生物技术通报

高等植物赤霉素生物合成关键组分GA20-oxidase 氧化酶基因的研究进展

吴建明, 陈荣发, 黄杏, 丘立杭, 李杨瑞

2016, 32(7): 1-12. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.001

摘要 ( 535 )

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GA-20氧化酶（GA-20 oxidase）是重要的GA生物合成和调控酶,直接催化生成有生物活性的GAs,是一种多功能酶,最显著的特点就是负反馈调节。GA20-氧化酶在植物发育和生理过程中起着重要的调控作用。综述了高等植物体内GA20氧化酶基因的克隆及表达调控研究及其对株高、纤维、开花、产量性状等影响,重点阐述了GA20氧化酶基因与激素、光周期、抗性等之间的相互作用,以便更好地揭示GA-20氧化酶信号网络系统及其作用机制。

落地生根胎生苗发育及其相关基因研究进展

蒋文婷, 曾会明

2016, 32(7): 13-20. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.002

摘要 ( 281 )

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落地生根通过在叶片上形成胎生苗而进行无性繁殖。胎生苗在发育过程中经历了与合子胚发育类似的各个阶段。胎生苗的发育同时具有器官发生和胚胎发生的特征。研究表明,胎生苗的形成需要SHOOT MERISTEMLESS（STM）基因;LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）基因在胎生苗发育过程中表达,但落地生根胎生苗的形成并不需要LEC1基因。FUSCA3（FUS3）基因、SAHH基因以及其他相关基因在落地生根胎生苗发育过程中的作用有待进一步的研究。对落地生根胎生苗的发育过程及相关基因进行综述,以期为相关研究提供一定的参考。

骨髓间充质干细胞分化过程中表观遗传调控机制的研究进展

王连庆, 翟俏丽, 赵培庆, 李涛

2016, 32(7): 21-27. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.003

摘要 ( 283 )

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骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）具有自我更新的能力和多向分化潜能,在体外可被诱导分化成多种细胞类型,在骨及软骨组织修复中具有重要的临床应用价值。为研发有效促进BMMSCs定向分化的药物,将BMMSCs更合理安全地应用于临床,有必要阐明表观遗传在BMMSCs分化过程中的调控机制。由于BMMSCs的异常分化可导致疾病的发生,其分化调控机制一直是研究的热点。表观遗传调控,如DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化及非编码RNA等,对决定BMMSCs分化方向至关重要。阐明表观遗传在BMMSCs分化过程中的调控机制,将有助于研发有效促进BMMSCs定向分化的药物,更合理安全地将BMMSCs应用于临床。就BMMSCs分化中的主要表观遗传调控机制的最新研究进展做一综述,并进行了总结。

黏着斑激酶信号通路在细菌侵入非吞噬细胞中的作用

贾晓阳, 付玉, 王潇楠, 王志钢, 郝慧芳

2016, 32(7): 28-33. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.004

摘要 ( 397 )

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细菌对宿主细胞的黏附和侵袭是引发传染病的重要步骤。细菌在黏附的过程中,其表面结构或特殊黏附分子和宿主细胞表面受体相互作用激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）,通过FAK/Src-Cortactin-Arp2/3通路和FAK/PI3K-Rac通路调控细胞骨架重排,促进细菌侵入非吞噬细胞。为了深入探讨细菌侵入非吞噬细胞的整个过程及调控机制,就细菌对非吞噬细胞的黏附、侵入以及细胞FAK信号通路在此过程中的调节作用进行综述。

高山被孢霉的基因组及转录组的提取技术研究

凌瑞, 孙立洁, 陈祥松, 袁丽霞, 吴金勇, 姚建铭

2016, 32(7): 34-39. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.005

摘要 ( 317 )

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基因组和转录组的高通量测序对样品的纯度和含量要求较高,旨在通过研究高山被孢霉在不同培养条件下和采用不同菌丝处理方法对其基因组和转录组质量的影响来确定最佳提取方式。结果表明,PDA培养基培养的菌丝与发酵培养基培养的菌丝经基因组提取后在琼脂糖凝胶电泳中有明显不同的表现,使用发酵培养基培养的菌丝提取的基因组DNA无降解,而以PDA培养基培养的菌丝提取的基因组DNA出现部分降解。在使用国产试剂盒做高山被孢霉转录组RNA提取实验中发现,使用液氮速冻后破碎菌丝并结合使用β-疏基乙醇更易提取到高浓度且无降解的转录组样品。

基于高通量测序的发芽苦荞转录组学研究

陈春旭, 李琦, 郭元新, 杜传来, 丁志刚

2016, 32(7): 40-47. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.006

摘要 ( 264 )

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采用新一代高通量测序技术Illumina SolexaHiseq 2500对发芽荞麦转录组进行测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,获得了42 953 962个序列读取片段（reads）,包含了5.37 Gb碱基序列信息。对reads进行序列组装,获得45 278个单基因簇（unigenes）,平均长度862 bp,序列信息达到了39 Mb。另外,从长度分布、GC含量、表达水平等方面对unigenes进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。数据库中的序列同源性比较表明,2 127个unigenes与其他生物的己知基因具有不同程度的同源性。发芽苦荞转录组中的unigenes与细胞进程、细胞和蛋白结合相关。将unigenes与KOG数据库进行比对,根据其功能大致可分为24类。以KEGG数据库作为参考,依据代谢途径可将unigenes定位到328个代谢途径分支,包括核糖体代谢通路、碳水化合物代谢等,并且筛选出38条参与GABA合成的氧化磷酸化代谢的unigenes。SSR位点查找发现,从71 366个unigenes中共找到7 141个SSR位点。SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的为A/T,其次是AAG/CTT和AT/AT。

应用高通量测序技术研究柽柳、獐茅土壤真菌多样性

王艳云, 郭笃发

2016, 32(7): 48-53. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.007

摘要 ( 242 )

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应用454高通量测序技术对柽柳和獐茅地土壤真菌种类及多样性进行研究,并对其进行真菌多样性指数和相似性分析,为黄河三角洲真菌多样性深入的研究和盐碱地的改良提供基础数据和理论依据。结果表明,4个土样共获得5门17纲37目48科51属。OTU数和多样性指数表明：柽柳上层（C1：0-20 cm）土壤真菌多样性最丰富,其OTU数、Shannon指数、Chao1指数分别是獐茅下层（Z2：20-40 cm）相应指数的1.7倍、1.2倍和2.4倍。距离热图分析表明,Z1和Z2真菌群落间的相似性最大,Unifrac metric值为0.269 9;C1和C2真菌群落间相似性最小,Unifrac metric值为0.690 2。柽柳地土壤真菌较獐茅地土壤真菌丰富。

重组溶葡萄球菌酶成品蛋白含量测定方法的建立

许燕, 张宜涛, 叶贵子, 陆海荣, 黄青山

2016, 32(7): 54-58. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.008

摘要 ( 351 )

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重组溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin,rLysn）对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性,是一种新型抗菌药物,含有该酶的药用制剂在临床上能有效控制金葡菌感染。为在rLysn成品中增加蛋白含量测定以控制制剂的质量,建立了成品中rLysn蛋白含量测定方法,并进行验证。采用体积排阻高效液相色谱法（size exclusion high performance liquid chromatograph,SE-HPLC）测定rLysn理化对照品及成品蛋白质含量。色谱柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm,5 µm）;流动相：20 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）+0.3 mol/L NaCl;流速：0.5 mL/min;柱温：25℃;检测波长：280 nm。结果显示,rLysn在2-32 µg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r²=1）;低、中、高3种浓度的rLysn理化对照品空白加标平均回收率为102.9%,成品加标平均回收率为102.1%;3种不同上样量在不同时间内测定,蛋白含量RSD<1%;每隔1 h测定同一支供试品溶液,蛋白含量RSD为0.98%;同一批供试品溶液取6份进样,蛋白含量RSD为1.71%。实验结果表明,采用SE-HPLC方法简便,准确性、精密度、稳定性及重复性好,可用于rLysn成品蛋白质含量的测定。

跨膜蛋白AgrC_TM6-7C分离纯化方法的优化

王路路, 权春善, 许永斌, 王冠天, 刘爽, 陈莹

2016, 32(7): 59-65. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.009

摘要 ( 229 )

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旨在通过优化AgrC_TM6-7C蛋白的纯化过程,获得高纯度的目的蛋白,为后续研究提供材料。详细探讨了金属离子螯合层析缓冲液中咪唑浓度、离子交换层析缓冲液的pH值对AgrC_TM6-7C蛋白纯化效果的影响,并研究了β-巯基乙醇对AgrC_TM6-7C蛋白聚集及其激酶活性的影响。经过优化后,在不影响AgrC_TM6-7C蛋白激酶活性的前提下,AgrC_TM6-7C蛋白在浓度和纯度上均有明显提高,纯度可达98%以上,产量可达15 mg/L。

油菜（Brassica napus）Bna-miR1140基因启动子miR1140Pro的克隆与表达模式研究

董云, 王毅, 靳丰蔚, 孙万仓, 刘自刚, 方彦, 徐妙云, 王磊

2016, 32(7): 66-72. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.010

摘要 ( 244 )

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旨在研究Bna-miR1140的表达模式及其调控机理,依据本实验室前期的油菜miRNA芯片实验结果,从油菜栽培种Westar中克隆了Bna-miR1140前体序列上游1.5 kb的片段,并进行了顺式作用元件分析,然后构建了GUS报告基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将miR1140 pro∷GUS转化到甘蓝型油菜Westar品种中,经PCR法鉴定获得5株阳性株。对阳性株油菜T1代各组织的GUS化学染色分析表明,miR1140前体序列上游1.5 kb区域具有启动子的功能,能够驱动GUS在油菜中表达,并且GUS基因仅在叶柄及叶腋中特异性表达,说明油菜miR1140Pro为特异性启动子。

山药Actin基因片段的克隆及表达分析

龚明霞, 周芸伊, 王爱勤, 罗海玲, 何龙飞

2016, 32(7): 73-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.011

摘要 ( 255 )

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通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据GenBank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因（Actin）的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交GenBank（登录号：KU669295）。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。

香蕉水通道蛋白SIP2-1基因的克隆和表达分析

许奕, 侯晓婉, 徐碧玉, 金志强, 胡伟, 宋顺

2016, 32(7): 81-86. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.012

摘要 ( 232 )

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从香蕉中克隆了一个水通道蛋白（AQP）基因MaSIP2-1。序列分析表明,该基因存在一个完整的开放阅读框（ORF）717 bp,编码 239个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,MaSIP2-1所编码的蛋白与其他植物中AQP编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉、油棕、麻风树、野茶树的AQP编码的氨基酸序列的同源性较高,分别为98%、74%、65%和63%。器官特异性分析表明,MaSIP2-1在香蕉的根、茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在茎中表达量较高。通过对其在干旱、高盐、低温、涝害胁迫下的表达结果分析显示,该基因响应干旱、高盐、涝害3种胁迫。

内生菌次生代谢产物提高玉米渗透胁迫抗性的表达谱分析

王娜, 龚娜, 刘国丽, 马晓颖, 杨镇, 杨涛

2016, 32(7): 87-92. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.013

摘要 ( 260 )

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利用基因芯片技术对10% PEG 渗透胁迫下植物内生菌次生代谢产物处理的玉米进行差异基因表达谱分析。结果显示,检测到的差异表达基因共计441个,其中上调表达基因147个,下调表达基因294个,参与21条代谢通路。采用晶芯生物分子功能注释系统 V 3.0（MAS）将差异表达基因进行GO功能分类,其中45%基因参与各种生物学过程;18%基因与生成各种细胞组分有关;36%基因编码产物则与执行各种分子功能有关;1%与GenBank 中功能未知序列相对应。KEGG 代谢分析表明差异表达基因广泛涉及基础物质代谢、能量代谢、次生代谢及信号转导途径。表达谱分析结果表明,在渗透胁迫下次生代谢产物对玉米的影响是一个多基因参与、多个生物途径协同调控的过程。

利用苹果EST-SSR分析木瓜属种质遗传多样性

张艳艳, 齐红, 郭庆梅, 孙稚颖, 周凤琴, 李圣波

2016, 32(7): 93-98. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.014

摘要 ( 271 )

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利用苹果属的EST-SSR标记对33份木瓜种质资源进行遗传多样性研究,以分析引物在木瓜属中的通用性。筛选出15对引物进行PCR扩增,其中9对引物显示多态性,共扩增出71条带,其中多态性条带59条,多态性条带比率83.10％,并且可成功区分不同种。PIC多态性信息含量平均值为0.45,Nei’s 基因多样性（H）、Shannon指数（I）的平均值分别为0.45、0.71。根据 EST-SSR 数据的UPGMA聚类分析将材料分为五大类,木瓜属的不同基原样本各聚为一支,能很好地将5个种植物区分,显示出单系性。研究结果表明,苹果属的EST-SSR标记在木瓜属上具有高度的可转移性,可应用于木瓜属植物的资源评价及遗传关系研究。

温度对裂片石莼生长及叶绿素荧光特性的影响

黄艳花, 杨锐, 孙庆海

2016, 32(7): 99-105. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.015

摘要 ( 230 )

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旨在研究裂片石莼（Ulva fasciata Delile）对温度适应机制,将藻体于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、33℃、35℃培养7 d,再经过25℃培养2 d,通过测定不同温度下裂片石莼的生长变化、叶绿素含量、叶绿素荧参数及25℃再培养后叶绿素荧光参数探讨不同温度对裂片石莼的影响。结果显示,25℃培养的藻体的生长、叶绿素含量、叶绿素荧光参数（F_v/F_m、F_v'/F_m'、α、qP）等最大;随着温度的升高或者降低,各项生理指标逐渐降低,而非光化学淬灭系数NPQ随着温度增大或者降低逐渐升高,10℃培养最大,5℃、35℃条件下的各项生理指标最低。5℃、10℃、15℃、20℃、30℃下的藻体经过25℃培养2 d后F_v/F_m、F_v'/F_m'都有所提高,10℃培养后的藻体提高最大,33℃、35℃再培养后F_v/F_m、F_v'/F_m'几乎没有变化。研究表明,裂片石莼生长和光合作的最适温度范围为15℃-30℃,5℃和35℃分别为其最高和最低耐受温度,裂片石莼对低温的耐受性大于高温。

拮抗多种植物病原真菌Streptomyces triostinicus C2的分离与鉴定

彭卫福, 吴志明, 陈未, 曾勇军, 李昆太

2016, 32(7): 106-111. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.016

摘要 ( 263 )

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旨在分离筛选获得对植物病原真菌具有抑制作用的拮抗菌。以水稻纹枯病菌为指示菌,采用平板对峙培养法进行拮抗菌的分离筛选;根据菌体形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,对拮抗菌进行菌种鉴定。结果显示,从采集自云南、广东、安徽、湖北、江西等地的18个土样中分离筛选到一株对水稻纹枯病菌具有良好抑制效果的菌株C2,该菌株初步鉴定为Streptomyces triostinicus,并暂命名为链霉菌 C2;进一步测定链霉菌C2的抗菌谱发现,它对水稻纹枯病菌、水稻稻瘟病菌、葡萄炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和橘青霉等多种植物病原真菌均具有良好的抑制作用,其抑菌率分别为49.78%、56.62%、80.96%、18.59%和94.10%。链霉菌C2是一株植物病原真菌广谱拮抗菌。

Act0988拮抗菌株鉴定及培养条件与菌株生长关系研究

张镜,牟利辉,刘志伟,况伟,黄思梅,刁树平,江娜,管曦光

2016, 32(7): 112-118. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.017

摘要 ( 195 )

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Act0988菌株产对柑橘青霉等多种霉菌具抗菌活性的代谢产物,对菌株进行鉴定、研究培养条件与菌株生长的关系,以为后续开发菌株产抗菌物质的培养基筛选及发酵工艺技术的研究奠定基础。以菌株的形态、培养特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析进行菌种鉴定,三角瓶液体振荡培养研究碳氮源、温度、pH及氧与菌株生长的关系。结果表明,Act0988菌株为多产色链霉菌（Streptomyces polychromogenes）,菌株生长最佳碳源为可溶性淀粉,发酵液生物量5.8 mg/mL;酵母膏与蛋白胨为最佳氮源,生物量5.7 mg/mL左右。菌株最适温度28℃,生物量6.0 mg/mL。最适初始pH7.0,生物量6.2 mg/mL;最适装液量60 mL/500 mL,生物量6.3 mg/mL。Act0988菌株易培养,发酵液抗菌活性强,菌株产抗菌物质具有突出的开发利用潜力。

不同窖龄窖泥微生物群落结构与理化指标的相关分析

钟姝霞,邓杰,卫春会,罗惠波,万世旅,黄治国

2016, 32(7): 119-125. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.018

摘要 ( 253 )

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旨在研究不同窖龄窖泥中主要微生物群落结构的多样性和窖泥理化指标（pH、总氮、腐殖酸、有效磷和总酸）的变化规律,并进行了相关性分析。采用凯氏定氮等方法对理化指标进行测定,通过DGGE技术研究微生物群落结构的变化,结合SPSS软件对其相关性进行分析。结果表明,随着窖龄的增加,窖泥的pH基本没有变化,总酸呈缓慢下降的趋势,总氮先上升后下降,腐殖酸和有效磷都缓慢增加;细菌和古菌的多样性指数分别在1.62-2.58和1.79-2.33之间,并都随着窖龄的增加而逐渐增加;细菌的群落结构与腐殖酸、总酸、有效磷的相关系数分别为0.972（P<0.01）、-0.987（P<0.01）、0.878（P<0.05）,古菌的菌落结构与腐殖酸、总酸、有效磷的相关系数分别为0.986（P<0.01）、-0.954（P<0.05）、0.901（P<0.05）,其他指标的相关性不显著;选取细菌中11个优势条带割胶测序发现大多数都为杆菌,选取了古菌4个优势条带割胶测序发现均为产甲烷菌。窖泥的理化指标和微生物群落结构随窖龄的变化呈现一定的规律,而部分理化指标与微生物群落结构有极强的相关性,这些指标对窖泥微生物驯化有极大的关系。

韦兰胶合成菌的原生质体制备与再生研究

周明明, 李晓雁, 任梦楠, 程珂萌, 黄海东

2016, 32(7): 126-130. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.019

摘要 ( 325 )

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旨在研究EDTA预处理、菌龄、酶解浓度、酶解温度及酶解时间对Sphingomonas sp. ATCC 31555原生质体制备与再生的影响。结果表明,菌龄10 h,12 mmol/L EDTA预处理,溶菌酶浓度45 µg/mL、酶解温度28℃、酶解时间25 min。得到原生质体的形成率达97.3%,再生率达33.9%。研究结果为菌株进行原生质体融合、基因组改组等选育优良菌种提供参考。

球根白丝膜菌γ-actin基因的克隆及表达分析

张虹,峥嵘

2016, 32(7): 131-137. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.020

摘要 ( 297 )

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根据真菌肌动蛋白（actin）基因保守区序列设计引物,用简并PCR法和RACE技术分离得到球根白丝膜菌（Leucocortinarius bulbiger）γ-肌动蛋白基因（Lb-act）的全长cDNA序列。该序列全长为1 357 bp,包含一个1 137 bp的开放阅读框（ORF）,编码378个氨基酸,5'端非翻译区（5' UTR）92 bp,3' UTR长度128 bp。Port Param软件在线分析结果表明,该cDNA所编码的蛋白质理论等电点为5.12,相对分子质量为95.022 kD,具有真菌γ-actin基因3个保守特征序列。Blast同源性检索结果表明,Lb-act氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列有较高的相似性,其与双色蜡蘑的肌动蛋白氨基酸序列的亲缘关系最近。Lb-act基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致,验证了该基因作为分子内标的可靠性。

蓝藻橙色类胡萝卜素蛋白的基因克隆及在大肠杆菌中的异源表达和功能分析

刘畅,罗著,张梦如,杨玉梅,刘娴,龚明,邹竹荣

2016, 32(7): 138-145. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.021

摘要 ( 288 )

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旨在体内证明蓝藻橙色类胡萝卜素蛋白（OCP）具备不依赖类胡萝卜素的单线态氧（¹O₂）清除功能。通过PCR扩增蓝藻OCP基因,对其进行原核诱导表达,并通过细菌点板和生长曲线测定法检验它在大肠杆菌中的抗¹O₂活性。结果表明,直接从蓝藻水体提取的宏基因组中成功扩增得到OCP基因SyOCP,其编码区大小为954 bp。生物信息学分析表明,SyOCP来源于主要蓝藻种类——集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。经IPTG诱导,SyOCP基因在大肠杆菌中获得了高水平的可溶性表达。另外,异源表达SyOCP的重组大肠杆菌对常见的¹O₂光敏诱发剂染料——亚甲基蓝的耐受性得到了显著增强。蓝藻OCP（不结合类胡萝卜素）内在的抗¹O₂功能在大肠杆菌中得到了体内验证。

红花脂质转运蛋白基因的克隆及表达分析

韩怡来, 崔琪, 武云云, 顾天瑶, 滕孝花, 胡人阁, 吴贯达, 官丽莉, 李海燕, 李校堃

2016, 32(7): 146-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.022

摘要 ( 260 )

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克隆红花脂质转运蛋白基因（Lipid transfer protein,LTP）,并进行生物信息学及表达分析,旨为研究LTP在红花抵抗逆境胁迫中的作用提供依据。通过RT-PCR方法从红花种子中克隆LTP基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LTP与相关物种LTP的系统进化树,利用Real-time PCR方法分析在红花不同号组织中LTP基因的表达量。结果显示,LTP基因ORF全长294 bp,编码97个氨基酸,相对分子量为7.46 kD,等电点为8.91。红花LTP蛋白包含一个长为29个氨基酸残基的信号肽序列;该蛋白含有一个丝氨酸磷酸化位点;三级结构预测表明该蛋白是由3个α-螺旋和一个β-转角简单的缠绕在无规则卷曲上的简单结构。分子进化表明,红花LTP基因与十字花科的甘蓝型油菜进化关系最近。通过荧光定量PCR对红花LTP基因的组织表达特异性进行分析,结果表明CtLTP在不同组织的表达水平具有显著差异,在种子和花中呈现高表达,而在其他组织中低表达。

点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究

高庆华, 胡美荣, 吴芳彤, 陶勇, 王云鹏, 罗同阳, 胡常英

2016, 32(7): 152-159. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.023

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旨在克隆点青霉菌（Penicillium notatum）中的葡萄糖氧化酶基因（GOD）,在毕赤酵母（Phchia pastoris）中异源表达,纯化并研究其酶学性质。利用PCR技术从点青霉 No.8312菌株的基因组 DNA中克隆得到 GOD基因,将该基因克隆到穿梭载体pMD-AOX上并在毕赤酵母X33中表达,对纯化后的葡萄糖氧化酶的酶学性质进行分析。结果显示,X33-GOD可高表达具有活性的GOD,在30℃、pH6.5的条件下,其培养液上清GOD酶活可达496 U/mL,比活123.0 U/mg;重组表达的葡萄糖氧化酶最适温度为40-45℃,最适pH为6.0,酶的稳定性研究表明,该酶在pH3.5-7.0区间和温度低于50℃下稳定。1 mmol/L Zn²⁺对其有激活作用;Ag⁺对该酶活性有较大抑制作用。构建出GOD的高产毕赤酵母工程菌株,与点青霉GOD相比,具有更高的发酵酶活和比活。

粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究

高染染, 刘倩, 孙文良, 孙志勇, 刘浩, 田朝光

2016, 32(7): 160-169. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.024

摘要 ( 288 )

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旨在将模式丝状真菌粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）构建为蛋白质表达系统。通过真菌杂交技术构建出粗糙脉孢菌六突变缺失菌株LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）作为蛋白表达宿主菌株。该宿主菌株可以用纤维二糖作为诱导物诱导纤维素酶启动子表达,同时又消除了葡萄糖苷酶蛋白的背景条带,有利于目标蛋白表达纯化。构建了分别含有粗糙脉孢菌自身强启动子（Pcbh-1、Pcbh-2和Ptef-1）的3个新的高效表达载体,该载体带有融合标签蛋白tev-6×his-gfp,能高效方便的筛选阳性转化子,有利于后续目标蛋白纯化。以纤维素酶GH3-4和CBH-1为例,通过重组表达菌株纤维二糖诱导发酵液进行酶活测定、SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测显示,重组蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP成功进行了表达和分泌,分泌水平分别为2.77和2.83 mg/L。 Pcbh-1启动子重组蛋白表达水平最高,说明在纤维二糖诱导体系中启动子Pcbh-1的启动效率最高,初步建立了粗糙脉孢菌纤维二糖诱导的蛋白质表达体系。

漆酶Lac1338的酶学特性测定及定向突变对其酶解染料影响

张雪玲,陈小利,李荷

2016, 32(7): 170-177. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.025

摘要 ( 228 )

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为了获得表达量高、热稳定性好的漆酶,通过密码子优化合成漆酶基因lac1338、连接到pET-32a（+）载体上并在Escherichia coli BL21（DE3）中表达,获得HIS-Lac1338蛋白。酶学性质测定结果显示,以ABTS为底物时,HIS-Lac1338的比活力高达22.8 U/mg,Km 和Vmax 分别为567 μmol/L 和2.8 mmol/ （L·min·g）;HIS-Lac1338的最适反应温度为55℃,最适pH为6.0;在55℃以下保温2 h能保留50%的酶活性,在pH 4-8范围内孵育4 h仍保留50%以上的活性;HIS-Lac1338对Cu²⁺抗性强,Ca²⁺、Na⁺、K⁺对HIS-Lac1338有促进作用,而Co²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、Ag⁺等重金属离子对HIS-Lac1338有抑制作用。易错PCR方法得到的Lac1338的突变酶Lac16与HIS-Lac1338相比,对酸性紫7、溴酚蓝、考马斯亮蓝的降解率分别由10.9%、20%和25%提高到90.5%、67.8%和85%。结果表明,HIS-Lac1338具有较好的温度及pH稳定性,而通过易错PCR技术定向突变获得的突变酶Lac16的染料降解率大大提高。

玉米芯半纤维素水解液中抑制物对丁醇发酵的影响

顾春凯, 王根宇, 刘宏娟, 王革华, 吴剑荣, 张建安

2016, 32(7): 178-185. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.026

摘要 ( 243 )

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半纤维素水解液抑制物对微生物细胞的毒性限制了其在丁醇发酵中的应用,旨在探讨其对产丁醇共生体系TSH06的抑制作用并为其应用于丁醇发酵奠定基础。通过稀酸水解半纤维素制得水解液,采用P2培养基稀释的半纤维素水解液为底物,分别利用NaOH和氨水调节培养基pH值,结合实时荧光定量PCR方法来研究水解液对产丁醇共生体系TSH06的抑制作用。以NaOH调节pH抑制菌体的生长,氨水调节pH菌体可生长发酵。产丁醇菌株TSH06可以在50%稀释度以下的水解液中发酵生长,并且能够耐受并降解抑制物糠醛与5-羟甲基糠醛,最终丁醇产量达到4.16-5.16 g/L,低于P2培养基中的丁醇产量（8.83 g/L）。稀释水解液中,48 h之后乙酸浓度在3.18-4.16 g/L,远大于P2培养基中的乙酸浓度（低于2 g/L）。相对于P2培养基,在50%水解液中培养的TSH06有机酸生成途径关键基因的基因转录水平明显提高,而有机酸返耗途径以及丁醇生成途径的关键基因的基因转录水平则明显下降。水解液中过多的乙酸抑制了产酸期到产溶剂期的转化,而酸的累积使得菌体在底物被完全消耗之前就趋于衰退死亡,从而造成丁醇产量的降低与底物的不完全利用。

施氏假单胞菌PS59产脂肪酶发酵条件及脂肪酶洗涤性能优化

刘金辉, 李晓路, 姜岩, 王海宽

2016, 32(7): 186-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.027

摘要 ( 275 )

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旨在对施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）PS59产脂肪酶发酵培养基进行单因子优化及响应面分析,选择出最佳的碳氮源,并分别对加酶量、洗涤时间、洗涤温度、洗涤pH和表面活性剂添加量对脂肪酶洗涤效果的影响进行评估,确定各个因素最佳值。结果表明,实验室培养施氏假单胞菌产脂肪酶的最佳碳氮源分别为蔗糖和大豆蛋白胨。优化发酵培养基配方为（g/L）：大豆蛋白胨 22.39 g,蔗糖 10 g,K₂HPO₄·3H₂O 1 g,MgSO₄·7H₂O 0.5 g,无水CaCl₂ 0.05 g,橄榄油 8.1 g,pH 8.1,培养温度30℃,培养36 h获得平均脂肪酶产量为36.12±1.32 U/mL,相对于起始酶活15.65±4.81 U/mL,产量提高了1.3倍。确定最佳洗涤效果加酶量为100 U,最佳洗涤温度为25℃,最佳洗涤时间为25 min,洗涤pH对该脂肪酶洗涤效果影响不大。在最佳洗涤条件下,加酶洗涤液的洗涤效率可以提高30%-40%。

肺炎链球菌TCSs中WalR的克隆表达、保守性及抗原表位分析

韩道宾, 骆诗露, 黄健, 朱杰华, 陈泽慧, 闵迅

2016, 32(7): 194-199. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.028

摘要 ( 213 )

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通过构建PET28a-WalR表达载体并在大肠杆菌BL21中表达WalR重组蛋白,以评价其对C57小鼠的免疫原性;并分析其在不同血清型肺炎链球菌中的保守性和B细胞的抗原表位。以肺炎链球菌D39血清型WalR基因为模板,构建重组质粒PET28a-WalR并转入BL21诱导表达目的蛋白质。采用ClustalX 2.1软件对WalR蛋白在不同血清型S.pn中的保守性进行分析;利用DNASTAR软件对其B细胞抗原表位进行分析。结果显示,成功构建PET28a-WalR重组表达载体,经IPTG诱导后有大量高纯度的目的蛋白质,但其主要以包涵体形式存在;WalR蛋白在不同血清型肺炎链球菌中高达99.4%,其B细胞抗原表位可能位于9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218等氨基酸序列位点。成功获得大量以包涵体形式表达的肺炎链球菌WalR重组蛋白,并对其保守性和抗原表位进行了系统分析。

抗迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

杨川,秦艺丹,胡潜,李强

2016, 32(7): 200-205. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.029

摘要 ( 231 )

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以迟缓爱德华菌株2CDM001为抗原,利用杂交瘤技术制备了迟缓爱德华菌的单抗8D11、8H4、2F4、18C12、16E2、20D3、19G2、5F7、4E6、7C5、18H9。在特异性方面,单抗8H4和2F4特异性较差,与美人鱼弧菌ATCC33539、鮰爱德华菌ATCC33202等参考菌株均出现不同程度的交叉反应,而其余9株单抗特异性强,与实验中用到的除迟缓爱德华菌外的参考菌株均不结合;但与迟缓爱德华菌分离株的检测结果表明,仅有20D3和8H4可与所有分离株结合,其余单抗不能与实验中所有迟缓爱德华菌发生反应。由于单抗8H4与美人鱼弧菌ATCC33539有交叉反应,因此选单抗20D3和兔源多抗建立迟缓爱德华菌的双抗夹心ELISA检测方法,该方法特异性强,灵敏度达到5×10⁷CFU/mL。本研究扩充了迟缓爱德华菌单克隆抗体库,为迟缓爱德华菌单克隆抗体的进一步应用提供更多参考数据和可选择的材料。

阿魏菇醇提物抗肿瘤功效及三萜类成分的提取

王为兰,陈开旭,刘军,段魏魏,徐亚楠,张富春

2016, 32(7): 206-216. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.030

摘要 ( 317 )

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为探究阿魏菇醇溶性物质（PFECs）抗肿瘤功效,优化阿魏菇醇提物三萜类化合物（PFTPs）提取条件,获取最大提取率。采用MTT法检测PFECs对5种肿瘤细胞生长抑制活性;对两种正常细胞无明显抑制作用;采用超声辅助、微波辅助热水浸提法、单因素试验与响应曲面法相结合,对阿魏菇三萜类化合物提取工艺优化。结果显示,PFECs具有显著的抗肿瘤活性;PFTPs提取的最佳工艺参数为：料液比1∶19（g/mL）、提取温度75℃、提取时间22 min（超声40 min后）,提取率为4.42%。

新疆野生及栽培一枝蒿多糖对树突状细胞免疫功能的影响

杨雨, 杨秀梅, 赵干, 俞益, 张慧珍, 张爱莲

2016, 32(7): 217-226. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.031

摘要 ( 243 )

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研究和比较新疆野生与栽培一枝蒿多糖对骨髓来源树突状细胞（dendritic cells,DCs）成熟和功能的影响。超声法制备野生及栽培一枝蒿粗多糖;Sevage法除蛋白;蒽酮-硫酸法测定多糖含量;流式细胞术检测DCs的成熟;ELISA法检测IL-12和TNF-α的表达水平。结果显示,野生及栽培一枝蒿多糖含量分别为26.18%和22.14%,去除蛋白质后多糖含量分别为30.94%和27.06%;野生及栽培一枝蒿多糖均可以显著增强小鼠骨髓来源CD11c+DCs表面分子CD40,CD86及CD80的表达（P<0.05）;显著促进IL-12和TNF-α的表达（P<0.05）;显著降低DCs吞噬FITC-Dextran的能力;且相同剂量对DCs的免疫活性无显著性差异（P>0.05）;除蛋白和不除蛋白的野生及栽培一枝蒿多糖的免疫活性均无显著差异（P>0.05）。新疆野生和栽培一枝蒿多糖含量差异较小,并均可以促进小鼠骨髓来源DCs的成熟和功能,且差异不大。

CYP2C8及CYP3A4细胞表达体系的构建及其在小分子激酶药物对紫衫醇代谢途径抑制研究中的应用

李远,黄洁琼,李佳俊,汪维鹏,张洪建

2016, 32(7): 227-233. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.032

摘要 ( 277 )

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构建CYP2C8及其3种突变体细胞表达体系,以紫杉醇为底物研究CYP2C8基因多态性对其酶活性的影响,以及构建CYP2C8和CYP3A4共转染细胞体系研究小分子激酶抑制剂对紫杉醇代谢途径的抑制。根据基因文库分别合成CYP3A4以及CYP2C8及其3种突变体CYP2C8*2（805A>T）、CYP2C8*3（416G>A,1196A>G）、CYP2C8*4（792C>G）的基因编码片段,将其连接到PEGFP-N1表达质粒,测序验证。将CYP2C8野生型及其突变体分别转染HepG2细胞,24 h后加入紫杉醇进行孵育,通过建立好的LC-MS/MS方法对代谢物进行定量分析。同时,也将野生型CYP2C8和CYP3A4质粒按一定的浓度比转入HepG2细胞构建共表达体系。并筛选出合适的质粒浓度比转染细胞,在加入紫杉醇孵育时,同时加入小分子激酶抑制剂,考察小分子激酶抑制剂对紫杉醇代谢途径的抑制作用。结果表明,CYP2C8*4代谢酶对紫杉醇的代谢能力存在明显差异,其中CYP2C8 *2和CYP2C8 *3代谢活性分别是野生型的81%（P<0.05）和87%（P<0.05）,而CYP2C8*4则是野生型的65%（P<0.01）。尼洛替尼完全抑制了紫杉醇的代谢,阿法替尼对紫杉醇的两条代谢途径抑制达30%,而伊马替尼选择性抑制了CYPD3A4的活性。不同基因型CYP2C8对紫杉醇的代谢存在差异,可能是导致临床疗效不同的原因。小分子激酶抑制剂在与紫杉醇联合使用时,对紫杉醇代谢的抑制各不相同。

单核细胞增生李斯特菌喹诺酮耐药机制研究

姜晓冰, 于涛, 牛亚冰, 徐雅梦, 石磊, 王海磊

2016, 32(7): 234-241. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.033

摘要 ( 277 )

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以食源性单核细胞增生李斯特菌（LM）环丙沙星耐药株为研究对象,旨在调查LM对喹诺酮产生耐药的分子机制。采用琼脂二倍稀释法测定菌株对环丙沙星的最小抑菌浓度（MIC）;通过PCR检测喹诺酮耐药决定区（QRDR）基因突变以及质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因的分布;实时荧光定量PCR检测lde基因在LM菌株中的相对表达量;利用SOE-PCR技术构建lde基因缺失突变株,调查外排泵Lde的作用。结果表明,15株LM耐药菌株GyrA、GyrB、ParC和ParE亚基的氨基酸序列与敏感株100%相似;所有菌株中均未检出PMQR基因。加入外排泵抑制剂利血平后,菌株L28和L47对环丙沙星的MIC值分别下降为原来的1/8和1/4。lde基因在耐药株和敏感株中均有表达,且表达量相近;在环丙沙星的作用下,lde基因在耐药株中的相对表达量增加显著,而在敏感株中的表达量基本没有变化;加入利血平后,lde在耐药株中的表达明显受到抑制。缺失lde基因后,菌株对环丙沙星由耐药转为敏感;利血平存在下突变株对环丙沙星的MIC值不受影响。本研究证明外排泵Lde介导LM对喹诺酮类药物耐药。

牛早期胚胎发育中AID基因的表达及其调节区DNA甲基化的动态变化

奥旭东,萨如拉,王杰,王会敏,于海泉

2016, 32(7): 242-249. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.034

摘要 ( 203 )

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以具有DNA主动去甲基化作用的活化诱导胞苷脱氨酶（Activation-induced cytidine deaminase,AID,亦称为AICDA）基因为研究对象,检测其在牛卵母细胞及体外受精胚胎发育不同阶段的表达变化及其调节方式,揭示细胞重编程分子机制。应用Real-time PCR、BSP（Bisulfite Sequencing PCR）和免疫荧光化学等方法分析DNA甲基化对牛早期胚胎发育中AID基因表达的影响。结果显示,AID基因在牛早期胚胎发育中受DNA甲基化的调控,AID基因的T-DMR（tissue-dependent and differentially methylated region）位于其转录起始位点-88 bp – -431 bp。在牛卵母细胞成熟过程中,T-DMR第2和第3号CpG位点的DNA甲基化明显去除,而其他位点都未发生变化。卵母细胞在成熟过程中AID基因的积累与DNA甲基化状态变化相关。在牛体外受精胚发育早期的各阶段,尽管AID基因的表达不同,但AID基因T-DMR除第2和第3号CpG位点一直都维持去甲基化状态外,其他位点始终维持甲基化状态。推测其表达的变化可能是胚胎基因组激活有关。以上研究表明,AID基因T-DMR的低甲基化与其表达存在一定的相关性。通过免疫荧光检测发现,从卵母细胞成熟期到桑椹胚期,AID蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中。而囊胚时期大量AID蛋白集中于内细胞团,这可能对于内细胞团多能性的维持起重要作用。综上所述,牛卵母细胞成熟中积累的AID作用于受精过程,其启动子区的DNA去甲基化与AID基因的表达有关,胚胎基因组激活后AID基因的表达可能与胚胎发育有关。

保存方式和回软温度对蜜蜂标本DNA提取的影响

张红利,贾鑫磊,刘建霞,张永芳

2016, 32(7): 250-256. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.035

摘要 ( 238 )

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旨在探寻保存方式及制作干标本前回软温度对蜜蜂不同部位DNA的影响。采用酚-氯仿法对不同方式保存的蜜蜂以及不同温度回软后的蜜蜂干标本的总DNA进行提取,通过琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对DNA的提取结果进行鉴定。电泳结果显示,从新鲜标本、无水乙醇泡制或自然干燥保存半年的标本中均可提取到较高质量的总DNA,尤以头部与足部提取效果最佳。经不同水浴温度回软后保存半年的蜜蜂干标本总DNA提取结果显示,回软温度为65℃时对蜜蜂DNA的破坏性最小,DNA提取的最佳部位为蜜蜂足部。正交试验结果显示,55℃回软后的足部为蜜蜂干标本DNA提取的最优组合。PCR扩增结果显示,本实验提取的总DNA能成功地应用于蜜蜂线粒体基因16S rRNA和CO I的扩增。从保存方式、提取部位和回软操作3个因素对蜜蜂标本DNA的提取进行了研究,提供了较好的选择方案。

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