草鱼IgM 的纯化、标记及检测方法的建立

摘要/Abstract

摘要： 通过Protein A 亲和层析法分离纯化草鱼血清中的免疫球蛋白IgM，SDS-PAGE 检测产物的纯度及分子量，用纯化产物免疫兔制备多克隆抗体，并用辣根过氧化物酶标记此兔抗草鱼IgM 抗体，用于检测经草鱼出血病病毒广东株（GCRV-GD108）衣壳蛋白VP4 及VP5 免疫草鱼后产生的抗体水平。结果表明，纯化后的草鱼IgM 轻链及重链分子量分别在25 kD 和75 kD 左右，所制备的草鱼标记抗体可应用于草鱼血清IgM 水平的快速检测。建立了标记抗体检测草鱼抗血清的方法，为进一步研究病原体入侵感染机制、草鱼的免疫防御机理和疫苗效果评价等提供便捷的血清学检测方法。

关键词: 免疫球蛋白, 多克隆抗体, ELISA, 辣根过氧化物酶, GCRV-GD108, 株, 疫苗效果评价

Abstract: Protein A affinity chromatography was used to purify immunoglobulin IgM from grass carp serum, and the purity and molecular weight of the product was analyzed by SDS-PAGE. Rabbit polyclonal antibodies of the purified grass carp IgM were prepared and detected by ELISA. The results showed that molecular weights of the light chain and heavy chain of the purified grass carp IgM were about 25 kD and 75 kD, respectively, and high titers of rabbit anti-grass carp IgM antiserum was obtained. Horseradish peroxidase was used to label the rabbit anti-grass carp IgM antibody. The labeled antibody was used to detect the antibody levels in serum of grass carp after immunizing by capsid protein VP4 and VP5 of grass carp hemorrhage virus isolated from Guangdong province（GCRV-GD108）. The results revealed that the labeled anti-grass carp IgM antibody could be used for the rapid detection of the IgM levels in grass carp serum. In this study, method to detect IgM levels in grass carp serum was established, which would provide a convenient method of serological testing for further study of pathogen invasion mechanism, grass carp immune defense mechanism and evaluation of grass carp vaccine effectiveness.

Key words: Immunoglobulin, Polyclonal antibodies ELISA, Horseradish peroxidase, GCRV-GD108 strain, Evaluation of vaccine effectiveness

田园园叶星张莉莉. 草鱼IgM 的纯化、标记及检测方法的建立[J]. 生物技术通报, 2013, 0(4): 194-200.

Tian Yuanyuan, Ye Xing, Zhang Lili . Purification，Tag and Method for Detection of Grass Carp Serum IgM[J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 0(4): 194-200.

参考文献

［1］沈关心. 微生物学与免疫学［M］. 北京：人民卫生出版社, 2006 ：33-34.
［2］李亚南. 嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白分析[J]. 动物学报, 2001, 47（2）：132-138.
［3］ Amemiya CT, Litman GW. Complete nucleotide sequence of an immunoglobulin heavy-chain gene and analysis of immunoglobulin gene organization in a primitive teleost species[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87（2）：811-815.
［4］ Wilson M, Bengte?n E, Miller NW, et al. A novel chimeric Ig heavy chain from a teleost fish shares similarities to IgD[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94（9）：4593-4597.
［5］ Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavychain isotype（IgT）in rainbow trout ：Implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102（19）：6919-6924.
［6］ Salinas I, Zhang YA, Sunyer JO. Mucosal immunoglobulins and B cells of teleost fish[J]. Dev Comp Immunol, 2011, 35（12）: 1346-1365.
［7］ Ghaffari SH, Lobb CJ. Cloning and sequence analysis of channel catfish heavy chain cDNA indicate phylogenetic diversity within the IgM immunoglobulin family[J]. J Immunol, 1989, 142（4）: 1356-1365.
［8］ Amemiya CT, Litman GW. Complete nucleotide sequence of an immunoglobulin heavy-chain gene and analysis of immunoglobulin gene organization in a primitive teleost species[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87（2）：811-815.
［9］ Bengte?n E, Leanderson T, Pilstr?m L. Immunoglobulin heavy chain cDNA from the teleost Atlantic cod（Gadus morhua L.）：nucleotide sequences of secretory and membrane form show an unusual splicing pattern[J]. Eur J Immunol, 1991, 21（12）：3027-3033.
［10］ Hansen J, Leong JA, Kaattari S. Complete nucleotide sequence of a rainbow trout cDNA encoding a membrane-bound form of immunoglobulin heavy chain[J]. Mol Immunol, 1994, 31（6）: 499-501.
［11］ Hordvik I, De Vries Lindstr?m C, Voie AM, et al. Structure and organization of the immunoglobulin M heavy chain genes in Atlantic salmon, Salmo salar[J]. Mol Immunol, 1997, 34（8-9）：631- 639.
［12］ Cheng CA, John JA, Wu MS, et al. Characterization of serum immunoglobulin M of grouper and cDNA cloning of its heavy chain[J].
Vet Immunol Immunopathol, 2006, 109（3-4）：255-265.
［13］ Coscia MR, Morea V, Tramontano A, et al. Analysis of a cDNA sequence encoding the immunoglobulin heavy chain of the Antarctic teleost Trematomus bernacchii[J]. Fish Shellfish Immunol, 2000, 10 ：343-357.
［14］ Zhang YA, Nie P, Wang YP, et al. cDNA sequence encoding immunoglobulin M heavy chain of the mandarin fish Siniperca chuatsi[J]. Fish Shellfish Immunol, 2003, 14 ：477-480.
［15］ Jang HN, Woo JK, Cho YH, et al. Characterization of monoclonal antibodies against heavy and light chains of flounder（Paralichthys olivaceus）immunoglobulin[J]. J Biochem Mol Biol, 2004, 37（3）: 314-319.
［16］ Saha Nr, Suetake H, Suzuki Y. Analysis and characterization of the expression of the secretory and membrane forms of IgM heavy chains in the pufferfish, Takifugu rubripes[J]. Mol Immunol, 2005, 42 ：113-124.
［17］王欣欣, 孙宝剑, 昌鸣先, 等. 草鱼免疫球蛋白M 重链基因的克隆及表达[J]. 水产学报, 2008, 32（1）：13-20.
［18］ Tian C, Chen X, Ao J. The up-regulation of large yellow croaker secretory IgM heavy chain at early phase of immune response[J].
Fish Physiol Biochem, 2010, 36（3）：483-490.
［19］ Magadán-Mompó S, Sánchez-Espinel C, Gambón-Deza F.
Immunoglobulin heavy chains in medaka（Oryzias latipes）[J].
BMC Evol Biol, 2011, 11 ：165.
［20］ Hu YL, Zhu LY, Xiang LX, et al. Discovery of an unusual alternative splicing pathway of the immunoglobulin heavy chain in a teleost fish, Danio rerio[J]. Dev Comp Immunol, 2011, 35（3）：253-257.
［21］迟妍妍, 田园园, 叶星, 等. 南方养殖草鱼呼肠孤病毒的分子特性比较及双重PCR 检测方法的建立[J]. 病毒学报, 2011, 27（4）：358-365.
［22］陈丛琳, 罗绍祥, 张晓华, 等. 草鱼免疫球蛋白IgM 四聚体的分析鉴定[J]. 水生生物学报, 2012, 36（1）：173-176.
［23］丁炜东, 曹丽萍, 曹哲明. 草鱼血清IgM 蛋白的纯化及抗血清的制备[J]. 水生生物学报, 2010, 34（1）：164-169.
［24］郝贵杰, 沈锦玉, 徐洋, 等. 草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2009, 25（9）: 808-810.
［25］ Ye X, Tian YY, Deng GC, et al. Complete genomic sequence of a reovirus isolated from grass carp in China[J]. Virus Res, 2012, 163（1）：275-283.
［26］ Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227 ：680-685.
［27］鄢庆枇, 韩一凡, 高天翔, 等. 大黄鱼血清IgM 纯化及其兔抗血清的制备[J]. 中国水产科学, 2006, 13（3）：475-479.
［28］ Scapigliati G, Romano N, Picchietti S, et al. Monoclonal antibodies against sea bass Dicentrarchus labrax（L.）immuno-globulins : immunolocalisation of immunoglobulin-bearing cells and applicability in immunoassays[J]. Fish & Shellfish Immunology, 1996, 6: 383-401.
［29］林树柱, 李万波, 刘先菊, 等. 乌鳢血清免疫球蛋白IgM 的分离纯化及其兔抗血清的制备[J]. 中国比较医学杂志, 2007, 17（11）：648-651.
［30］王凡, 林天龙, 潘厚军, 等. 鳜免疫球蛋白单克隆抗体的制备及特性[J]. 水产学报, 2006, 30（2）：285-288.
［31］王先磊, 张培军, 李军, 等. 牙鲆血清中免疫球蛋白M 的分离及其测定[J]. 海洋科学, 2004, 28（4）：8-12.
［32］伊光辉, 林天龙, 熊邦喜, 等. 斑点叉尾鮰血清免疫球蛋白纯化及其结构分析[J]. 福建农业学报, 2005, 20（2）：91-96.
［33］ Wilson MR, Warr GW. Fish immunoglobulins and the genes that encode them[J]. Ann Rev Fish Dis, 1992, 2 ：201-221.
［34］ Koumans-Van Diepen JC, Egberts E, Peixoto BR, et al. B cell and immunoglobulin heterogeneity in carp（Cyprinus carpio L.）；an immuno（cyto）chemical study[J]. Dev Comp Immunol, 1995, 19（1）：97-108.
［35］ Davis CR, Marty GD, Adkison MA, et al. Association of plasma IgM with body size, histopathological changes, and plasma chemistries in adult Pacific herring Clupea pallasii[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 1999, 38 ：125-133.
［36］魏鉴腾, 陈吉祥, 王淑娴, 等. 大菱鲆血清免疫球蛋白IgM 的纯化及应用研究[J]. 中国海洋大学学报， 2008, 38（6）: 932-936.

[1]	王宝宝, 王海洋. 理想株型塑造之于玉米耐密改良[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 11-30.
[2]	杨玉梅, 张坤晓. 应用CRISPR/Cas9技术建立ERK激酶相分离荧光探针定点整合的稳定细胞株[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 159-164.
[3]	吴元明, 林佳怡, 柳雨汐, 李丹婷, 张宗琼, 郑晓明, 逄洪波. 基于BSA-seq和RNA-seq挖掘水稻株高相关QTL[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 173-184.
[4]	饶紫环, 谢志雄. 一株Olivibacter jilunii 纤维素降解菌株的分离鉴定与降解能力分析[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 283-290.
[5]	石佳鑫, 刘凯, 朱金洁, 祁显涛, 谢传晓, 刘昌林. 基因编辑技术改良玉米株型增加杂交种产量[J]. 生物技术通报, 2023, 39(8): 62-69.
[6]	徐建霞, 丁延庆, 冯周, 曹宁, 程斌, 高旭, 邹桂花, 张立异. 基于Super-GBS的高粱株高和节间数QTL定位[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 185-194.
[7]	谢东, 汪流伟, 李宁健, 李泽霖, 徐子航, 张庆华. 一株多功能菌株的发掘、鉴定及解磷条件优化[J]. 生物技术通报, 2023, 39(7): 241-253.
[8]	车永梅, 郭艳苹, 刘广超, 叶青, 李雅华, 赵方贵, 刘新. 菌株C8和B4的分离鉴定及其耐盐促生效果和机制[J]. 生物技术通报, 2023, 39(5): 276-285.
[9]	申云鑫, 施竹凤, 周旭东, 李铭刚, 张庆, 冯路遥, 陈齐斌, 杨佩文. 三株具生防功能芽孢杆菌的分离鉴定及其生物活性研究[J]. 生物技术通报, 2023, 39(3): 267-277.
[10]	李旺宁, 张豪杰, 李亚男, 梁梦静, 季春丽, 张春辉, 李润植, 崔玉琳, 秦松, 崔红利. 莱茵衣藻蓝光受体植物类型隐花色素CRY突变体的表型鉴定[J]. 生物技术通报, 2023, 39(2): 243-253.
[11]	程静雯, 曹磊, 张艳敏, 叶倩, 陈敏, 谭文松, 赵亮. CHO细胞多基因工程改造策略的建立及应用[J]. 生物技术通报, 2023, 39(2): 283-291.
[12]	胡锦超, 沈文琦, 徐超业, 樊雅祺, 卢浩宇, 蒋雯杰, 李世龙, 晋洪晨, 骆健美, 王敏. 微生物酸胁迫耐受性能强化的研究进展[J]. 生物技术通报, 2023, 39(11): 137-149.
[13]	唐瑞琪, 赵心清, 朱笃, 汪涯. 大肠杆菌对木质纤维素水解液抑制物的胁迫耐受性[J]. 生物技术通报, 2023, 39(11): 205-216.
[14]	王兵, 赵会纳, 余婧, 陈杰, 骆梅, 雷波. 利用CRISPR/Cas9系统研究REVOLUTA参与烟草叶芽发育的调控[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 197-208.
[15]	郭文博, 路杨, 隋丽, 赵宇, 邹晓威, 张正坤, 李启云. 球孢白僵菌真菌病毒BbPmV-4外壳蛋白多克隆抗体制备及应用[J]. 生物技术通报, 2023, 39(10): 58-67.