α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化

doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0188

生物技术通报 ›› 2017, Vol. 33 ›› Issue (8): 180-185.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0188

α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化

秦海彬, 熊涛, 张博, 牛坤

浙江工业大学生物工程学院浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，杭州 310014

收稿日期:2017-03-13 出版日期:2017-08-01 发布日期:2017-08-01
作者简介:秦海彬，男，硕士，研究方向：生物催化与转化；E-mail：qinhaibin@zjut.edu.cn
基金资助:
国家自然科学基金项目（21306173），浙江省自然科学基金项目（LQ 15C010001）

Site-directed Mutation of α-ketoglutorate Semialdehye Dehydrogenase and Its Enzymatic Properties

QIN Hai-bin, XIONG Tao, ZHANG Bo, NIU Kun

Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province，College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014

Received:2017-03-13 Published:2017-08-01 Online:2017-08-01

摘要/Abstract

摘要： 3-HP是一种性质优良的化学中间体，以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐，而限制3-HP产量的主要原因是AldH活力过低。对源于Azospirillam brasilense 的α-酮戊二酸半醛脱氢酶（KGSADH）基因同源建模和结构分析，采用定点突变方法得到高活力KGSADH，将突变酶表达纯化，探讨酶学性质的变化。结果表明，TU-KGSADH（E120D/P219A）酶活力达6.03 U/mg，比原始酶比酶活提高了322 %，最适温度由35℃降低为30℃，且热稳定性降低，最适pH为8.0，在pH 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn²⁺对KGSADH的酶活有较强的抑制作用，而Co²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面，TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L，V_max由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现，120位突变与最适pH下降和pH稳定性向酸性偏移有关，219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因，为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。

关键词: α-酮戊二酸半醛脱氢酶, 定点突变, 表达纯化, 酶学性质

Abstract: 3-HP is an excellent chemical intermediate，and the study on the production of 3-HP with glycerol as substrate is favored，while the main reason for limiting 3-HP production is the low activity of AldH. A gene of α-ketoglutorate semialdehye dehydrogenase（KGSADH）from Azospirillam brasilense was constructed by homology modeling and structure analysis. The KGSADH with high activity was obtained by site-directed mutation. The KGSADH was expressed and purified for the investigation of enzymatic properties. The results revealed that the activity of TU-KGSADH（E120D / P219A）reached 6.03 U/mg，which was 322% higher than that of the original KGSADH. The optimal temperature of TU-KGSADH decreased from 35℃ to 30℃，the thermostability reduced，and the optimal pH was 8.0 and enzymatic activity was improved slightly under pH 6.0-8.0. Zn²⁺ had a strong inhibitory effect on the activity of KGSADH，while Co²⁺，Fe³⁺ and Fe²⁺ had a great effect on the activity of KGSADH. In the kinetic aspect of the TU-KGSADH，the Km with acetaldehyde as a substrate reduced from 7.58 to 6.28 mmol/L，and Vmax increased from 10.6 to 12.3 U/mg. Finally，the factors affecting the changes of enzymatic properties were analyzed，The 120 site mutation was associated with the decrease of the optimal pH and pH stability to acidic migration，and the 219 site mutation may be the reason for the decrease of the optimum temperature and thermal stability，providing a fine reference for further research in directional modification of aldehye dehydrogenase.

Key words: α-ketoglutorate semialdehye dehydrogenase, site-directed mutation, expression and purification, enzymatic properties

秦海彬, 熊涛, 张博, 牛坤. α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化[J]. 生物技术通报, 2017, 33(8): 180-185.

QIN Hai-bin, XIONG Tao, ZHANG Bo, NIU Kun. Site-directed Mutation of α-ketoglutorate Semialdehye Dehydrogenase and Its Enzymatic Properties[J]. Biotechnology Bulletin, 2017, 33(8): 180-185.

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α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化

Site-directed Mutation of α-ketoglutorate Semialdehye Dehydrogenase and Its Enzymatic Properties

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