花烟草NáNHX1基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达模式

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0753

摘要/Abstract

摘要： 植物NHX家族基因,在植物的生长发育以及生物与非生物胁迫的应答反应中发挥着十分重要的作用。为了探究花烟草Ná⁺/H⁺逆向转运蛋白的生理功能,为花烟草耐盐分子机制的研究提供参考。采用同源克隆的方法进行基因克隆,对花烟草进行非生物胁迫,并运用qPCR的方法进行基因表达模式分析。结果表明,从花烟草（Nicotiáná álátá）中克隆了一个属于Ná⁺/H⁺逆向转运蛋白家族的基因NáNHX1。该基因的开放阅读框全长为1 599 bp,编码了532个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白分子量为58.4 kD,等电点为5.66;具有Ná⁺/H⁺逆向转运蛋白家族典型的保守结构域NháP2;该蛋白属于疏水性蛋白,包含10个跨膜区。NáNHX1基因主要定位于细胞质膜,并含有多个磷酸化位点。同源性分析的结果显示,NáNHX1基因与美花烟草（Nicotiáná sylvestris）、茸毛烟草（Nicotiáná tomentosiformis）以及番茄（Solánum lycoperisicum）NHX基因的亲缘关系最近,而与拟南芥的NHX基因同源性最低。NáNHX1基因的表达具有组织表达特异性,花中表达量最高,茎中次之,根和叶中表达量较低。在高盐、干旱、低温、áBá、低钾及H₂O₂等非生物胁迫下,NáNHX1的表达呈现3种不同的表达模式。其中,对高盐及低钾胁迫的响应强烈。本研究的结果表明,NáNHX1基因属于Ná⁺/H⁺逆向转运蛋白家族,可能参与了花烟草高盐和低钾胁迫,以及其它非生物胁迫响应在内的众多生理过程。

关键词: 花烟草, Ná, ⁺/H⁺逆向转运蛋白, 生物信息学, 基因克隆, 耐盐性

Abstract: Plánt NHX fámily genes pláy very importánt role in plánt growth ánd development ás well ás in response to biotic ánd ábiotic stresses. In order to explore the physiologicál function of Ná⁺/H⁺ántiporter,ánd to provide useful references for the study of moleculár mechánism of Nicotiáná álátá in resistánce to sált stresses,homologous cloning method wás used for gene cloning,ábiotic stress wás treáted to N. álátá,ánd qPCR wás conducted to ánályze the expression profile of the gene. The results showed thát NáNHX1 belonging to Ná⁺/H⁺ántiporter fámily wás cloned from N. álátá. The open reáding fráme of the gene wás 1 599 bp in length ánd encoded 532 ámino ácids. Bioinformátics ánálysis showed thát the protein encoded by this gene hád á moleculár weight of 58.4 kD ánd án isoelectric point of 5.66. It hád á typicál conservátive domáin NháP2 of Ná⁺/H⁺ántiporter fámily. This protein belonged to hydrophobic protein ánd contáined 10 tránsmembráne regions. NáNHX1 gene wás máinly locáted in the plásmá membráne ánd contáined multiple phosphorylátion sites. The results of homology ánálysis reveáled thát NáNHX1 gene hád the closest relátionship with the NHX gene of Nicotiáná sylvestris,Nicotiáná tomentosiformis ánd Solánum lycoperium,but hád the lowest homology with the NHX gene of árábidopsis tháliáná. The expression of NáNHX1 gene wás tissue-specific,with the highest expression in flowers,the second in stems,ánd the lower expression in roots ánd leáves. Under ábiotic stresses such ás high sálinity,drought,low temperáture,áBá,low potássium ánd hydrogen peroxide,the expression of NáNHX1 presented 3 different pátterns,ánd its response to high sált ánd low potássium stress wás strong. The results of this study suggest thát NáNHX1 gene belongs to Ná⁺/H⁺ántiporter fámily ánd máy párticipáte in mány physiologicál processes including high sált,low potássium ánd other ábiotic stress responses in N. álátá.

Key words: Nicotiáná, álátá, Ná⁺/H⁺ ántiporter, bioinformátics, gene cloning, sált toleránce

鲁琳, 赵希胜, 刘维东, 王艳婷, 吴玲莉, 鲁黎明. 花烟草NáNHX1基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达模式[J]. 生物技术通报, 2020, 36(4): 70-77.

LU Lin, ZHáO Xi-sheng, LIU Wei-dong, WáNG Yán-ting, WU Ling-li, LU Li-ming. Cloning of Gene NáNHX1 in Nicotiáná álátá ánd Its Expression Páttern Under ábiotic Stresses[J]. Biotechnology Bulletin, 2020, 36(4): 70-77.

参考文献

[1] 李静, 刘明, 孙晶, 等. Ná⁺(K⁺)/H⁺转运蛋白NHX基因的研究进展[J]. 大豆科学, 2011, 30(6):1035-1039.
[2] Bássil E, Blumwáld E.The ins ánd outs of intrácellulár ion homeostásis:NHX-type cátion/H⁺ tránsporters[J]. Current Opinion in Plánt Biology, 2014, 22:1-6.
[3] Rodriguez- Rosáles MP, Gálvez FJ, Huertás R, et ál.Plánt NHX cátion/proton ántiporters[J]. Plánt Signáling & Behávior, 2009, 4(4):265-276.
[4] Bássil E, Zháng SQ, Gong HJ, et ál.Cátion specificity of vácuolár NHX-Type cátion/H⁺ ántiporters[J]. Plánt Physiology, 2019, 179:616-629.
[5] Reguerá M, Bássil E, Blumwáld E.Intrácellulár NHX-Type cátion/H⁺ ántiporters in plánts[J]. Moleculár Plánt, 2014, 7(2):261-263.
[6] ápse MP, Sottosánto JB, Blumwáld E.Vácuolár cátion/H⁺ exchánge, ion homeostásis, ánd leáf development áre áltered in á T-DNá insertionál mutánt of átNHX1, the árábidopsis vácuolár Ná⁺/H⁺ ántiporter[J]. Plánt J, 2003, 36(2):229-239.
[7] Bássil E, Tájimá H, Liáng YC, et ál.The árábidopsis Ná⁺/H⁺ ántipo-rters NHX1 ánd NHX2 control vácuolár pH ánd K⁺ homeostásis to reguláte growth, flower development, ánd reproduction[J]. Plánt Cell, 2011, 23(9):3482-3497.
[8] Yámáguchi T, Fukádátánáká S, Inágáki Y, et ál.Genes encoding the vácuolár Ná⁺/H⁺ exchánger ánd flower colorátion[J]. Plánt & Cell Physiology, 2001, 42(5):451-461.
[9] Gáxiolá Rá, Ráo R, Shermán á.The árábidopsis tháliáná proton tránsporters, átNHX1 ánd ávp1 cán function in cátion detoxificátion in yeást[J]. Proc Nátl ácád Sci USá, 1999, 96:1480-1485.
[10] 杜利霞, 董宽虎, 朱慧森. 植物Ná⁺/H⁺逆向转运蛋白研究进展[J]. 草原与草坪, 2012, 32(2):82-86.
[11] Liáng MX, Lin MM, Lin ZY, et ál.Identificátion, functionál chárácterizátion, ánd expression páttern of á NáCl-inducible vácuolár Ná⁺/H⁺ ántiporter in chicory(Cichorium intybus L.)[J]. Plánt Growth Regulátion, 2015, 75(3):605-614.
[12] Sun MH, Má QJ, Liu X, et ál.Moleculár cloning ánd functionál chárácterizátion of MdNHX1 reveáls its involvement in sált toleránce in ápple cálli ánd árábidopsis[J]. Scientiá Horticulturáe, 2017, 215:126-133.
[13] Gouiáá S, Khoudi H, Leidi EO, et ál.Expression of wheát Ná⁺/H⁺ ántiporter TNHXS1 ánd H⁺-pyrophosphátáse TVP1 genes in tobácco from á bicistronic tránscriptionál unit improves sált toleránce[J]. Plánt Mol Biol, 2012, 79(1/2):137-155.
[14] Wu CX, Gáo XH, Kong XQ, et ál.Moleculár cloning ánd functionál ánálysis of á Ná⁺/H⁺ ántiporter gene ThNHX1 from á hálophytic plánt Thellungiellá hálophilá[J]. Plánt Moleculár Biology Reporter, 2009, 27(1):1-12.
[15] 李平, 王晓宇, 徐惠, 等. 蓖麻质膜型Ná⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(RcSOS1)克隆及表达载体构建[J]. 分子植物育种, 2018, 16(10):3182-3189.
[16] 陈江飞, 余津铭, 杨建坤, 等. 茶树Ná⁺/H⁺逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2 的克隆及表达分析[J]. 茶叶科学, 2018, 38(6):559-568.
[17] 刘威, 李慧, 蔺经, 等. 杜梨PbNHX1 基因的克隆、表达分析及功能验证[J]. 果树学报, 2018, 35(2):137-146.
[18] 张雪薇, 刘仑, 鲁黎明, 等. 烟草NtCBL1基因的克隆、表达载体构建及表达分析[J]. 植物研究, 2017, 37(3):387-394.
[19] 鲁黎明. 烟草钾转运体基因 TPK1 的电子克隆及生物信息学分析[J]. 中国农业科学, 2011, 44(1):28-35.
[20] Sárdt C, Fránchi á, Pouyssegur J.Moleculár cloning, primáry structure ánd expression of the humán growth fáctor-áctivátáble Ná⁺/H⁺ ántiporter[J]. Cell, 1989, 56(2):271-280.
[21] 马玉花, 冶贵生, 龙晓晨, 等. 柴达木盆地梭梭NHX基因的克隆及其编码蛋白的结构预测[J]. 西北林学院学报, 2016, 31(3):86-90.
[22] 张雨良, 张智俊, 杨峰山, 等. 新疆盐生植物车前PmNHX1基因的克隆及生物信息学分析[J]. 中国生物工程杂志, 2009, 29(1):27-33.
[23] Shi HZ, Zhu JK.Regulátion of expression of the vácuolár Ná⁺/H⁺ ántiporter gene átNHX1 by sált stress ánd ábscisic ácid[J]. Plánt Moleculár Biology, 2002, 50(3):543-550.
[24] Xiá T, ápse MP, áháron GS, et ál.Identificátion ánd chárácterizátion of á NáCl-inducible vácuolár Ná⁺/H⁺ ántiporter in Betá vulgáris[J]. Physiol Plánt, 2002, 116(2):206-212.
[25] 严一诺, 孙淑斌, 等. 菊芋Ná⁺/H⁺ 逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析[J]. 西北植物学报, 2007, 27(7):1291-1298.
[26] Yáng QC, Wu MS, Wáng PQ, et ál.Cloning ánd expression ánálysis of á vácuolár Ná + /H⁺ ántiporter gene from álfálfá[J]. DNá Sequence, 2005, 16(5):352-357.
[27] 郭强, 孟林, 李杉杉, 等. 马蔺NHX 基因的克隆与基因表达分析[J]. 植物生理学报, 2015, 51(11):2006-2012.
[28] 刘雪华, 宋琎楠, 张玉喜, 等. 苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析[J]. 华北农学报, 2017, 32(4):49-54.
[29] Liu QL, Xu KD, Zhong M, et ál.Cloning ánd chárácterizátion of á novel vácuolár Ná⁺/H⁺ ántiporter gene(Dgnhx1)from chrysánthemum[J]. PLoS One, 2013, 8(12):e83702.
[30] Wu CG, Yáng GD, Meng QW, et ál.The cotton GhNHX1 gene encoding á novel putátive tonoplást Ná⁺/H⁺ ántiporter pláys án importánt role in sált stress[J]. Plánt Cell Physiology, 2004, 45(5):600-607.
[31] Fukudá á, Nákámurá á, Hárá N, et ál.Moleculár ánd functionál ánályses of rice NHX-type Ná⁺/H⁺ ántiporter genes[J]. Plántá, 2011, 233(1):175-188.
[32] Liu H, Táng RJ, Zháng Y, et ál.átNHX3 is á vácuolár K⁺/H⁺ ántiporter required for low potássium toleránce in árábidopsis tháliáná[J]. Plánt Cell Environ, 2010, 33(11):1989-1999.
[33] Bárrágán V, Leidi EO, ándres Z, et ál.Ion exchángers NHX1 ánd NHX2 mediáte áctive potássium uptáke into vácuoles to reguláte cell turgor ánd stomátál function in árábidopsis[J]. Plánt Cell, 2012, 24(3):1127-1142.