当期目录

2017年 第33卷 第8期    刊出日期：2017-08-01

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综述与专论

藻类水通道蛋白的研究进展

李露露, 曲长凤, 郑洲, 王以斌, 缪锦来, 张莉

2017, 33(8):  1-6.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0152

摘要 ( 266 )   HTML   PDF (1031KB) ( 572 )  

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目前，大量水通道蛋白已在古菌、细菌、真菌、动物和植物中相继被发现，但对于低等植物——藻类水通道蛋白的研究相对较少。藻类与陆地高等植物在生长环境方面存在较大差异，因此其体内存在的水通道蛋白在功能作用机制方面与高等植物会有不同。所有藻类的生长发育过程都与水分传导息息相关，而藻类水通道蛋白不仅仅是水分运输的通道蛋白，同时还具有其他生理生化功能，是一类多功能蛋白。与植物水通道蛋白相比，藻类水通道蛋白的研究起步较晚。在2004年从莱茵衣藻中得到第一个水通道蛋白后，越来越多的研究者开始对藻类体内存在的水通道蛋白产生关注。近年来，在一些藻类全基因组测序完成的基础之上，研究者对藻类水通道蛋白的探索也有了新的进展。迄今为止，已有8个不同亚族的藻类水通道蛋白被确定出来，而且在近两年内，又有研究者从南极冰藻、条斑紫菜和羊栖菜中发现新的藻类水通道蛋白。综述了当前藻类水通道蛋白的分类和结构特征等方面的研究进展，并结合新发现的几种藻类水通道蛋白，阐述了藻类处于胁迫环境时水通道蛋白的特异性表达和所发挥的生理功能，为后续相关藻类水通道蛋白的研究奠定一定的理论基础。

辣椒雄性不育的研究进展

邵贵芳, 张凡, 王姣, 赵凯, 莫云容, 邓明华

2017, 33(8):  7-13.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0207

摘要 ( 314 )   HTML   PDF (1053KB) ( 388 )  

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雄性不育作为植物界中普遍存在的特殊生理现象，在基础应用和实践生产上具有较高的研究价值。综述了辣椒的细胞核雄性不育、核质互作雄性不育两种类型及花粉的不同败育方式，小孢子发生败育的不同时期，比较不育系和保持系花粉发育过程的一些生理生化现象，主要涉及物质代谢和能量代谢。从线粒体代谢，线粒体的结构和数量，线粒体的分子基础三个方面介绍了雄性不育和线粒体间的关系，利用分子技术进行不育基因的标记和蛋白质组学的相关研究，以期为辣椒育种研究者提供参考。

甜瓜抗枯萎病和白粉病育种研究进展

邱果, 刘柳, 李小梅, 王学征

2017, 33(8):  14-19.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0470

摘要 ( 242 )   HTML   PDF (1014KB) ( 256 )  

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甜瓜在整个栽培过程中受到多种病虫害的影响，其中枯萎病和白粉病是甜瓜的主要病害。甜瓜枯萎病和白粉病是世界性病害，对我国甜瓜生产构成严重威胁，造成巨大的损失。传统的农业防治、化学防治和生物防治存在费时费力、污染环境、破坏生态平衡、危害人体健康的问题，不利于农业可持续发展，种植抗病品种可以从根本上解决环境与生态问题，因此选育抗病品种是最佳方案。综述了甜瓜枯萎病和白粉病的病理学、抗病性鉴定及抗病育种3个方面的研究进展，讨论了抗病育种的意义、存在的问题及今后的发展方向，旨在为甜瓜抗病品种的培育提供借鉴。

羧肽酶A的脱毒功能及其应用前景

熊露, 王晓云, 梁志宏

2017, 33(8):  20-25.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0163

摘要 ( 230 )   HTML   PDF (1787KB) ( 346 )  

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赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由曲霉菌和青霉菌产生的一种真菌毒素，谷物、豆类、葡萄酒和咖啡等制品常常受到其污染，对食品安全构成了极大的威胁。随着全球气候的变化，OTA的污染情况日益严重，为保障人类及畜禽动物的安全，不少研究人员正致力于脱除或降解食品及其原料中的OTA。目前很多真菌和细菌被报道能降解OTA，然而它们产生的降解酶很少被定性和纯化，降解产物也不明确，无法应用于工业中。羧肽酶A（Carboxypeptidase A，CPA）对OTA的脱毒能力已被广泛证明，同时它的性质、结构及作用机理都极为清晰，降解产物也对人体无害，是脱除OTA的理想产品。因此通过基因工程和蛋白质工程大量表达获得稳定并效率高的羧肽酶A是降解OTA的新途径。将从OTA的污染状况及其生物脱毒机制、CPA的脱毒能力、CPA作为脱毒剂的发展前景等方面进行综述，旨在为真菌毒素降解酶制剂的开发和应用奠定理论基础。

技术与方法

植物病毒检测及脱毒方法的研究进展

迟惠荣, 毛碧增

2017, 33(8):  26-33.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0253

摘要 ( 301 )   HTML   PDF (1066KB) ( 886 )  

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病毒是人们所知的自然界最小的生物之一，其形态大小要借助电镜放大到几万甚至几十万倍才能观察得到。病毒具有严格的寄生性，必须在宿主细胞内才能生长繁殖。植物病毒是病毒科的一个重要组成部分，这一类病原物所引起的病害正逐年加重，影响了植物的生长和发育，降低了产量和品质。因病毒种类多，危害机制复杂，所以病毒病的防治也存在一定的困难。阐述了植物病毒的检测方法，详述了脱毒的技术方法及其近几年的应用情况，讨论了在脱毒过程中要注意的问题，并对今后的研究方向进行展望，以期为相关研究提供一些参考和理论依据。

基于SMRT测序技术的16S rRNA基因全长测序及其分析方法

唐勇, 刘旭

2017, 33(8):  34-39.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0036

摘要 ( 325 )   HTML   PDF (1047KB) ( 701 )  

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被称为第三代测序技术的单分子测序是最近几年发展起来的高通量测序技术。其中，由Pacbio BioSciences公司开发的单分子实时测序技术（SMRT）是最先商用的技术。SMRT测序技术通过对模板序列循环测序产生环形一致序列（CCS），成功克服第三代测序技术准确率低的弊病。通过SMRT测序技术，科学家可以更深入准确地探究复杂环境微生物的结构和功能。介绍SMRT测序技术在微生物16S rRNA基因测序中的优势和劣势，并就基于SMRT测序技术所得的全长16S rRNA基因序列的质量控制、错误序列排除、聚类和注释分析等重要分析环节进行概述，同时，提出利用SMRT测序技术研究复杂环境微生物可能存在的问题及其解决方法，期望能为研究人员提供参考。

一种利用CRISPR/Cas9 对细胞添加生物条形码的新方法

魏喻, 周昌阳, 李艳利

2017, 33(8):  40-45.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0087

摘要 ( 304 )   HTML   PDF (3120KB) ( 377 )  

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旨在利用CRISPR/Cas9对细胞添加不同的生物条形码（Barcode），实现对细胞进行不同的标记。将生物条形码序列、条件诱导性Cas9序列及相应的sgRNA序列通过PB酶整合到细胞中，诱导Cas9表达之后对生物条形码序列测序分析细胞的标记情况。所设计的生物条形码含有6个相互重叠的sgRNA 识别位点，这种设计可以使条形码序列只会被Cas9切割一次。结果显示，所设计的生物条形码序列在N2a细胞中经Dox诱导之后能够高效地被Cas9切割，所挑的9个克隆中，生物条形码序列有9种不同的基因型。含有受loxp-stop-loxp 调控表达Cas9的序列及生物条形码序列的E14胚胎干细胞经Cre诱导之后，挑单克隆测序分析显示，21株细胞中仅2株单克隆细胞生物条形码保持原来的基因型，另外19株有18种不同的基因型。成功建立了可进行时空调控地在细胞内高效添加特异且相对稳定的生物条形码标记的方法。

研究报告

水稻无蜡质叶片突变体^wcl1的图位克隆

王佳梅, 安雪娇, 张治国

2017, 33(8):  46-50.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0132

摘要 ( 205 )   HTML   PDF (2371KB) ( 393 )  

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从水稻T-DNA插入突变体库中筛选获得1份叶片表皮无蜡质的突变体wcl1（Wax Crystal-Sparse Leaf 1），突变体wcl1有如下主要特征：一是突变体叶片角质层蜡质减少，二是突变体的干旱敏感性高于野生型。通过图位克隆技术，克隆了wcl1基因，其编码酮酯酰辅酶A（LOC_OS09g25850），在突变体中LOC_OS09g25850基因的第10个外显子处鸟嘌呤（G）突变为胸腺嘧啶（T）导致转录提前终止，经分析表明突变体wcl1是一个wsl2基因的等位突变体。

普通野生稻绿色组织特异表达启动子的克隆与鉴定

赵志强, 薛满德, 黄珂, 张静文, 龙艳, 裴新梧, 袁潜华

2017, 33(8):  51-57.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0443

摘要 ( 221 )   HTML   PDF (3613KB) ( 402 )  

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绿色组织特异表达启动子可调控外源基因只在受体作物的绿色组织中定点、高效地表达。以普通野生稻为实验材料，克隆了绿色组织特异表达启动子OrGSP，构建OrGSP和GUS基因融合的表达载体，转入拟南芥中鉴定功能。启动子OrGSP长度为825 bp，含有基本的转录起始元件TATA-box和CAAT-box，以及光响应元件TCCC-motif、Sp1、G-box、I-box、GA-motif和as-2-box等。转基因拟南芥GUS组织化学染色结果表明，启动子OrGSP调控GUS基因只在绿色组织中特异表达。GUS活性测定结果显示，叶和茎中的GUS活性比根中明显提高。普通野生稻中克隆的启动子OrGSP为绿色组织特异表达启动子，可为作物分子育种提供新的调控元件。

Flor-essence对小麦种子萌发和幼苗生长的影响

邸惠, 张继权, 吕建洲, 马齐云

2017, 33(8):  58-62.  doi:10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2017-0203

摘要 ( 180 )   HTML   PDF (2431KB) ( 333 )  

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研究不同浓度Flor-essence对小麦种子萌发及幼苗生长的影响，以开拓其在植物生长调节剂领域的新应用。通过室内水培试验，分别设定50、100、150、200和250 mg/L 5组不同浓度的Flor-essence溶液处理，测定小麦种子发芽和植株生长的相关指标，同时选取清水（0 mg/L Flor-essence）和0.015 mg/L的油菜素内酯（BR）作对照。结果显示，与对照相比，不同浓度Flor-essence浸种均促进了小麦种子的萌发和生长，小麦的发芽势、发芽率、发芽指数、根长、株高、鲜重、干重、叶绿素含量和根冠比均有不同程度提高。不同浓度处理中，以200和250 mg/L处理的幼苗发芽情况最好；以150 mg/L处理的株高最高；以200 mg/L处理的根长最长、根冠比最大；以250 mg/L处理的鲜重、干重和叶绿素含量最高。利用Flor-essence浸种可促进小麦种子萌发和幼苗生长，且浓度为150-250 mg/L Flor-essence更能够在不同程度上促进小麦苗期的生长。

大豆^GmCOL1和^GmCOL13启动子和基因组基因的克隆与生物信息学分析

韩英英, 陈福禄, 傅永福, 张晓玫

2017, 33(8):  63-72.  doi:10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2017-0201

摘要 ( 205 )   HTML   PDF (3817KB) ( 408 )  

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以大豆天隆1号为材料提取基因组DNA，分别克隆到长2 631 bp的 GmCOL1启动子和2 809 bp的GmCOL13启动子。此外，还克隆到GmCOL1和GmCOL13基因组基因长度分别为3 488 bp和2 798 bp，它们分别编码含348个和366个氨基酸的蛋白质。利用PlantCARE分析GmCOL1和GmCOL13的启动子序列发现，它们均含有以下调控元件：生物钟元件（Circadian）、光响应元件（ACEG-box等）、ABA响应元件（ABRE）、干旱诱导元件（MBS）、低温响应元件（LTR）。ProtParam分析表明，GmCOL1和GmCOL13蛋白质的分子量分别为38.47 kD和40.91 kD，并且都是亲水性蛋白。GOR分析显示，GmCOL1和GmCOL13的二级结构含有Alpha helix，Extended strand和Random coil。在线网站PROSITE的分析说明，GmCOL1和GmCOL13有两个Zinc finger B-box和一个CCT domain（CO，CO-LIKE and TOC1 domain）结构域。

山西大豆皂苷类型及其关键酶基因表达分析

赵巧玲, 刁秀楠, 郭春绒, 赵晋忠, 杜维俊, 岳爱琴

2017, 33(8):  73-80.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0395

摘要 ( 207 )   HTML   PDF (2871KB) ( 307 )  

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大豆皂苷Aa、Ab的含量影响大豆制品口感，旨在了解大豆籽粒中皂苷Aa和Ab的组成及含量，进而研究其合成代谢机制。采用HPLC-ESI-MS/MS技术测定大豆材料中Aa、Ab皂苷的含量，利用qRT-PCR技术研究籽粒发育过程中GmSg-1基因的相对表达量。结果显示，68个山西大豆材料种子中Aa型大豆材料胚和子叶中Aa皂苷含量的变异范围分别为0.41-33.79 mg/g，0.21-8.39 mg/g；Ab型大豆胚和子叶中Ab皂苷的变异范围分别为0.85-44.96 mg/g，0.26-11.09 mg/g。GmSg-1基因序列有19个SNP多态性位点，其中10个SNP引起氨基酸变异。Aa、Ab大豆皂苷含量在籽粒发育过程中呈现先增后减的趋势，在开花后40-50 d皂苷含量达到最大值，而GmSg-1基因的相对表达量在前期呈现与含量基本相同的趋势。

番茄灰霉病病原菌分离鉴定及拮抗菌筛选

陈哲, 黄静, 赵佳, 梁宏

2017, 33(8):  81-87.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0217

摘要 ( 233 )   HTML   PDF (2979KB) ( 546 )  

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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的番茄灰霉病是番茄生产上的重要病害。从番茄果实表面成功分离了1株真菌BC2016-2，经过鉴定确定其为灰霉病的病原菌——灰葡萄孢菌；以灰葡萄孢菌BC2016-2为指示菌，筛选到了3株具有明显抑制作用的菌株，分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacien）CM3、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y-30和解淀粉芽孢杆菌Y-48。盆栽实验结果显示，菌株CM3、Y-30和Y-48对灰葡萄孢菌BC2016-2引起的番茄灰霉病的防治效果分别为65.58%、54.1%和72.13%。

新疆辣椒CMV基因组序列分析与^CP基因多克隆抗体制备

周东, 刘贞, 刘丽, 许鹏程, 郑银英

2017, 33(8):  88-94.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0206

摘要 ( 205 )   HTML   PDF (2044KB) ( 411 )  

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克隆新疆辣椒LJ-10 CMV基因组片段，并进行序列分析，构建CMV CP基因的原核表达载体，并制备CP基因的多克隆抗体。利用RT-PCR技术，克隆新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1（3 357 nt）、RNA2（3 042 nt），RNA3（2 212 nt）全基因组片段，与GenBank上登陆的CMV亚组IA、亚组IB、亚组Ⅱ分离物进行序列分析和系统进化树分析。将LJ-10 CMV CP基因克隆到原核表达载体pET-22b中，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达纯化，以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子，制备CMV特异性抗血清，并进行间接ELISA和Western blotting分析。结果显示，成功克隆了新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1、RNA2、RNA3全基因组片段，序列分析及系统进化树分析表明，该分离物属于CMV亚组IB。成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体pET-CMV-CP，在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导获得了与预期大小一致的分子量约为27 kD的重组蛋白，制备了CMV的特异性抗血清。间接ELISA和Western blotting分析表明，制备的抗血清效价为1：500-1 000。新疆辣椒LJ-10 CMV分离物属于CMV亚组IB，成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体，制备了相应的多克隆抗体。

精胺和亚精胺对烟草叶片气体甲醛吸收及生理特性的影响

司志浩, 王茹, 冯永, 郭红霞, 陈悦, 陈丽梅

2017, 33(8):  95-102.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0262

摘要 ( 283 )   HTML   PDF (2420KB) ( 242 )  

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为了研究多胺参与植物应答气体甲醛胁迫的生理特性，以模式植物烟草为实验材料分析了在气体甲醛胁迫下分别采用 100 μmol/L精胺和200 μmol/L亚精胺预处理对烟草叶片甲醛吸收效率、叶绿素含量、过氧化生理指标、抗氧化酶系统活性及甲醛代谢的影响。结果表明：（1）精胺和亚精胺预处理可以显著提高烟草对1、3和5 mg/m³气体甲醛的吸收效率，且精胺的效果好于亚精胺。（2）在气体甲醛胁迫下，精胺和亚精胺预处理延缓了烟草叶片中叶绿素b降解，且对过氧化氢（Hydrogen peroxide，H₂O₂）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的积累有抑制作用。此外，精胺和亚精胺预处理不同程度提高了气体甲醛胁迫下过氧化物酶（Peroxidase，POD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性。（3）精胺与亚精胺预处理对烟草代谢气体甲醛没有促进作用。

正交设计优化绿竹ISSR-PCR体系和引物筛选

徐雯, 瞿印权, 韩笑, 何天友, 荣俊冬, 郑郁善

2017, 33(8):  103-110.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0004

摘要 ( 204 )   HTML   PDF (3446KB) ( 388 )  

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旨在建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序，并筛选适于绿竹ISSR-PCR分析的高多态性引物。以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板，采用正交试验方法，对dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA用量设计5因素4水平试验，采用极差分析法和方差分析法对试验结果进行分析。并对退火温度和循环次数进行筛选，建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序。并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为：20 μL的扩增体系中，dNTPs浓度为0.2 mmol/L，Mg²⁺浓度为2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶浓度为1.5 U，引物浓度为0.4 μmol/L，DNA浓度为60 ng，10×PCR Buffer体积为2 μL、剩下用灭菌ddH₂O补全。各因素影响大小依次是：Mg²⁺ > dNTPs >模板DNA > Taq DNA聚合酶>引物。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，（根据引物的退火温度）复性30 s，72℃延伸90 s，循环38次，72℃延伸10 min，4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选，在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。

盐胁迫下胡杨和合作杨悬浮细胞端粒酶与抵御氧化损伤的关系

吴晓飞, 王瑾瑜, 张徐俞, 孙玉萍, 陈玉珍, 卢存福

2017, 33(8):  111-119.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0136

摘要 ( 162 )   HTML   PDF (2707KB) ( 356 )  

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胡杨是我国西北干旱盐碱荒漠和戈壁地带唯一能形成森林的高大乔木树种，具有较高抗盐性。旨在探究盐胁迫下细胞端粒酶活性变化与氧化损伤的关系，以抗盐的胡杨和盐敏感的合作杨悬浮细胞为材料，检测了NaCl盐胁迫条件下胡杨和合作杨细胞生长、超氧阴离子自由基与丙二醛含量以及端粒酶活性的变化。结果表明，在正常生长条件下，胡杨和合作杨细胞符合S型生长曲线，且合作杨细胞的生长量高于胡杨细胞；在盐胁迫<100 mmol/L时胡杨在培养7 d内细胞活力高于对照（0 mmol/L），即使盐浓度达到300 mmol/L时15 d胡杨细胞依然保持一定的细胞活力，而较低盐处理对合作杨细胞活力影响即较大，当盐浓度达到300 mmol/L时合作杨在第5 d细胞活力已接近零；与合作杨相比，低浓度盐胁迫（100 mmol/L）使胡杨细胞内超氧阴离子自由基含量增加，端粒酶活性较高，而合作杨丙二醛含量显著增加；低浓度（<20 mmol/L）H₂O₂诱导了胡杨细胞端粒酶活性，合作杨的变化则不显著，但高浓度（>200 mmol/L）NaCl和高浓度（50 mmol/L）H₂O₂可能造成了胡杨和合作杨氧化损伤，端粒酶活性降低。抗盐性强的胡杨细胞端粒酶对抵御细胞内氧化损伤具有一定作用。

水培条件下几种水生植物对铅的抗性研究

纪美辰, 张继权, 彭越, 马齐云

2017, 33(8):  120-125.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0199

摘要 ( 238 )   HTML   PDF (1771KB) ( 521 )  

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水生植物能够吸收重金属污染物，净化环境且具有较高的观赏价值和经济价值。本实验选取常见的3种水生植物鸢尾、菖蒲、水葫芦，采用水培方法，研究不同植物对Pb²⁺的抗性；以及在Pb-Zn复合污染下，Zn²⁺的存在对水葫芦吸收Pb²⁺的影响。结果表明，单一污染时水葫芦对较高浓度的含铅废液表现出一定的抗性，菖蒲对中低浓度含铅废液抗性较好，鸢尾次之。在复合污染条件下，水葫芦对铅、锌的吸收在不同浓度范围内分别存在着协同效应和拮抗效应。植物不同组织对铅的吸收累积程度不同，3种水生植物体内的重金属含量均呈现出地下部分高于地上部分，对重金属铅的体内转移能力不明显，不属于超富集植物，因此这3种植物均不适合处理高浓度含铅废液。

Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫（Holotrichia oblita）中肠微生物菌群的影响

王伟, 赵丹, 郭巍, 李新娜, 张雅昆, 闫晓平

2017, 33(8):  126-131.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0236

摘要 ( 174 )   HTML   PDF (2570KB) ( 251 )  

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Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫有特异的杀虫活性，通过中肠微生物宏基因组分析研究了Bt Cry8Ea蛋白与华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物的相互作用。解剖正常饲喂和饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita二龄幼虫中肠，提取中肠微生物宏基因组DNA，构建16S rDNA文库。利用PCR-RFLP 方法分析两个处理中肠微生物16S rDNA酶切片段多态性（MspⅠ，RsaⅠ和Hae Ⅲ内切酶），不同克隆测序后与NCBI数据库进行对比分析，构建系统进化树，确定中肠微生物种属。结果显示，正常饲喂的华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物共检出30种细菌，优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）：（Desulfosporosinus，29.63%）；厚壁菌门（Firmicutes）：梭菌属（Clostridium，12.59%）和芽孢杆菌属（Bacillus，10.37%），而饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃幼虫中共检出4种细菌，优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）：肠球菌属（Enterococcus，50%）和链球菌属（Streptococcus，46.88%）。结果表明，饲喂Cry8Ea蛋白后，中肠微生物的菌群结构发生了明显变化。

牦牛KLF3基因克隆及组织表达分析

林森, 林亚秋, 朱江江, 柏雪, 江明锋, 王永

2017, 33(8):  132-138.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0204

摘要 ( 219 )   HTML   PDF (2334KB) ( 508 )  

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旨在克隆牦牛KLF3基因序列，并获得其生物学特征，同时阐明其组织表达规律。选取4-6周岁的健康麦洼牦牛6头，采集脾、肺、肾、皮下脂肪和背最长肌组织样品，提取组织总RNA，利用RT-PCR方法克隆KLF3基因序列，同时利用荧光定量PCR（qPCR）技术检测该基因在不同组织中的表达情况。结果表明，获得牦牛KLF3基因序列1 137 bp（GenBank登录号：KX964630），其中CDS为1 041 bp，5'UTR 32 bp和3'UTR 64 bp，编码346个氨基酸，牦牛KLF3氨基酸序列与普通牛（XP_010820342.1）的氨基酸序列同源性达100%。KLF3 mRNA在牦牛肺脏和肝脏的表达水平较高，极显著高于其他组织（P<0.01）。

外源DNA在哺乳动物细胞中不依赖于启动子的转录和剪接现象

徐文, 杨华瑜, 郑永昌

2017, 33(8):  139-145.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0183

摘要 ( 231 )   HTML   PDF (2693KB) ( 281 )  

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外源性导入哺乳动物细胞的双链DNA会经历重组、重排及其他复杂的分子生化反应。极少数DNA分子会随机整合到宿主基因组，即发生水平基因转移。然而，目前还不清楚这些外源性DNA分子在不含有特殊启动子的情况下是否能被细胞的转录机器识别并起始转录。在构建环状RNA（circRNA）表达体系的过程中，发现了外源性DNA分子能经历不依赖启动子的转录，而且转录本会发生符合“GU-AG”法则的RNA剪接进而产生类似于环状RNA的异常剪接分子。进一步研究表明，外源DNA在哺乳动物细胞中不依赖于启动子的转录和剪接现象是保守的。揭示了外源DNA在哺乳动物细胞中的一个新的命运途径，该发现对研究外源性DNA对宿主细胞的影响具有重要意义及应用价值。

酸驯化和紫外诱导提高微藻耐酸性

史飞飞, 陈通, 程蔚兰, 宋程飞, 季春丽, 李润植

2017, 33(8):  146-151.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0446

摘要 ( 202 )   HTML   PDF (2285KB) ( 342 )  

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应用微藻固定烟道气CO₂既可减排又能生产高值生物基产品，但是，烟道气高浓度CO₂和氮硫氧化物导致培养液过度酸化、抑制微藻生长。通过建立微藻抗性驯化简易方法，以期提高微藻耐酸性和在低pH条件下的起始生长速率。经过酸驯化和紫外诱导叠加处理后的栅藻（Scenedesmus），在酸性环境下生长初期的平均生长速率达到0.253 g/（d·L），明显高于单因子处理的pH4.5酸驯化（0.132 g/（d·L））和紫外诱导5 min（0.092 g/（d·L））的生长速率。经过驯化处理的种子藻在pH3的酸性环境中可以正常生长，而未驯化微藻生长近乎停滞。经过驯化处理的种子藻接入低pH培养基后起始生长速率比未驯化微藻提高6.6倍。酸驯化和紫外诱导处理显著提高了栅藻对低pH环境的耐受性。

粟酒裂殖酵母中Mef2在线粒体中功能的研究

张娟, 陈美秀, 商巾杰

2017, 33(8):  152-158.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0097

摘要 ( 188 )   HTML   PDF (2909KB) ( 236 )  

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由核编码基因控制的线粒体翻译对线粒体中电子传递链复合物的合成是必不可少的。旨在揭示粟酒裂殖酵母中Mef2蛋白的主要功能。利用同源重组的方法构建Δmef2突变体，观察Δmef2在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基的生长表型；生物信息学分析结果显示Mef2的N端含有一段由31个氨基酸组成的线粒体定位序列（MTS），为进一步确定Mef2蛋白的定位，在Mef2的C端添加一个GFP荧光标记，观察GFP绿色荧光的位置。接着采用Northern blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码mRNAs的影响。最后，运用Western blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码的蛋白的影响。研究结果表明，Δmef2菌株在非发酵培养基上表现出生长缺陷，是线粒体呼吸缺陷型菌；GFP绿色荧光定位实验证实了Mef2定位于线粒体中；Northern blotting实验结果显示mef2的缺失不影响线粒体基因组编码mRNAs的转录；Western blotting检测结果显示mef2的缺失导致Cox1、Cox3、Atp6和Cob1蛋白的表达量降低。综上所述，Mef2是一个与线粒体功能密切相关的蛋白，并且参与了线粒体编码蛋白Cox1、Cox3、Atp6和Cob1的翻译。

筛选脱氮假单胞菌启动子提高维生素B₁₂产量

王玲玲, 夏苗苗, 董会娜, 朱蓓薇, 张大伟

2017, 33(8):  159-166.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0010

摘要 ( 267 )   HTML   PDF (2096KB) ( 443 )  

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维生素B₁₂（VB₁₂/钴胺素）具有多种生理学功能，广泛应用于制药、食品等行业。脱氮假单胞菌是维生素B₁₂常用工业菌株之一。通过筛选高表达启动子来过表达VB₁₂合成途径基因，能有效提高菌株的VB₁₂生产能力。通过对脱氮假单胞菌中某些编码热激蛋白和分子伴侣基因前含启动子在内的非编码序列用启动子在线预测软件进行分析，选取P_ibpA、P_cbpA、P_dnaJ、P_htpG、P_dnak、P_grpE的非编码区与编码绿色荧光蛋白的GFP报告基因相连，通过酶标仪检测GFP的荧光信号值，对编码热激蛋白和分子伴侣基因前的非编码区所含有的启动子的表达强度进行评估，以获得高表达的启动子对VB₁₂合成途径的基因进行过表达。结果表明，含有启动子P_dnak的非编码区，其表达的GFP荧光值最高。进而构建强启动子P_dnak与维生素B₁₂合成途径基因cobA的过表达重组菌，发酵数据表明，与对照菌株相比重组菌株维生素B₁₂产量提高21.5 mg/L。筛选高表达启动子用于维生素B₁₂合成途径关键基因的表达，是一种有效的提高维生素B₁₂产量的方法。

利用豆制品废水发酵枯萎病拮抗菌Pb-4条件研究

郭珺, 武爱莲, 闫敏, 庞金梅, 焦晓燕

2017, 33(8):  167-173.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0159

摘要 ( 206 )   HTML   PDF (1865KB) ( 341 )  

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利用豆制品生产过程中的废水（黄浆水）对枯萎病拮抗菌Pb-4菌株的发酵培养基及其发酵条件进行优化。通过单因素试验筛选Pb-4菌株黄浆水培养基中的碳源；设置因素水平为L₁₈（3⁵）正交试验，对Pb-4菌株黄浆水培养基中最佳碳源和无机盐成分进行筛选和优化，确定发酵培养基配方；通过响应面优化试验对Pb-4菌株的发酵温度、pH和接种量进行优化。结果显示，通过筛选确定玉米粉为黄浆水培养基的最佳碳源；优化后的发酵培养基配方为：1 000 mL黄浆水中添加玉米粉 30 g、（NH₄）₂SO₄ 2 g、MgSO₄ 1.5 g、CaCO₃ 1.5 g和FeSO₄ 0.3 g；优化后的发酵条件为：温度 36.3℃、pH7.4、接种量 5%、摇瓶培养40 h。在此优化条件下，发酵菌数可达42.8×10⁸ CFU/mL、最大生物量OD₆₆₀值为0.393，与预测理论最大值0.390 2相吻合。优化后的发酵培养基能够替代蛋白胨、酵母粉和葡萄糖等常规培养基，具有简单、廉价和环保等特点，可作为微生物菌剂规模化生产的原料。

S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响

何思雨, 成文玉, 金红星

2017, 33(8):  174-179.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0200

摘要 ( 187 )   HTML   PDF (2426KB) ( 282 )  

参考文献 | 相关文章 | 计量指标

为提高利福霉素的产量，构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体，通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中，使之发生同源重组，以安普霉素为标记，筛选了S-丙二酰转移酶基因失活菌株，并对比了突变菌株与原始菌株的利福霉素SV产量。成功构建了S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体，获得了地中海拟无枝酸菌突变株A. mediterranei △fabD，失活菌株的利福霉素SV产量为168.08 mg/L，比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰转移酶基因的失活，弱化了突变菌株脂肪酸的合成，强化了利福霉素的合成。

α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化

秦海彬, 熊涛, 张博, 牛坤

2017, 33(8):  180-185.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0188

摘要 ( 222 )   HTML   PDF (3154KB) ( 299 )  

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3-HP是一种性质优良的化学中间体，以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐，而限制3-HP产量的主要原因是AldH活力过低。对源于Azospirillam brasilense 的α-酮戊二酸半醛脱氢酶（KGSADH）基因同源建模和结构分析，采用定点突变方法得到高活力KGSADH，将突变酶表达纯化，探讨酶学性质的变化。结果表明，TU-KGSADH（E120D/P219A）酶活力达6.03 U/mg，比原始酶比酶活提高了322 %，最适温度由35℃降低为30℃，且热稳定性降低，最适pH为8.0，在pH 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn²⁺对KGSADH的酶活有较强的抑制作用，而Co²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面，TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L，V_max由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现，120位突变与最适pH下降和pH稳定性向酸性偏移有关，219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因，为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。

NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件

封志媚, 赵雅童, 刘业学, 路福平, 李玉

2017, 33(8):  186-191.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0168

摘要 ( 260 )   HTML   PDF (3212KB) ( 358 )  

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对NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的异源表达和对果糖的转化情况进行分析，为在细胞内构建甘露醇的合成途径奠定基础。构建重组菌株BL21（DE3）/pET28a-mdh，对其进行诱导发酵后，通过His标签对目的蛋白进行纯化，并利用HPLC分析纯化后的甘露醇脱氢酶转化果糖生成甘露醇的情况。成功构建了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶重组表达菌株BL21（DE3）/pET28a-mdh，并对表达后的甘露醇脱氢酶进行了纯化，测得纯化后的甘露醇脱氢酶酶活力为270 U/mL。对酶法转化果糖得到甘露醇的转化条件进行优化，确定最佳的转化条件为：当底物浓度为300 g/L，反应初始pH5.8，温度40℃，NADPH终浓度为9 mmol/L时，甘露醇转化率可以达到97.4%。实现了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中的活性表达，为进一步研究大肠杆菌合成甘露醇的代谢调控提供了依据。

极端嗜热α-淀粉酶ApkA的高温活性和热稳定性的优化研究

曾静, 郭建军, 袁林, 杨罡, 陈俊

2017, 33(8):  192-198.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0172

摘要 ( 197 )   HTML   PDF (2344KB) ( 303 )  

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旨在获得高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶。通过向α-淀粉酶ApkA中引入目前已知的最稳定的α-淀粉酶PFA的Zn²⁺结合位点，获得Zn²⁺结合位点突变体ApkAdsK152H/A166C。酶学性质分析表明，ApkAdsK152H/A166C的高温活性和热稳定性明显提高，最适反应温度由90℃提高至100℃，对应的酶比活力为5 201.08 U/mg。ApkAdsK152H/A166C于90℃的半衰期由5 h延长至10 h，于100℃的半衰期由7.5 min延长至80 min。重组α-淀粉酶中Zn²⁺含量测定结果显示ApkAdsK152H/A166C结合了一个Zn²⁺。结果表明，向ApkA中引入Zn²⁺结合位点有利于提高其高温活性和热稳定性。

两种天然产物对B16F10细胞增殖及黑色素合成抑制机理研究

程杏安, 张淑明, 周晓武, 吴波, 林贤伟, 秦湘静 , 黄素青, 刘展眉, 蒋旭红

2017, 33(8):  199-205.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0122

摘要 ( 296 )   HTML   PDF (3290KB) ( 483 )  

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旨在研究10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）和白藜芦醇（Resveratrol，Res）对体外培养的小鼠恶性黑色素瘤B16F10细胞的增殖及黑色素合成抑制机理。利用MTT法、显微观察、L-Dopa氧化法、NaOH裂解法分析不同浓度HCPT和Res对细胞增殖、细胞形态、酪氨酸酶活性及黑色素合成含量的影响。荧光半定量PCR方法（Semi-RT-PCR）分析该化合物对黑色素合成关键因子酪氨酸酶（TYR）和小眼相关转录因子（MITF）基因表达的影响。结果表明HCPT（40、80、120、160和200 μmol/L）和Res（80、120、160和200 μmol/L）能够通过诱导细胞凋亡抑制B16F10细胞的增殖，同时对酪氨酸酶活性和细胞黑色素生成具有明显抑制作用（P<0.05），且呈现浓度依赖性。另外，不同浓度的HCPT以及高浓度Res（120和160 μmol/L）能够显著下调B16F10细胞TYR和MITF基因的mRNA水平。HCPT和Res可能通过诱导细胞凋亡抑制B16F10细胞的增殖，同时通过下调MITF基因转录，抑制TYR mRNA的表达及TYR酶活性，进而抑制细胞黑色素的生成。

甲状腺激素受体与Drosha蛋白互作鉴定分析

尚攀, 付元帅, 施志仪, 喻杰, 刘素萍

2017, 33(8):  206-212.  doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0174

摘要 ( 215 )   HTML   PDF (3089KB) ( 402 )  

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为了证明甲状腺激素受体（THR）与Drosha蛋白之间的相互作用，以HEK293细胞为材料，利用免疫共沉淀的方法获得蛋白免疫复合物，再经Western blot检测和质谱分析。结果表明，用THR抗体Western blot检测出有THR蛋白的存在，反之Drosha抗体Western blot检测有Drosha蛋白的存在；同时，THR抗体免疫沉淀后的质谱鉴定存在Drosha蛋白，Drosha抗体免疫沉淀后的质谱鉴定也存在THR蛋白，由此说明甲状腺激素受体与Drosha蛋白之间确实存在相互作用。并且，初步筛选出与两者共同作用的54个蛋白，经Go 聚类分析揭示鉴定蛋白主要是细胞膜和细胞核中成分，参与细胞迁移、细胞凋亡、蛋白代谢、免疫应答、信号通路调节及转录调控等生物途径，具有核酸结合、细胞骨架结合等分子功能。

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2017, 33(8):  300. 

摘要 ( 98 )   HTML   PDF (282KB) ( 166 )  

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2017, 33(8):  400. 

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2017, 33(8):  500. 

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