生物技术通报

乔新荣, 段鸿斌, 叶兆伟

2014, 30(8): 1-7.

摘要 ( 291 )

PDF (1028KB) ( 1190 )

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向光素（phototropin，PHOT）是继光敏色素、隐花色素之后分离的植物蓝光受体。PHOT介导蓝光诱导的向光反应，叶绿体运动，气孔开放、叶片伸展及叶片定位等生理反应。近年来关于PHOT受体介导这些生理反应的分子机制探讨愈来愈受研究者的广泛关注。主要从拟南芥PHOT结构及信号转导方面的研究进展进行综述。

逆境胁迫下植物表观遗传机制的研究进展

冉莉萍, 孔月琴, 方婷婷, 王幼平

2014, 30(8): 8-15.

摘要 ( 250 )

PDF (1035KB) ( 1006 )

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植物着地固定生长不能主动逃避外界危害，只能依靠自身的一些响应机制来防御外界胁迫，表观遗传调控在这个响应机制中起着重要的作用，主要表现在DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及非编码RNA。植物在遭受低温、高温、干旱、盐、重金属、病毒及激素等因素胁迫后，通过调节抗逆相关基因的表达来响应外界危害。综述表观遗传修饰在各种胁迫下的调控机制，为作物的抗逆研究提供理论依据。

植物蛋白磷酸酶2C在非生物胁迫信号通路中的调控作用

杜驰, 张富春

2014, 30(8): 16-22.

摘要 ( 234 )

PDF (1222KB) ( 829 )

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植物在非生物胁迫下会产生一系列的形态、生理生化和分子水平上的适应性变化，尤其是非生物胁迫会引起植物体内的蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因表达的改变，从而诱导植物合成相关的蛋白以适应胁迫。植物中有不同类型的PP2C亚群，各种PP2C亚群能够通过不同的信号途径参与胁迫应答，因此在植物响应非生物胁迫的过程中发挥重要作用。综述了植物PP2C在非生物胁迫信号通路中的作用机制。

TAP亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用

张志飞, 赵志丽, 文昭竹

2014, 30(8): 23-27.

摘要 ( 245 )

PDF (1222KB) ( 1220 )

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串联亲和纯化法（TAP）是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术，已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复合物互作网络。近年来，随着TAP新型标签的不断出现以及与其他技术的联用，TAP技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。综述了TAP亲和标签选择，并介绍其在植物蛋白互作研究中的成功应用。

香蕉寒害研究现状及展望

王安邦, 金志强, 刘菊华, 贾彩红, 张建斌, 苗红霞, 徐碧玉

2014, 30(8): 28-33.

摘要 ( 242 )

PDF (1043KB) ( 1544 )

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我国绝大部分香蕉种植区域属于香蕉非最适宜种植区，容易受到冬春寒流的侵袭而造成重大经济损失。寒害已成为制约我国香蕉产业健康发展的主要灾害之一。对香蕉寒害症状和类型、香蕉抗寒生理生化研究、防寒措施、抗寒相关基因的挖掘等方面进行了综述，简述了香蕉寒害研究存在的问题和发展现状，以期对香蕉寒害的基础研究及生产应用提供参考。

绵羊黑色素合成相关基因的研究进展

孟浩浩, 许瑞霞, 代蓉, 李辉, 李良远, 万鹏程, 石国庆,

2014, 30(8): 34-39.

摘要 ( 195 )

PDF (1193KB) ( 875 )

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毛色是一种可利用的遗传标记。在确定杂交组合、品种纯度和亲缘关系以及评价产品质量等方面均有一定的用途。哺乳动物毛色是由黑色素细胞产生的真黑素和褐黑素二者的分布和比例决定的。控制哺乳动物毛色色素的基因有很多，着重对黑色素合成相关基因酪氨酸酶基因（TYR）、黑素皮质激素受体1基因（MC1R）、鼠灰信号蛋白基因（Agouti）、酪氨酸酶相关蛋白1基因（TYRP1）的生物学功能及其遗传变异机制进行了综述。

启动子结构和功能研究进展

王婧, 李冰, 刘翠翠, 朱阵, 张继瑜

2014, 30(8): 40-45.

摘要 ( 339 )

PDF (1420KB) ( 1057 )

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转录起始是一种最重要的表达调节方式，通过多种蛋白质与启动子的配位结合起始转录，参与基因的表达调控过程。而启动子作为基因表达调控的重要顺式作用原件，在原核和真核生物中均存在。对核心启动子结构特征中多种保守顺式调控原件及基本转录因子的结构和功能进行了阐述。

小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物

刘艳, 李冰清, 孟红

2014, 30(8): 46-51.

摘要 ( 274 )

PDF (1223KB) ( 1152 )

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小RNA病毒科是一类大的动物病毒科，小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多个结构蛋白和功能蛋白，3C蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，3C蛋白酶还可以裂解一些宿主的蛋白，利于病毒的复制。3C蛋白酶结构特点、活性中心、酶切位点如何，裂解的底物功能怎样，是进一步了解3C蛋白酶作用机制的关键。就这些问题进行综述。

对虾白斑综合症病毒极早期基因的研究进展

冉晓卓, 李钫

2014, 30(8): 52-58.

摘要 ( 265 )

PDF (1058KB) ( 861 )

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对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是危害对虾养殖业的主要病原之一。WSSV在侵染宿主细胞的过程中，极早期基因（immediate-early gene）对病毒复制增殖起着非常重要的作用。在这个过程中，一方面极早期基因编码的蛋白通过与细胞调控因子相互作用，调节细胞信号通路，为病毒的增殖提供更合适的环境；另一方面，极早期蛋白直接调控病毒基因的转录和表达。综述列举了WSSV的21个极早期基因，并将重点介绍其中5个研究比较深入的基因：ie1、wsv051、wsv083、wsv249和wsv403。

一种乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法

董传举, 张松皓, 陈坤慈, 宋迎楠, 徐鹏, 孙效文

2014, 30(8): 59-64.

摘要 ( 191 )

PDF (1731KB) ( 499 )

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为了高效的鉴别乌鳢与斑鳢，采用PCR-RFLP技术，对乌鳢与斑鳢开展分子生物学鉴定方法研究。通过比对乌鳢和斑鳢线粒体全序列，发现1处单核苷酸多态性位点，可以明确区分两个物种。利用1对引物对乌鳢与斑鳢线粒体基因组该区域进行PCR扩增，用限制性内切酶EcoR I分别对扩增产物进行酶切，并用1.5％的琼脂糖凝胶检测酶切结果。PCR-RFLP检测结果显示，斑鳢的PCR扩增产物被EcoR I酶切后生成两个不同大小的片段，分别为315 bp和875 bp，乌鳢则保持不变。由此可将乌鳢与斑鳢在酶切图谱上鉴别出来。

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

冯丹, 宁德鲁, 陈少瑜, 李勇杰, 张艳丽, 吴涛, 陈海云

2014, 30(8): 65-69.

摘要 ( 238 )

PDF (1391KB) ( 427 )

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利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物（UBC 886）、dNTP、Mg²⁺浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响，建立其最佳反应体系。结果表明：25 μL的反应体系中5个因子的最佳水平为：Mg²⁺ 3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸1 min，40次循环；72℃最后延伸7 min，4℃保存。

烟粉虱全基因组DNA四种提取方法的比较

戴恬美, 吕志创, 万方浩

2014, 30(8): 70-75.

摘要 ( 225 )

PDF (1410KB) ( 566 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

获得大量、高质量的全基因组DNA是在DNA水平上研究许多生物的分子机制的基本前提。微小昆虫由于其体型微小，单头提取DNA浓度低，无法满足部分试验所需。为寻找一种方便、快捷、高效的全基因组提取方法，参考国内外单头微小昆虫基因组DNA提取常用方法，以烟粉虱为研究材料，选取醋酸钾（KAc）法、盐析法、氯仿-异戊醇法和苯酚提取法四种方法进行多头烟粉虱的全基因组DNA提取。通过微量核酸蛋白分析仪、基因组DNA直接琼脂糖凝胶电泳、甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测，比较提取DNA的产量、质量，并综合分析各提取方法所需时间及所用试剂的毒性大小。结果表明，盐析法提取的DNA平均浓度为521 ng/μL，纯度能满足分子检测要求，用MSAP引物能得到较好的扩增结果，相比其它方法，盐析法更简便、快速且无毒。因此盐析法是多头烟粉虱全基因组DNA提取的最佳方法。

橡胶树转基因植株Southern杂交体系的优化

李季, 鲁旭, 黄天带, 华玉伟, 黄华孙

2014, 30(8): 76-81.

摘要 ( 184 )

PDF (1795KB) ( 659 )

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以地高辛标记的Southern杂交技术已广泛应用于多个物种中。选择橡胶树为材料，就基因组DNA的提取、探针标记方法的选择以及具体的杂交操作过程等方面对该体系进行了优化。结果表明，至少40 μg高质量的DNA在300 μL的大酶切体系中，酶切12 h可获得良好效果；PCR法标记的探针杂交条带清晰、背景浅，其效率明显强于随机引物法标记的探针。本研究优化的体系信号强、背景浅和灵敏度高，为橡胶树Southern杂交鉴定分析提供参考。

牦牛PAFR基因生物信息学分析及其在妊娠前后子宫中的表达

魏博, 潘阳阳, 禹尧, 田枫, 余四九

2014, 30(8): 82-88.

摘要 ( 222 )

PDF (2336KB) ( 552 )

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以牦牛血小板活化因子受体（Platelet-activating factor receptor，PAFR）基因为研究对象，采取西宁家养牦牛子宫为材料，采用RT-PCR技术克隆牦牛PAFR基因，对其进行生物信息学分析，并采用QRT-PCR方法定量检测PAFR在牦牛子宫不同时期的表达。结果表明，牦牛PAFR基因编码区长1 029 bp，编码342个氨基酸；氨基酸序列与黄牛同源性最高为99.7%，与非洲爪蟾蜍同源性最低为59.1%，表明PAFR氨基酸在进化过程中具有保守性；其编码蛋白的氨基酸序列有5个跨膜区域，推测其可能为跨膜蛋白；具有亲水性；未发现信号肽片段；含有G蛋白偶联受体家族结构域；QRT-PCR检测PAFR在牦牛子宫中表达，妊娠期最高，卵泡期最低，黄体期居中，揭示其与胚胎附植，妊娠维持有关。

牦牛不同组织TLR3、TLR5 mRNA 转录水平相对定量研究

陈亚冰, 兰道亮, 林宝山, 黄偲, 黄勇, 李键

2014, 30(8): 89-93.

摘要 ( 148 )

PDF (1971KB) ( 522 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

参考牦牛TLRs基因序列设计荧光定量PCR特异性引物，建立检测牦牛TLRs相对表达量的荧光定量PCR方法，分析TLR3及TLR5基因在牦牛不同器官组织中的转录水平。结果显示两基因具有不同的表达谱及表达量，其中TLR3基因除在乳腺组织外，在其它组织器官中均有转录，其中在心、大肠、胃和肌肉组织中表达量较高；TLR5基因则在心、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、卵巢组织中具有较高的表达量。该试验结果表明，TLRs在不同组织器官转录水平差异较大，可能与其对病原体的识别有关；同一个基因在不同组织中存在差异性，这可能与基因作用机理相关。

兰州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息学分析

金方园, 徐红伟, 达小强, 臧荣鑫, 柏家林, 曹忻, 蔡勇, 冯玉兰, 杨具田

2014, 30(8): 94-101.

摘要 ( 206 )

PDF (2302KB) ( 555 )

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克隆兰州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶MAPK13基因，并分析其序列及其编码蛋白的生物学特性，为研究绵羊MAPK13基因的功能和生产应用提供参考。根据绵羊MAPK13基因CDS序列设计特异引物，利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因全长序列，并结合生物信息学方法分析其生物学特性。克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因cDNA 序列全长1 397 bp，其CDS区片段长1 102 bp，编码367个氨基酸。预测兰州大尾羊MAPK13蛋白分子量为42.29 kD，理论等电点为8.82，为非跨膜的疏水性蛋白，亚细胞定位主要在细胞质中，无信号肽，不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有19个磷酸化位点，3个糖基化位点，3个磷酸化功能结构域，4个其他结构域，1个LCR片段，二级结构以α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13 mRNA序列（登录号：NM_001139455.1）相比，其第852位发生碱基转换（CA），导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换（ST），同时，第951位发生碱基转换（TG），但其所编码氨基酸不变。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。兰州大尾羊与其他物种MAPK13基因在结构上相似性较高，说明该基因具有高度的保守性，其序列包含的S_TKc结构域可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上，导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化，为进一步研究MAPK13基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。

重组人gdnf乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究

虞飞, 李斌, 张晶晶, 丁海麦, 张学明

2014, 30(8): 102-107.

摘要 ( 197 )

PDF (1986KB) ( 417 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

为了制备重组人GDNF牛乳腺生物反应器，采用组织块贴壁法分离培养雌性牛胎儿成纤维细胞，连续继代培养75 d，进行形态观察和染色体分析，在此基础上，转染带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双重筛选标记的重组人gdnf乳腺特异表达载体pNR-GDNF，G418筛选阳性抗性克隆，进行PCR法鉴定。结果表明，分离培养的牛胎儿成纤维细胞具有正常的形态、分裂增殖特性和染色体数目；目的基因已整合到转基因细胞的染色体上。

家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

魏川川, 修江帆, 王宇, 国果, 彭传林, 吴沁怡, 吴建伟

2014, 30(8): 108-112.

摘要 ( 223 )

PDF (1739KB) ( 552 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

对家蝇变应原原肌球蛋白（Tropomyosin）基因进行同源克隆，序列分析；构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板，进行PCR扩增，获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒，转化到大肠杆菌OrigamiB（DE3）中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp，编码275个氨基酸，理论分子量31.6 kD；等电点为4.65，具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。

利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

石萌, 刘小宁, 马纪

2014, 30(8): 113-119.

摘要 ( 309 )

PDF (2101KB) ( 820 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）基因的非抗冻功能进行验证，将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115（DE3）菌株，利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA，纯化后注射黄粉虫幼虫，通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA，命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后，Tmafps的表达受到显著抑制，相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。

尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽的cDNA克隆及真核表达载体的构建

刘晶晶, 陶妍, 文雅

2014, 30(8): 120-125.

摘要 ( 224 )

PDF (2126KB) ( 573 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

Hepcidin是一类由动物肝脏细胞表达，具有调节铁代谢功能并具有抗菌作用的小分子阳离子抗菌肽，富含半胱氨酸，它们在机体免疫系统中发挥了重要作用，被认为是抗生素的理想替代品。TH1-5属莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）3种Hepcidin cDNA序列中的一种。参考莫桑比克罗非鱼Hepcidin TH1-5的cDNA序列，以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏Hepcidin全长 cDNA为模板，通过PCR扩增到编码22个氨基酸的类似于TH1-5的尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽片段“mTH”；通过设计含Xba I和Xho I酶切位点以及信号肽酶切位点的引物，将目的片段成功连接至pGAPZ-A真核表达载体，并转化进毕赤酵母菌GS115。经鉴定，重组真核表达载体“pGAPZ-A-mTH”已被成功构建，目的片段已整合进酵母染色体中。

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

林波, 孟海玲, 吴勇, 邴晖, 长孙东亭, 罗素兰

2014, 30(8): 126-131.

摘要 ( 216 )

PDF (2010KB) ( 592 )

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表达、纯化静水椎螺（Lymnaea stagnalis）乙酰胆碱结合蛋白（Ls-AChBP）并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA 序列克隆到表达载体pFastBac1上，构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His，经重组子筛选，得到重组杆状病毒质粒Bacmid，采用CellfectinⅡ脂质体，把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid 转染到昆虫细胞中，经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体，并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化，结晶筛选得到晶体。

23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究

杨小岚, 陈玉婵, 李浩华, 章卫民

2014, 30(8): 132-137.

摘要 ( 239 )

PDF (1210KB) ( 844 )

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

从南海沉积物中分离得到23株海洋真菌，通过ITS测序进行鉴定。以新月弯孢霉（Curvularia lunata）、柱枝双胞霉（Cylindrocladium scoparium）、链格孢（Alternaria alternata）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）为受试植物病原真菌，以神经胶质瘤细胞（SF-268）、乳腺癌细胞（MCF-7）、大细胞肺癌细胞（NCI-H460）和肝癌细胞（HepG-2）为受试肿瘤细胞，分别采用生长速率法和SRB法对这些菌株的发酵液粗提物进行抗植物病原真菌和细胞毒活性测试，发现11个菌株的粗提物在浓度为50 mg/mL时，对至少1种受试植物病原真菌的抑制率在50%以上，有9个菌株的粗提物在浓度为100 μg/mL时，对至少1种肿瘤细胞株的抑制率在80%以上，其中菌株Eupenicillium sp. FS100、Penicillium sp. FS105、Dichotomomyces cejpii FS110、Acaromyces ingoldii FS121对植物病原真菌和（或）肿瘤细胞具有明显的抑制活性。

不同品种香蕉内生菌分离及广谱拮抗菌的筛选

王梦颖, 周登博, 井涛, 胡一凤, 高祝芬, 谢晴宜, 张锡炎, 戚春林

2014, 30(8): 138-145.

摘要 ( 194 )

PDF (1856KB) ( 526 )

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旨在探究抗病品种与易感品种香蕉的健康株和病株内生菌与其中广谱拮抗菌的主要分布规律，并对广谱拮抗菌进行拮抗活性的测定。以样品根、球茎、假茎、叶为材料分离培养内生菌，在实验室条件下，筛选对供试的10种香蕉致病菌均有良好拮抗活性的菌株并测定它们的拮抗活性，对活性最强的菌株进行形态学、16S rDNA序列同源性分析。结果显示，分离得到内生菌438株，其中细菌240株，放线菌142株，真菌56株。抗病品种南天黄病株中分离得到的内生菌最多，共计128株。内生菌数量在香蕉植株中的分布呈现规律为：根部>球茎部>假茎部>叶部。内生真菌在各香蕉种病株中的分布最广泛。筛选出具广谱活性的放线菌10株、细菌2株。其中内生放线菌菌株041的广谱拮抗活性最强，最大抑菌带宽为28.13±1.89 mm。对广谱拮抗内生放线菌菌株041、04-1、19-1、03A-1进行的形态学和16S rDNA序列分析表明，它们属于链霉菌属。

柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的筛选及其降解性能研究

徐晓宇, 陈敬华

2014, 30(8): 146-151.

摘要 ( 199 )

PDF (1863KB) ( 466 )

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从污水处理厂的活性污泥中分离到一株柴油降解菌，通过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，鉴定该菌为不动杆菌 Acinetobacter sp. AK5。检测了不同pH值、NaCl浓度、培养时间和各种柴油浓度下Acinertobacter sp. AK5的柴油降解情况。结果表明，该菌的最适生长初始pH值为5-9，适合NaCl浓度为3%-4%，柴油浓度为5 g/L时，该菌7 d柴油降解率可达99%，柴油浓度为20 g/L时，7 d柴油降解率也可达67%。AK5在人工海水培养基中及无机盐培养基中生长状态良好，在海水和淡水石油污染的生物修复中具有很好的应用前景。

紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究

曹淑慧, 周丽, 崔文璟, 刘中美, 周哲敏

2014, 30(8): 152-158.

摘要 ( 251 )

PDF (2353KB) ( 476 )

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来源于紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的苯丙氨酸羟化酶结构简单，性质更接近于人的苯丙氨酸羟化酶，具有潜在的医药应用价值。从紫色色杆菌基因组中克隆得到苯丙氨酸羟化酶基因pah。构建重组表达载体pET24a-pah，并在Escherichia coli BL21（DE3）中实现高效表达。离子层析纯化后，重组蛋白比酶活高达503.2 U/mg。酶学性质研究显示，该重组酶的最适温度为40℃左右，50℃时PAH的半衰期为15 min；最适pH在7.5左右，在pH6-8范围内较稳定。37℃，pH7.5条件下，K_m值为1.5 mmol/L，V_max为0.5 mmol/min，k_cat为5.05/s，催化效率k_cat/K_m 为3.37 L/mmol·s。

地衣芽孢杆菌高产2,3-丁二醇菌株的选育和发酵研究

郭文逸, 孙庆惠, 宋丽娜, 高松松, 杨洪江

2014, 30(8): 159-163.

摘要 ( 176 )

PDF (1623KB) ( 460 )

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目前2，3-丁二醇生产菌株大部分为致病菌，对人类健康和环境具有一定威胁。从牛奶样品中分离到1株产2，3-丁二醇的芽孢杆菌127-7，分析其16S rRNA基因序列，确定该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。进一步对菌株127-7进行紫外诱变，筛选耐受高浓度葡萄糖和高产乙偶姻的菌株。摇瓶发酵结果显示，突变株BL41的2，3-丁二醇产量较出发菌株127-7提高了41.1%。对发酵副产物分析发现，不控制发酵液pH可以显著降低乳酸产量，2，3-丁二醇产量在72 h达到81.4 g/L。进一步调整补糖策略，维持最低残糖浓度为30 g/L，菌株BL41产2，3-丁二醇83.4 g/L，最高产率为1.9 g/L·h，发酵时间缩短至46 h。结果表明，地衣芽胞杆菌BL41可以作为候选菌株，用于工业规模2，3-丁二醇的生产。

杉木炭疽病拮抗菌AM53的发酵条件优化

杨菁, 周国英, 谭益民, 路宗岩

2014, 30(8): 164-168.

摘要 ( 168 )

PDF (1576KB) ( 402 )

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旨在优化地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）AM53的发酵条件。通过Plackett-Burman试验筛选到影响AM53活菌数的重要因素为培养温度、初始pH、摇床转速。经最陡爬坡试验和Box-Behnken试验，获得AM53的最佳发酵条件为培养温度30.5℃，初始pH8，摇床转速185 r/min，接种量为5%，培养24 h。结果显示，在此条件下，OD₆₀₀平均为1.861，其值与预测值基本相符，说明该模型可信度高，可应用于AM53发酵条件优化。

响应面法优化解淀粉芽孢杆菌C101发酵培养基

梁昌聪, 郭立佳, 刘磊, 张建华, 杨腊英, 王国芬, 黄俊生

2014, 30(8): 169-174.

摘要 ( 234 )

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采用响应面法对解淀粉芽孢杆菌C101菌株产芽孢发酵培养基进行了优化。利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响产孢的3个主要因素：MnSO₄、KH₂PO₄和（NH₄）₂SO₄。在此基础上运用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域，最后利用响应面分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明，蔗糖20 g/L，尿素4.0 g/L，豆粕4.0 g/L，KNO₃ 2.0 g/L，Na₂HPO₄ 2.4 g/L，KH₂PO₄ 0.52 g/L，（NH₄） ₂SO₄ 0.55 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.50 g/L，FeSO₄ 0.005 0 g/L，MnSO₄ 0.005 4 g/L，C101最大理论芽孢含量为14.67×10⁸个/mL。经3次平行试验验证，实际平均芽孢含量与预测芽孢含量相近，比之前的芽孢含量提高了188%。

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

杨玉路, 王蕾, 陈晟, 吴敬

2014, 30(8): 175-181.

摘要 ( 218 )

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将来自于Bacillus circulans 251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b（+），转化Escherichia coli BL21（DE3）。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化，结果表明，当底物马铃薯淀粉浓度15%，反应初始pH5.5，温度30℃，加酶量10 U/g干淀粉，环己烷浓度2.5%-5%（V/V），转化周期24 h，β-环糊精转化率达到最高值75.3%，是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。

一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法

张西轩, 李晔, 张振奇, 董世瑞, 赵培, 阮海华

2014, 30(8): 182-188.

摘要 ( 324 )

PDF (2076KB) ( 998 )

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利用8 mol/L尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白进行变性，通过逐级稀释复性的方法对尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白进行复性，将复性后的GST-TRAF6融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法进行分离纯化，将分离纯化后的蛋白通过Western blot方法进行验证，最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3个步骤后纯化得到纯度达90%以上、浓度为396 ng/μL的蛋白质溶液。利用GST蛋白作为对照，经Western blot验证表明，纯化得到的蛋白确为GST-TRAF6融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现，17 ng/μL浓度的GST-TRAF6融合蛋白能够以泛素分子作为底物在5 min内快速催化自由泛素链的生成。结果表明，表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白经尿素变性溶解后能够成功复性并分离纯化，在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。

重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备

任艳娜, 才蕾, 武建伟, 钱伟, 张荣华, 王继华, 唐时幸

2014, 30(8): 189-195.

摘要 ( 388 )

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旨在为市场提供一种廉价、稳定、特异性强、灵敏度高的肌红蛋白质控品；将密码子优化后的肌红蛋白序列通过两步法进行化学合成，并连接到pET-28a表达载体上，转入大肠杆菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达；目的蛋白经Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析进行纯化后，对其特异性进行检测，并研究蛋白稀释液的配方和优化冻干工艺，最后对冻干质控品的稳定性进行检测；结果显示目的蛋白分子量大小为20 kD左右，具有较强的特异性。蛋白冻干后具有很好的形态，37℃可以稳定保存10 d；25℃、4℃可以稳定保存4个月以上。该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高，可用于定性定量肌红蛋白检测试剂盒的质控品。

肽类化合物对H₃₇Ra抑制的优化筛选

吴丛梅, 李玲玲, 关晓侠, 刘新涛, 陈吉, 殷玉和

2014, 30(8): 196-201.

摘要 ( 245 )

PDF (1590KB) ( 519 )

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通过抑菌试验，确定不同培养基条件下多肽化合物的抑菌效果，并测定其最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。加入Vc，比较抑菌效果，进一步优化筛选H₃₇Ra抑制剂。先根据ELISA试验结果进行噬菌体肽库筛选，然后利用分子对接软件模拟多肽与ICL蛋白晶体（1F8I）的分子对接，将成功对接的多肽采用Fmoc固相合成法合成，并对其生物活性进行检测。用制备型反相高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化并进行质谱检测。共筛选得到4条多肽且均有抑菌效果，并与剂量相关。结果显示，浓度为800-1 500 μg/mL时，各组多肽均抑菌。浓度为500 μg/mL时，正常培养基中只有一种肽有抑菌作用，而限制碳源培养基中均不能抑菌。2号肽抑菌效果最好，正常培养基中MIC为200 μg/mL，限制碳源中为500 μg/mL。阳性对照组，两种培养基抑菌效果一致，利福平MIC为0.8 μg/mL，异烟肼MIC为0.5 μg/mL。根据MIC结果，在正常培养基中加入Vc，检测到多肽、利福平和异烟肼的抑菌效果呈剂量依赖性升高。

食源性沙门氏菌耐药性及质粒介导喹诺酮耐药基因检测

刘贵深, 于涛

2014, 30(8): 202-207.

摘要 ( 155 )

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随机采集的638份食品样品中沙门氏菌总检出率为9.7%（n=62株），共检出16种不同的血清型，其中最常见的为鸭沙门氏菌。受试菌株对磺胺甲基异噁唑、复方新诺明、链霉素和环丙沙星的耐药率较高。16株耐环丙沙星沙门氏菌按GyrA和ParC喹诺酮耐药决定区（QRDR）不同氨基酸替代组合可分为5种突变型，其中GyrA亚基发生Ser83Phe和Asp87Gly变异，同时ParC亚基发生Ser80Arg变异为最常见的突变类型。62株食源性沙门氏菌中，qnr基因阳性的菌株共7株，占受试菌株的11.3%。qnrA和qnrS基因阳性菌株分别有2株和5株，没有菌株携带qnrB、qnrC和qnrD基因。aac（6'）-Ib基因阳性菌株共有8株，其中3株经确认为携带其变体基因aac（6'）-Ib-cr。结果表明，新乡市食源性沙门氏菌血清型分布呈多样性，耐药状况较为严重，并且一些菌株携带质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因。

酵母中性脂快速检测及积累动态分析

杜秀秀, 房志家, 陈忠翔, 匡鑫, 黄志伟

2014, 30(8): 208-214.

摘要 ( 232 )

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以油红O、苏丹黑B为染料，结合酸或碱热破壁萃取，建立了通过比色快速检测酵母中性脂含量的方法。其中油红O萃取效果较好，比色结果更加准确，苏丹黑B也可以作为一种替代的中性脂含量检测的染料。并用该方法初步研究了两种中性脂肪甘油三酯代谢调控的关键基因磷脂酸磷酸酶（PAH1）和甘油三酯脂酶（triglyceride lipase，TGL）敲除突变体中性脂的变化。结果显示，前者甘油三酯显著降低，但总中性脂肪含量不变，后者甘油三酯及总中性脂肪含量均明显积累；同时，用该方法监测了酵母中性脂含量随生长周期的动态变化，表明指数生长期后有明显的积累。

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