NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0168

生物技术通报 ›› 2017, Vol. 33 ›› Issue (8): 186-191.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0168

NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件

封志媚, 赵雅童, 刘业学, 路福平, 李玉

天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室，天津 300457

收稿日期:2017-03-06 出版日期:2017-08-01 发布日期:2017-08-01
作者简介:封志媚，女，硕士研究生，研究方向：功能糖醇的生物合成；E-mail：1241107309@qq.com
基金资助:
国家重点研发计划专项项目（2016YFD0400803）

Recombinant Expression of NADPH-Dependent Mannitol Dehydrogenase and Transformation Conditions of Mannitol

FENG Zhi-mei, ZHAO Ya-tong, LIU Ye-xue, LU Fu-ping, LI Yu

Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457

Received:2017-03-06 Published:2017-08-01 Online:2017-08-01

摘要/Abstract

摘要： 对NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的异源表达和对果糖的转化情况进行分析，为在细胞内构建甘露醇的合成途径奠定基础。构建重组菌株BL21（DE3）/pET28a-mdh，对其进行诱导发酵后，通过His标签对目的蛋白进行纯化，并利用HPLC分析纯化后的甘露醇脱氢酶转化果糖生成甘露醇的情况。成功构建了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶重组表达菌株BL21（DE3）/pET28a-mdh，并对表达后的甘露醇脱氢酶进行了纯化，测得纯化后的甘露醇脱氢酶酶活力为270 U/mL。对酶法转化果糖得到甘露醇的转化条件进行优化，确定最佳的转化条件为：当底物浓度为300 g/L，反应初始pH5.8，温度40℃，NADPH终浓度为9 mmol/L时，甘露醇转化率可以达到97.4%。实现了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中的活性表达，为进一步研究大肠杆菌合成甘露醇的代谢调控提供了依据。

关键词: 甘露醇脱氢酶, NADPH, 甘露醇, 大肠杆菌, 纯化

Abstract: This work is to analyze the heterogeneous expression of NADPH-dependent mannitol dehydrogenase and the transformation of fructose for laying a foundation of constructing mannitol synthetic way. The recombinant strain BL21（DE3）/pET28a-mdh of expressing mannitol dehydrogenase was constructed and induced，and the target protein was purified with His-tag. Mannitol production from mannitol dehydrogenase transforming fructose was analyzed by HPLC. As results，the recombinant strain was constructed successfully and the mannitol dehydrogenase was purified. The activity of the purified mannitol dehydrogenase was 270 U/mL. The conditions of fructose transforming to mannitol by purified mannitol dehydrogenase were optimized，and the optimal conditions were as follows：300 g/L substrate fructose，pH5.8，9 mmol/L NADPH and incubation at 40℃. Under the optimized conditions，the transformation rate of mannitol reached 97.4%. In conclusion，the NADPH-dependent mannitol dehydrogenase was expressed successfully in Escherichia coli，providing the basis for studying the metabolism regulation of mannitol synthesis in E. coli.

Key words: mannitol dehydrogenase, NADPH, mannitol, Escherichia coli, purification

封志媚, 赵雅童, 刘业学, 路福平, 李玉. NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件[J]. 生物技术通报, 2017, 33(8): 186-191.

FENG Zhi-mei, ZHAO Ya-tong, LIU Ye-xue, LU Fu-ping, LI Yu. Recombinant Expression of NADPH-Dependent Mannitol Dehydrogenase and Transformation Conditions of Mannitol[J]. Biotechnology Bulletin, 2017, 33(8): 186-191.

参考文献

[1] Saha BC, Racine FM. Biotechnological production of mannitol and its applications[J] . Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 89（4）：879-891.
[2] 应伟丽, 韩晓颖, 李媚, 等. 电化学法合成甘露醇[J] . 广西民族大学学报：自然科学版, 2005, 11（3）：85-87.
[3] 张晓卿. 微生物转化制备甘露醇的研究[D] . 南宁：广西大学, 2004.
[4] Gaspar P, Neves AR, Ramos A, et al. Engineering Lactococcus lactis for production of mannitol：high yields from food-grade strains deficient in lactate dehydrogenase and the mannitol transport system[J] . Applied & Environmental Microbiology, 2004, 70（3）：1466.
[5] 王小芳. 利用代谢工程构建D-甘露醇生产菌株[D] . 天津：天津科技大学, 2013.
[6] 陈艳, 田康明, 李玉, 等. 以蔗糖为底物利用重组大肠杆菌合成甘露醇[J] . 微生物学通报, 2014, 41（11）：2182-2190.
[7] Ortiz ME, Fornaguera MJ, Raya RR, et al. Lactobacillus reuteri CRL 1101 highly produces mannitol from sugarcane molasses as carbon source[J] . Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 95（1）：991-999.
[8] Saha BC, Racine FM. Effects of pH and corn steep liquor variability on mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693[J] . Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87（2）：553-560.
[9] 王芳. 甘露醇发酵及甘露醇脱氢酶的克隆表达[D] . 石家庄：河北科技大学, 2009.
[10] 程雅韵, 王新, 郑琳, 等. 假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶基因的克隆及表达[J] . 食品科学, 2016, 37（13）：153-156.
[11] 林谦. 乳酸细菌甘露醇脱氢酶研究进展[J] . 科技传播, 2010, （19）：134-135.
[12] Weckbecker A, Gr?ger H, Hummel W. Regeneration of nicotinamide coenzymes：principles and applications for the synthesis of chiral compounds[J] . Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 2010, 120（120）：195-242.
[13] Reshamwala SM, Pagar SK, Velhal VS, et al. Construction of an efficient Escherichia coli whole-cell biocatalyst for d-mannitol production[J] . Journal of Bioscience & Bioengineering, 2014, 118（6）：628-631.
[14] Kaup B, Bringer-Meyer S, Sahm H. Metabolic engineering of Escherichia coli：construction of an efficient biocatalyst for D-mannitol formation in a whole-cell biotransformation[J] . Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 68（2）：235-240.
[15] Wasylenko TM, Ahn WS, Stephanopoulos G. The oxidative pentose phosphate pathway is the primary source of NADPH for lipid overproduction from glucose in Yarrowia lipolytica[J] . Metabolic Engineering, 2015, 30：27-39.
[16] Papagianni M, Legi?a M. Increased mannitol production in Lactobacillus reuteri ATCC 55730 production strain with a modified 6-phosphofructo-1-kinase[J] . Journal of Biotechnology, 2014, 181（10）：20-26.

NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件

Recombinant Expression of NADPH-Dependent Mannitol Dehydrogenase and Transformation Conditions of Mannitol

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	陈彩萍, 任昊, 龙腾飞, 何冰, 鲁兆祥, 孙坚. 大肠杆菌Nissle 1917对炎症性肠病治疗作用的研究进展[J]. 生物技术通报, 2023, 39(6): 109-118.
[2]	唐瑞琪, 赵心清, 朱笃, 汪涯. 大肠杆菌对木质纤维素水解液抑制物的胁迫耐受性[J]. 生物技术通报, 2023, 39(11): 205-216.
[3]	李仁瀚, 张乐乐, 刘春立, 刘秀霞, 白仲虎, 杨艳坤, 李业. 基于紫色杆菌素生物合成途径的L-色氨酸生物传感器的构建[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 80-92.
[4]	李文硕, 王林松, 杜桂彩, 郭群群, 张廷婷, 杨宏, 李荣贵. 一种松材线虫醛脱氢酶的基因克隆及其生化性质[J]. 生物技术通报, 2022, 38(9): 207-214.
[5]	覃雪晶, 王雨涵, 曹一博, 张凌云. 青杄PwHAP5基因原核表达及多克隆抗体制备[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 142-149.
[6]	高伟欣, 黄火清, 赵晶, 张鑫, 杨宁, 杨浩萌. 应用于基因编辑的核糖核蛋白复合体的构建与活性验证[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 60-68.
[7]	易芳, 来鹏程, 郑希鳌, 胡帅, 高燕丽. Kod DNA聚合酶的制备及纯化研究[J]. 生物技术通报, 2022, 38(5): 183-190.
[8]	王小琴, 黄银萍, 王蔚倩, 吴萍, 全舒. 含非天然氨基酸定点突变的MLL3_SET蛋白表达与纯化[J]. 生物技术通报, 2022, 38(3): 194-202.
[9]	孙曼銮, 葛赛, 卜佳, 朱壮彦. 大肠杆菌核糖核酸酶调控机制研究[J]. 生物技术通报, 2022, 38(3): 234-245.
[10]	张丰文, 周丽亚, 董超, 史延茂. 纳豆中抗氧化肽的分离纯化与活性研究[J]. 生物技术通报, 2022, 38(2): 158-165.
[11]	陈铎, 刘永哲. 新型冠状病毒核蛋白N端结构域的表达纯化以及晶体优化[J]. 生物技术通报, 2022, 38(12): 149-155.
[12]	李晓芳, 刘慧燕, 潘琳, 艾治宇, 李一鸣, 张恒, 方海田. 常温常压等离子体诱变选育高产L-异亮氨酸大肠杆菌[J]. 生物技术通报, 2022, 38(1): 150-156.
[13]	曹汝菲, 李泽轩, 许欢, 张莎, 张敏敏, 戴枫, 段晓雷. 脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长[J]. 生物技术通报, 2021, 37(9): 180-190.
[14]	田嘉慧, 封佳丽, 卢俊桦, 毛林静, 胡著然, 王莹, 楚杰. 一色齿毛菌漆酶LacT-1的分离纯化与性质研究[J]. 生物技术通报, 2021, 37(8): 186-194.
[15]	张西西, 张怡青, 李玉林, 韩笑, 王国强, 王晓军, 王旭东, 王云龙. 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白C端重组蛋白的原核表达、纯化及应用[J]. 生物技术通报, 2021, 37(5): 92-97.