.
［6］Cohen P. The search for physiological substrates of MAP and SAP kinases in mammalian cells［J］. Trands Cell Biol, 1997, 7（2）：353-361.
［7］Emanuelli B, Eberle D, Suzuki R, et al. Overexpression of the dual-specificity phosphatase MKP-4/DUSP-9 protects against stress-induced insulin resistance［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105（9）：3545-3550.
［8］Bost F, Aouadi M, Caron L, et al. The extracellular signal-regulated kinase isoform ERK1 is specifically required for in vitro and in vivo adipogenesis［J］. Diabetes, 2005, 54（2）：402-411.
［9］吕雯, 卢荣胜, 李捷. MAPK信号通路对脂肪细胞分化的调控［J］. 动物医学进展, 2012, 33（3）：110-114.
［10］Haridas Nidhina PA, Poulose N, Gopalakrishnapillai A. Vanillin induces adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells by activating extracellular signal regulated kinase 42/44［J］. Life sci, 2011, 88（15-16）：675-680.
［11］Chung S, Brown JM, Provo JN, et al. Conjugated linoleic acid promotes human adipocyte insulin resistance through NFκB-dependent cytokine production［J］. J Biol Chem, 2005, 280（46）：38445-38456.
［12］Bordicchia M, Liu DX, Amri EZ, et al. Cardiac natriuretic peptides act via p38 MAPK to induce the brown fat thermogenic program in mouse and human adipocytes［J］. J Clin Invest, 2012, 122（3）：1022-1036.
［13］Moule SK, Denton RM, et al. The activation of p38 MAPK by the β-adrenergic agonist isoproterenol in rat epiddymal fat cells［J］. University Bristol, 1998, 439（3）：287-290.
［14］Sun C, Wang L, Yan J, et al. Calcium ameliorates obesity induced by high-fat diet and its potential correlation with p38 MAPK path-way［J］. Molecular Biology Reports, 2012, 39（2）：1755-1763.
［15］Yoon MJ, Lee GY, Chung JJ, et al. Adiponectin increases fatty acid oxidation in skeletal muscle cells by sequential activation of AMP-activated protein kinase, p38 mitogen-activated protein kinase, and peroxisome proliferator-Activated Receptor α［J］. Diabetes, 2006, 55（9）：2562-2570.
［16］徐红伟, 柏家林, 冯玉兰, 等. 兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因克隆及其同源性比较［J］. 中国农业科学, 2013, 46（3）：639-646.
［17］薛霖莉, 董常生, 赫晓燕, 等. 羊驼垂体催乳素（PRL）基因全长cDNA的克隆及序列分析［J］. 中国农学通报, 2011, 27（1）：356-361.
［18］Wilkins MR, Gasteiger E, Bairoch A, et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server［J］. Methods Mol Biol, 1999, 112：531-552.
［19］Geourjon C, Deleage G. SOPM：a self-optimized method for protein secondary structure prediction［J］. Protein Eng, 1994, 7：157-164.
［20］Tyagi N, Srinivasan N, et al. Recognition of nontrivial remote homology relationships involving proteins of Helicobacter pylori：implications for function recognition［J］. Methods in Molecular Biology, 2013, 993：155-175.
［21］Moller S, Croning MD, Apweiler AR. Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions［J］. Bioinformatics, 2001, 17（7）：646-653.
［22］Zhang B, Huang K, Guo J, et al. Origin and the recombinant model of H7N9 virus prevailing in China［J］. Nan Fang YiKe Da Xue Xue Bao, 2013, 33（7）：1017-1021.
［23］邹先琼. 人类基因C4orf13、CDK5RAP1_v3、CDK5RAP1_v4和PXK的克隆和功能研究［D］. 广州：中山大学, 2005.
［24］梁聪, 彭景琨, 曹广力, 等. 家蚕hop基因的克隆及序列分析［J］. 江苏农业科学, 2012, 40（1）：10-13.
［25］Rudack T, Xia F, Schlitter J. Ras and GTPase-activating protein（GAP）drive GTP into a precatalytic state as revealed by combining FTIR and biomolecular simulations［J］. Proc Natl Sci USA, 2012, 109（38）：15295-15300.
［26］Yamakawa N, Tsuchida K, Sugino H. The rasGAP-binding protein, Dok-1, mediates activin signaling via serine/threonine kinase receptors［J］. EMBO J, 2002, 21（7）：1684-1694.
［27］孙琰, 叶棋浓. Smad4蛋白的研究进展［J］. 生物技术通讯, 2005, 16（3）：299-302.
［28］罗森. 抗糖尿病药通过Cdk5抑制肥胖相关的PPARγ磷酸化［J］. 中国病理生理杂志, 2010, 446（7305）：451-456.
［29］李咏, 杨俊卿. PPARγ——中枢神经系统损伤治疗的新靶点［J］.中国老年学杂志, 2009（18）：2405-2407.

[1]	王子颖, 龙晨洁, 范兆宇, 张蕾. 利用酵母双杂交系统筛选水稻中与OsCRK5互作蛋白[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 117-125.
[2]	温晓蕾, 李建嫄, 李娜, 张娜, 杨文香. 小麦叶锈菌与小麦互作的酵母双杂交cDNA文库构建与应用[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 136-146.
[3]	韩浩章, 张丽华, 李素华, 赵荣, 王芳, 王晓立. 盐碱胁迫诱导的猴樟酵母cDNA文库构建及CbP5CS上游调控因子筛选[J]. 生物技术通报, 2023, 39(9): 236-245.
[4]	张路阳, 韩文龙, 徐晓雯, 姚健, 李芳芳, 田效园, 张智强. 烟草TCP基因家族的鉴定及表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 248-258.
[5]	李敬蕊, 王育博, 解紫薇, 李畅, 吴晓蕾, 宫彬彬, 高洪波. 甜瓜PIN基因家族的鉴定及高温胁迫表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(5): 192-204.
[6]	郭三保, 宋美玲, 李灵心, 尧子钊, 桂明明, 黄胜和. 斑地锦查尔酮合酶基因及启动子的克隆与分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 148-156.
[7]	王艺清, 王涛, 韦朝领, 戴浩民, 曹士先, 孙威江, 曾雯. 茶树SMAS基因家族的鉴定及互作分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 246-258.
[8]	杨岚, 张晨曦, 樊学伟, 王阳光, 王春秀, 李文婷. 鸡 BMP15 基因克隆、表达模式及启动子活性分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(4): 304-312.
[9]	陈强, 邹明康, 宋家敏, 张冲, 吴隆坤. 甜瓜LBD基因家族的鉴定和果实发育进程中的表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(3): 176-183.
[10]	平怀磊, 郭雪, 余潇, 宋静, 杜春, 王娟, 张怀璧. 滇牡丹PdANS的克隆、表达及与花青素含量的相关性[J]. 生物技术通报, 2023, 39(3): 206-217.
[11]	邢媛, 宋健, 李俊怡, 郑婷婷, 刘思辰, 乔治军. 谷子AP基因家族鉴定及其对非生物胁迫的响应分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(11): 238-251.
[12]	陈楚怡, 杨小梅, 陈胜艳, 陈斌, 岳莉然. ABA和干旱胁迫下菊花脑ZF-HD基因家族的表达分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(11): 270-282.
[13]	杨敏, 龙雨青, 曾娟, 曾梅, 周新茹, 王玲, 付学森, 周日宝, 刘湘丹. 灰毡毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因克隆及功能研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 256-267.
[14]	郭志浩, 金泽鑫, 刘琦, 高利. 小麦矮腥黑粉菌效应蛋白g11335的生物信息学分析、亚细胞定位及毒性验证[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 110-117.
[15]	于秋琳, 马婧怡, 赵盼, 孙鹏芳, 何玉美, 刘世彪, 郭惠红. 绞股蓝GpMIR156a和GpMIR166b的克隆与功能分析[J]. 生物技术通报, 2022, 38(7): 186-193.