生物技术通报

长链多不饱和脂肪酸EPA、DHA的基因工程研究进展

李文宗,王磊

2016, 32(8): 1-7. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.001

摘要 ( 334 )

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长链多不饱和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acid,LCPUFA）对维持人体健康具有重要作用,对其需求逐年增加,但是由于环境污染与渔业资源的下滑,有限的鱼油资源越来越不能满足人们需求。运用现代生物技术人们已相继分离了多个LCPUFA合成相关基因,并阐明了多条LCPUFA合成代谢途径。通过转基因技术在高等植物中成功合成了对人体健康十分重要的长链多不饱和脂肪酸,尤其是二十碳五烯酸（EPA）,二十二碳六烯酸（DHA）。综述了LCPUFA的合成途径及转基因研究的最新进展,分析合成LCPUFA存在的问题及解决方法,并对未来多不饱和脂肪酸EPA,DHA的基因工程研究进行展望。

转录因子HIF-1α及其信号通路在疾病发生中的作用研究进展

杨梦思,周娜,王志钢,郝慧芳

2016, 32(8): 8-13. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.002

摘要 ( 655 )

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缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,是应答缺氧应激的关键因子。HIF-1α是缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）的一个亚单位,受缺氧调控并调节HIF-1的活性。在缺氧条件下,HIF-1α转移到细胞核内结合HIF-1β形成有活性的HIF-1,通过与靶基因上的缺氧反应元件结合调节多种基因的转录。HIF-1α可以与上下游多种蛋白组成不同的信号通路,介导低氧信号,调控细胞产生一系列对缺氧的代偿反应,在机体的生长发育及生理和病理过程中发挥重要作用,是生物医学研究的一个焦点。对转录因子HIF-1α及其信号通路在疾病发生中的作用进行了综述,介绍了HIF-1α在动物生长发育、炎症和肿瘤中的研究概况,并进行了展望,以便更好地应用于生物医学。

吲哚乙酸跨界信号调节植物与细菌互作

杨扬, 高克祥, 吴岩, 刘晓光

2016, 32(8): 14-21. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.003

摘要 ( 458 )

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吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）作为植物体内普遍存在的内源生长素参与调节植物生命活动的诸多方面。研究发现,自然界中不仅植物可以合成IAA,许多微生物（包括植物病原菌或益生菌）同样具有分泌IAA的能力,可以诱发植物病害,或促进植物生长。有趣的是IAA不仅作为细菌的次生代谢物干扰寄主植物的激素稳态,也作为信号分子影响细菌基因表达和生理活动,通过整合进入细菌复杂代谢网络,调节植物与细菌的相互作用。通过讨论植物相关细菌IAA的生物合成途径及其调控,以及参与调节细菌基因表达、影响细菌生理和行为及其与寄主植物的互作等,概述该领域的研究动态与进展,揭示IAA不仅调节植物生长发育和防御,也作为跨界信号在调控植物与微生物互作中发挥重要作用,旨在为深入研究和更好地了解IAA跨界信号机制,通过遗传操纵细菌IAA信号通路以改善植物生长发育及其胁迫耐力提供新思路。

核糖体展示研究进展

郭园

2016, 32(8): 22-27. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.004

摘要 ( 362 )

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核糖体展示是一种无细胞系统,可以从文库中筛选蛋白质和多肽。翻译的蛋白质及其mRNA同时结合在核糖体上形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体,通过配体亲和分离得到功能性蛋白及其编码的mRNA,转换成对应的DNA后进行相关蛋白的表达,可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等,而且其可以展示较大的文库而不受细菌转化的限制,可对毒蛋白、蛋白酶敏感和不稳定的蛋白质进行筛选,也可在特定位点进行氨基酸修饰。就核糖体展示技术的研究进展及其在蛋白质进化和筛选方面的应用进行综述。

螺旋藻形态建成研究进展

王福双,董世瑞,王素英

2016, 32(8): 28-33. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.005

摘要 ( 273 )

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螺旋藻形态变化是藻种衰退的表现,衰退的藻种产量下降,且不易于采集。同时,螺旋藻形态易变也给螺旋藻的分类和鉴定增加了难度。因此,研究螺旋藻形态建成机理在螺旋藻应用前景上具有重要价值。综述了国际上在螺旋藻形态建成方面的最新进展,总结了光照、温度、pH等对螺旋藻形态建成的影响,初步分析了螺旋藻形态建成机理,展望了应用新一代蛋白组学技术结合基因组学分析不同条件下螺旋藻形态建成机理。

大肠杆菌中生物药物的生产现状及展望

蔡东梅,龚国利

2016, 32(8): 34-40. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.007

摘要 ( 391 )

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大肠杆菌是表达药用异源蛋白的首选微生物,此宿主目前已生产约30%被批准的药用蛋白。大肠杆菌具有生长迅速、产率高、效益大及易扩大培养的优势,促使它成为生物技术行业中蛋白大规模生产常选择的表达宿主。但大肠杆菌中密码子偏好性的存在及糖基化、磷酸化和蛋白水解加工等翻译后修饰的缺乏会限制其生产较复杂的重组生物药物。综述了大肠杆菌表达系统中几项满足生物技术产业需求的相关创新技术,介绍如何利用相关技术进步使大肠杆菌糖基化异源蛋白和表达包括全长糖基化抗体在内的复杂蛋白的过程,并对存在的问题及其研究前景进行展望,旨在为帮助大肠杆菌顺利生产更复杂的药用糖基化蛋白。

猪体细胞核移植技术研究进展

张宏燕, 信吉阁

2016, 32(8): 41-46. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.008

摘要 ( 296 )

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猪体细胞核移植技术已发展十年多,技术日趋完善,许多实验室已可获得克隆猪和基因修饰猪。近年来新兴了多种基因高效靶向修饰和调控技术,为基因修饰猪研究奠定了技术基础,推进了基因修饰猪的研究从基础研究转向应用研究。介绍了猪体细胞核移植技术的发展历程,主要技术环节的优化,并对猪体细胞核移植的技术优势,在农业、生物医药上的应用及意义,存在问题与前景等进行了概述。

基于特异性生物识别分子的黄曲霉毒素快速分析方法研究进展

曾昆,杜道林,薛永来

2016, 32(8): 47-55. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.009

摘要 ( 255 )

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黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次级代谢产物,容易污染粮食作物及其制品,主要存在于发霉的粮食、豆类、坚果及与其相关食品中。黄曲霉毒素,具有极强的毒性和致癌性,尤其是黄曲霉毒素B1,是目前已发现的最强的天然致癌物质,严重威胁人类健康。目前食品中黄曲霉毒素的检测以高效液相色谱、液质联用等仪器分析方法为主,然而仪器分析方法具有设备昂贵、操作繁琐、需要专业人员等不足。近年来以特异性生物分子（抗体、重组抗体、适配体等）识别黄曲霉毒素,并结合不同的信号报告分子,建立了一系列黄曲霉毒素分析方法,检测快速、灵敏并易于操作,在食品安全领域广泛应用。着重从黄曲霉毒素的生物识别分子和信号报告分子两方面介绍目前黄曲霉毒素的快速检测手段,并对其进行比较和评价,同时对黄曲霉毒素快速检测方法的发展方向进行展望。

微生物固定化技术在河流治理中的应用及研究进展

于鲁冀, 李廷梅, 刘攀龙, 范铮

2016, 32(8): 56-61. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.010

摘要 ( 269 )

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微生物在污染物去除中发挥着重要作用,但是河流自身条件会限制微生物持久有效的发挥净化功能,微生物固定化技术则可以改善这种状况,起到强化微生物处理效果的作用。分析了微生物直接用于受污染河流治理的限制因素,阐述了微生物固定化技术的高效作用机理和改进方法,并对当前该技术应用存在的问题进行分析和未来研究的方向进行展望,以期为固定化技术用于河流污染治理提供理论参考和技术借鉴。

螺旋霉素生物合成中的分子、基因及发酵调控技术

郑育青

2016, 32(8): 62-68. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.006

摘要 ( 322 )

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螺旋霉素（spiramycin,SPM）是十六元环大环内酯类抗生素,在临床上占有重要的地位,其产生菌为生二素链霉菌（S. ambofaciens）。螺旋霉素由福洛氨糖（forosamine）、碳霉氨糖（mycaminose）和碳霉糖（mycarose）3个部分组成。简要介绍了螺旋霉素的理化性质和药理作用,以及生物合成途径与发酵工艺等方面的研究状况,根据螺旋霉素生物合成途径,分别从分子水平、基因水平及发酵工艺等3个方面对通过添加前体或对前体有利的物质及定向过量表达某些重要基因等提高螺旋霉素产量的技术进行了简要概述。

基于数字PCR的转基因水稻LL62品系精准定量检测方法建立

任怡菲, 高琴, 邓婷婷, 李想, 黄文胜, 陈舜胜, 陈颖

2016, 32(8): 69-76. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.011

摘要 ( 278 )

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为了促进转基因产品标识制度的顺利实施,对未获我国农业部批准的转基因水稻LL62品系进行精准定量检测方法研究,以保障我国进出口转基因农产品的检测监管。基于转基因水稻LL62品系外源插入片段和水稻基因组DNA的3'端旁侧序列设计数字PCR检测体系,建立了精准定量检测方法。结果显示,设计的引物探针反应效率高,基于此建立的数字PCR方法高度特异于转基因水稻LL62品系检测;方法可重复性好,生成微滴数相对标准偏差（RSD）值介于0.60%-11.11%;准确度高,3个混合样品（10%、1%和0.1%）测定值与真实值之间的偏差（bias）分别为0.12、0.09和0.10,相对标准偏差（RSD）介于0.09%-10.31%。建立的转基因水稻LL62品系微滴数字PCR定量检测方法简便快捷、特异性强、重复性好、准确度高,可准确有效地对农产品和食品中转基因水稻LL62成分进行精准定量分析。

转NtFer1基因粳稻空育131抗Fe²⁺胁迫能力分析

唐鑫华, 姜廷波, 高红秀, 王敬国, 邹德堂

2016, 32(8): 77-83. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.012

摘要 ( 247 )

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旨在研究烟草铁蛋白基因NtFer1功能,提高粳稻抗逆性等。利用农杆菌介导法将NtFer1基因转入粳稻空育131,经抗性筛选、PCR、Southern杂交、Northern杂交和RT-PCR检测等,表明外源基因已整合到空育131基因组中,并能够在子代稳定遗传表达。在缺铁和铁过量条件下培育T2代转基因植株,缺铁条件下转基因株系抗氧化酶活性（SOD、POD）、叶绿素相对含量、叶片总铁含量和根系生长量均显著高于对照,而丙二醛（MDA）含量显著低于对照;铁过量条件下转基因株系抗氧化酶活性（SOD）、叶片总铁含量、糙米总铁含量和根系生长量均显著高于对照,而MDA含量和稻瘟病叶瘟指数显著低于对照。表明铁蛋白基因NtFer1能够提高转基因植株抗氧化胁迫能力和稻瘟病抗性,增加植株铁离子储藏能力,增强植株缺铁胁迫的耐性和铁过量胁迫的抗性。

大豆GmAP1基因的功能初探

宋拉拉, 张晓玫, 陈福禄, 傅永福, 赵德刚

2016, 32(8): 84-89. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.013

摘要 ( 204 )

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以大豆天隆1号为材料,根据Glycine max Wm82.a2.v1中大豆基因组的预测序列,克隆出一个AP1同源基因,命名为GmAP1。该基因编码区CDS长度为711 bp,编码一个含236个氨基酸的蛋白质。对蛋白质序列的结构分析结果显示GmAP1蛋白符合MADS-box基因家族特征。为了初步分析GmAP1的功能,利用实时定量RT-PCR分析GmAP1在不同花器官中表达,并且在拟南芥中过表达该基因。在不同花器官中,GmAP1表达量不同,在花萼中表达量较高;花瓣次之。GmAP1过表达植株表现出早花、植株矮小以及花器官（花瓣、雄蕊和雌蕊）数量增多等表型。结果表明,大豆的GmAP1是一个功能保守的AP1基因,在花的发生和花器官发育中起着重要作用。

花生NBS-LRR类基因的克隆及表达特性分析

冯艳芳, 耿丽丽, 韩榕, 张杰

2016, 32(8): 90-95. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.014

摘要 ( 261 )

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基于花生转录组及基因组数据,克隆获得一个花生的NBS-LRR类抗逆基因的全长序列,该基因与大豆抗病性蛋白基因（KHN40407.1）的相似性为79%,命名为AhNDrp基因。该基因不含内含子,cDNA 全长2 832 bp,有5个典型的抗逆性蛋白保守结构域,其中DomainⅤ是富含亮氨酸的重复序列。荧光定量PCR分析表明,AhNDrp基因在花生根中特异性表达,且黄曲霉处理后该基因表达量显著上升,说明该基因可能参与抗病反应。

大蒜半胱氨酸合成酶的mRNA表达及生物信息学分析

郭天璐, 张欢欢, 杜建中, 郝曜山, 王亦学, 孙毅

2016, 32(8): 96-102. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.015

摘要 ( 263 )

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半胱氨酸合成酶的产物半胱氨酸是植物中含硫氨基酸的重要来源,大蒜中含硫氨基酸丰富,研究大蒜半胱氨酸合成酶的性质及生物学功能以明确其在大蒜硫代谢中的作用。利用生物信息学技术分析从NCBI数据库中获得的3个大蒜的半胱氨酸合成酶基因（AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4）的开放阅读框,预测其蛋白序列、分子量大小、蛋白质特性、亚细胞定位、系统进化等特征;通过荧光定量PCR分析了3个半胱氨酸合成酶的组织表达特性。结果显示,AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4的开放态读码框长度分别为1 152 bp、1 296 bp和1 236 bp;其编码蛋白的理论相对分子量分别为40.6 kD、34.1 kD和36.1 kD。AsGCS2被亚细胞定位于叶绿体中,而AsGCS3和AsGCS4均被定位于细胞质中。氨基酸比对结果表明,AsGCS2与AsGCS3相似度为70%,与AsGCS4相似度为59%;而AsGCS3与AsGCS4相似度为68%。进化分析图表明,AsGCS2属于Bsas2亚家族,AsGCS3属于Bsas1亚家族,AsGCS4属于Bsas6亚家族。荧光定量PCR结果表明,大蒜不同CSase的组织特异性是不同的,AsGCS2在叶中表达量最高,ASGCS3在根中表达量最高,而ASGCS4在叶和根中都有较高的表达量。3个半胱氨酸合成酶基因分别属于不同的Bsas亚家族,它们的组织表达特性也不相同,它们在大蒜不同组织中的半胱氨酸合成途径中起作用。

DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对AID基因修饰的牛胎儿成纤维细胞的作用

奥旭东,萨如拉,王杰,王会敏,于海泉

2016, 32(8): 103-112. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.016

摘要 ( 280 )

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以转AID基因细胞和AID基因敲减细胞为研究对象,旨在探讨5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR）对其细胞形态、细胞周期、相关基因表达及其基因启动子区甲基化状态变化的影响。此外,还分析了整体基因组去甲基化和位点特异性去甲基化之间存在的差别,探讨提高体细胞重编程效率的方法及其作用机制。通过Real-time PCR、BSP（Bisulfite Sequencing PCR）、Western blotting和流式细胞术等技术分析了5-Aza-CdR对转AID基因细胞和AID基因敲减细胞的影响。结果表明,5-Aza-CdR对转AID基因细胞的影响存在明显的剂量效应,浓度为4 µmol/L时,具有明显的细胞毒性,大量细胞死亡（P<0.05）。当使用处理浓度为1-3 µmol/L时,细胞形态发生改变,细胞增殖被抑制。核型分析显示,3 µmol/L浓度组处理就可以导致转AID基因细胞出现异常核型。使用1 µmol/L浓度处理细胞,明显增加了表达报告基因细胞的数量,细胞AID和SOX2的表达量都有所提高,并且SOX2基因启动子区的DNA甲基化水平也有所下降。5-Aza-CdR处理AID基因敲减细胞后,OCT4和SOX2的表达量较对照组明显升高,而NANOG却没有发生变化。结果显示,5-Aza-CdR处理转AID基因细胞可改变细胞形态、细胞周期和报告基因的表达,5-Aza-CdR处理后基因组整体去甲基化和AID基因的位点特异性去甲基化协同作用于体细胞重编程。

大鼠NKx6.1启动子克隆及特异性表达分析

王大玮,汪蓓蕾,姚远,陈皓,张欣,郭刚,张瑞

2016, 32(8): 113-116. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.017

摘要 ( 226 )

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旨在构建大鼠NKx6.1启动子的报告载体,验证转录因子T3R对NKx6.1启动子的调控活性。用PCR扩增大鼠脑组织NKx6.1的 5'上游启动子片段2.4 kb,应用生物信息学方法预测该片段上潜在的转录因子T3R结合位点,根据不同的结合位点作系列截短,获得3段长度不等的启动子缺失片段,分别克隆到荧光素酶报告基因表达质粒（pGL3-Basic）上,构建相应的报告载体。将报告载体和T3R共转染大鼠星形胶质细胞（rat astrocytes,RA）,并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示,成功构建大鼠NKx6.1启动子报告载体,双荧光素酶报告基因活性检测表明T3R对NKx6.1启动子有明显调控作用,其中-1 887 bp-1 507 bp活性最高,即存在关键顺式调控元件。克隆并筛选出启动子核心区域,揭示了甲状腺激素对大鼠NKx6.1的表达调控机制。

梅花鹿CGI99基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响

路晓,孙红梅,褚文辉,张伟,李春义

2016, 32(8): 117-121. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.018

摘要 ( 239 )

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利用慢病毒介导的基因沉默体系,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞（AP）中CGI99基因进行RNA干扰,并初步研究该基因对细胞增殖的影响。设计出1条针对梅花鹿CGI99基因的shRNA序列与载体质粒 pLVTHM连接,之后与pSPAX2、pMD2.G质粒共转染HEK 293t细胞,获得重组慢病毒,感染AP细胞;通过荧光定量PCR检测CGI99基因的下调水平;通过MTT实验检测CGI99基因沉默对AP细胞增殖影响。基因的表达水平大幅度下调,干扰效率达到70.8%;MTT实验的数据曲线趋于一致。结果表明,成功构建了针对梅花鹿CGI99基因的RNAi载体并干扰了CGI99基因在AP细胞中的表达,且初步确定CGI99基因对AP细胞的增殖并无显著影响。

鸭脂肪间充质干细胞分离培养与生物学特性

刘雪婷, 元虹懿, 张明海, 关伟军

2016, 32(8): 122-128. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.019

摘要 ( 273 )

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建立禽类脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）体外培养体系,探索其生物学特性和多分化潜能。通过酶消化法分离18日龄鸭胚ADSCs,绘制生长曲线,通过RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术阳性率检测对ADSCs进行鉴定,诱导ADSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化。结果表明,鸭胚胎ADSCs体外增殖能力良好;阳性表达CD29,CD44,CD105,表达率分别为95.39%、94.53%和98.19%;经体外诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。研究认为在适宜的培养条件下,体外培养的ADSCs能够稳定增殖并具有多分化潜能,可作为组织工程的种子细胞进行保存。

基因组水平预测稻瘟菌分泌蛋白组及富集分析

曹继东, 刘俊, 李遂焰

2016, 32(8): 129-138. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.020

摘要 ( 342 )

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稻瘟菌分泌蛋白在稻瘟菌入侵植物过程中发挥着重要的作用。这些分泌蛋白中有很多是效应蛋白,这些效应蛋白可以干扰寄主的抗性、抑制寄主免疫反应。因此,对稻瘟菌分泌蛋白组的预测及功能分析就显得十分必要,也是目前植物和微生物分子互作研究领域的热点。使用SignalP、TMHMM及SecretomeP等软件,完成稻瘟菌分泌蛋白组的预测。同时,对含信号肽的经典分泌蛋白进行了GO功能富集、KEGG通路分析、结构域统计以及可降解植物成分的经典分泌蛋白预测等分析。结果显示,稻瘟菌含有约789个分泌蛋白,其长度多集中在100-500 aa;GO功能分析发现,这些分泌蛋白多富集在分泌途径及宿主互作中;KEGG分析显示,分泌蛋白在糖代谢途径中发挥着重要作用;大规模筛选预测到156个分泌蛋白具有降解植物细胞壁等成分的功能;同时还发现稻瘟菌中有可能存在大量不含信号肽的非经典分泌蛋白。通过设计的生物信息学流程,实现了稻瘟菌分泌蛋白组的预测;预测出经典分泌蛋白具有可降解植物细胞壁等成分以及参与糖代谢途径的功能;稻瘟菌中存在大量的无信号肽的非经典分泌蛋白。

大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因的原核表达及重组蛋白的免疫效果初步分析

马冬梅, 邓国成, 白俊杰, 江小燕, 曹婷婷, 蔡磊

2016, 32(8): 139-144. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.021

摘要 ( 282 )

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为了预防近年来流行于广东省养殖大口黑鲈（Micropterus salmoides）中的病毒性溃疡综合征,以大口黑鲈溃疡综合征病毒（Largemouth bass ulcerative syndrome virus,以下简称 LBUSV）的主要衣壳蛋白（MCP）作为目标抗原蛋白,将MCP基因开放阅读框插入到pBV220载体中,转化大肠杆菌DH5α,构建重组表达MCP蛋白的工程菌。重组菌经过42℃温度诱导和SDS-PAGE电泳,检测到在分子量51 kD处有一条特异表达蛋白带,重组蛋白约占重组菌体总蛋白的30%。重组MCP蛋白经洗涤、纯化、溶解、复性和透析后纯度达90%以上。将纯化后的重组蛋白与不完全弗氏佐剂混合、乳化后,免疫大口黑鲈,然后进行感染实验,感染后20 d疫苗保护率最高达67.7%。结果表明,该病毒MCP蛋白具有一定的免疫原性,可以作为制作重组疫苗的候选蛋白。

家蝇肽聚糖识别蛋白（PGRP-SA）的克隆表达及细菌结合研究

罗嫚, 王宇, 胡亚, 修江帆, 王涛, 彭建, 尚小丽, 吴建伟

2016, 32(8): 145-151. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.022

摘要 ( 245 )

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对家蝇PGRP-SA 基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇（Musca domestica）幼虫cDNA 质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA 质粒为模板设计引物,通过PCR 扩增,获得PGRP-SA 基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a（+）-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR 检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF 全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 kD,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a（+）-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG 诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot 检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。

嗜麦芽寡养单胞菌角蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达

李光磊, 张娟, 方真, 隆明星, 堵国成, 陈坚

2016, 32(8): 152-160. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.023

摘要 ( 217 )

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将嗜麦芽寡养单胞菌BBE11-1来源的角蛋白酶基因kerD进行毕赤酵母密码子优化,构建重组载体pPIC9k-kerD;整合该重组载体到毕赤酵母SMD1168基因组,筛选到Mut⁺型重组子;对利用G418抗性筛选到的重组子进行甲醇诱导,筛选到产酶效果最好的重组菌株。纯化和SDS-PAGE检测表达的重组酶,研究重组酶的部分酶学性质,结果表明,重组酶的最适反应pH为10,最适反应温度为60℃。为进一步提高目的蛋白的产量,采用甲醇与山梨醇和甘露醇混合流加的策略,优化重组菌产角蛋白酶的发酵过程。结果表明,甲醇与甘露醇以20∶0.5比例混合流加,发酵168 h,角蛋白酶的产量2 048 U/mL,比单流加甲醇提高了87.2%。

嗜碱芽孢杆菌cotA基因克隆表达及部分性质研究

刘友勋,闫明阳,耿园园,黄娟

2016, 32(8): 161-168. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.024

摘要 ( 248 )

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为了获得具有高性能的多铜离子氧化酶,从极端微生物嗜碱芽孢杆菌（Bacillus clausii KSM-K16）中克隆表达了其芽孢外衣蛋白CotA。根据B. clausii KSM-K16的CotA序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,设计和合成出该基因全长序列,构建pET28a-cotA重组表达载体,将其转化到Escherichia coli BL21（DE3）并诱导表达出重组蛋白,纯化并研究了CotA部分生化特性。重组CotA约62 kD,表现出蓝绿色并在波长609 nm有铜离子特征吸收峰,能氧化ABTS、SGZ和胆红素等底物;以SGZ为底物,最适pH和温度分别为7.5和90℃;在80℃孵育2 h,能保持70%活性;在pH4-11范围分别孵育1 h,能保持90%活性。结果显示,嗜碱芽孢杆菌CotA是一种具有漆酶和胆红素氧化酶活性的典型多铜离子氧化酶,表现出热和酸碱稳定性。

一株玉米根际多功能促生菌的筛选鉴定及效应研究

万兵兵, 刘晔, 吴越, 张东艳, 王国文, 姜瑛

2016, 32(8): 169-176. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.025

摘要 ( 272 )

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从郑州市砂质潮土中分离纯化出5株玉米根际促生菌,通过测定其固氮酶活性、解磷能力、解钾能力以及吲哚乙酸（IAA）合成量,筛选出能够制作高效微生物肥料的活性菌剂。摇瓶结果表明,菌株YM4具有较高的固氮酶活性,溶解无机磷、钾的能力较强,合成IAA的能力最强。其中固氮酶活性达到15.53 nmol C₂H₄/（h·mL）,对磷酸三钙、难溶性硅酸钾的溶磷量和溶钾量分别达到128.90 mg/L和17.40 mg/L,IAA的合成量为37.18 mg/L。经形态观察、部分生理生化特征测定及 16S rDNA 的保守序列鉴定,确定该菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。盆栽试验结果表明,与对照组相比,接种该菌株的盆栽土壤中IAA、矿质氮、速效磷、速效钾含量分别提高了136.36%、42.1%、67.41%和14.29%;植株根系形态也发生了显著变化,其中根系总长、总面积、总体积、根尖总数分别增加了172.24%、141.73%、112.14%和104.53%;植株鲜重、株高、SPAD值及氮、磷、钾含量分别提高了130.07%、150.65%、151.56%、120.99%、166.33%和138.21%。该菌株具有高效固氮、解磷、解钾及合成IAA的能力,在农业生产的开发利用中具有较大应用潜力。

一种浸矿混合菌种的筛选、鉴定及浸矿的研究

聂毅磊,陈宏,罗立津,贾纬,陈星伟

2016, 32(8): 177-183. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.026

摘要 ( 254 )

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旨在从某低品位硫化铜矿酸性矿坑水中分离获得浸矿效果优良的细菌,同时对细菌的浸矿行为进行初步的研究。采集福建某低品位硫化铜矿酸性矿坑水样品,9K培养基富集获得混合菌种FIM-201304。利用9K固体平板,从混合菌FIM-201304中分离获得优势浸矿菌D-1。应用高通量Illumina Miseq测序技术分析混合菌FIM-201304 的群落结构。通过表型特征和16S rRNA基因序列分析鉴定菌株D-1。采用摇瓶培养对比研究混合菌和单菌对低品位硫化铜矿和低品位硫化镍矿的浸出效果。结果显示,高通量测序技术分析结果表明,混合菌FIM-201304 的优势菌是嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans,A. f errooxidans）（丰度占比85.02%）、铜绿色假单胞菌（Pseudomonas sp.）（丰度占比10.07%）、嗜酸异养菌（Acidiphilium acidophilum,A.acidophilum）（丰度占比1.30%）和鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）（丰度占比1.21%）。表型特征和16S rRNA 基因序列分析确定菌株D-1属于氧化亚铁硫杆菌。摇瓶实验结果表明,浸出反应20 d后,接种混合菌的浸出体系中铜、镍浸出率分别为65%和56%,相同条件下,接种单菌的浸出体系中铜、镍的浸出率为41%和36%,接种混合菌的浸出体系比接种单菌的浸出体系中铜、镍浸出率分别提高了24%和20%。混合菌对矿石的浸出效果显著优于单菌。异养菌促进了自养菌对矿石中金属元素的浸出。

海洋石油降解菌的筛选及复合菌系的构建

吴秉奇,刘淑杰,陈福明,周楚莹

2016, 32(8): 184-193. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.027

摘要 ( 258 )

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为采用生物法治理海洋石油污染,以原油为唯一碳源,从深圳海域5个采样点取样,通过富集、涂布平板分离高效石油降解菌,并以复配、正交等方式构建石油降解复合菌系;通过生理生化实验和16S rRNA 基因序列分析对菌株进行鉴定;采用单因素实验对复合菌系降解石油的条件进行优化,并使用气相色谱-质谱法（GC-MS）研究其对石油的降解特性。结果显示,共分离得到22株高效石油降解菌,对石油的降解率为34.5%-52.2%;由S1-30、S1-38和S2-13构建了复合菌系SQ1,对石油降解率可达68.3%,3株菌分别鉴定为棒杆菌（Corynebacterium sp.）、迪茨氏菌（Dietzia sp.）和拉布伦茨氏菌（Labrenzia sp.）;经优化,SQ1在最适条件下（30℃、pH7.6、石油浓度20 g/L）,11 d内对石油的去除率高达73.5%;GC-MS结果表明,复合菌系SQ1对石油总烷烃的去除率为91.7%,对较难降解的C21-C35烷烃组分的降解率接近100%。研究表明,复合菌系SQ1在海洋石油污染的生物修复中具有较强的应用潜力。

里氏木霉FS10-C可湿性粉剂的研制及其促生效果测定

罗洋, 滕应, 罗绪强, 李振高

2016, 32(8): 194-199. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.028

摘要 ( 271 )

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以对植物具有促生作用兼具重金属抗性的里氏木霉FS10-C为功能菌株,通过对载体、润湿剂、分散剂、保护剂的筛选,确定了里氏木霉FS10-C可湿性粉剂的最佳配方,并测定其施用对伴矿景天生长的影响。结果表明,该可湿性粉剂最佳配方为：孢子粉10%、高岭土74.6%、十二烷基苯磺酸钠5%、木质素磺酸钠10%、维生素C 0.4%。该配方悬浮率可达到72.48%,符合国标要求。盆栽实验结果显示,该制剂500倍稀释液对伴矿景天有良好的促生效果,使其地上部鲜重和干重与对照相比分别提高了14.70%及23.14%。

石斛内生甲基营养芽胞杆菌的拮抗和促生作用研究

武利勤,顾海科,王青,尚宏忠,刘桂君,包放

2016, 32(8): 200-206. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.029

摘要 ( 251 )

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从霍山石斛中分离内生菌,旨在获得具有广谱抗菌活性和促生作用的内生细菌。以石斛黑斑病菌为指示菌,用对峙培养法筛选具有抗菌活性的内生菌;对筛选到的具有拮抗活性的菌株进行抗菌谱和促生长潜力的测定。结果显示,从霍山石斛中分离获得22株内生细菌,其中菌株RA具有较强抑菌活性,根据16S rDNA 序列分析结果鉴定 RA为甲基营养芽孢杆菌 Bacillus methylotrophicus。菌株RA可以产生IAA、嗜铁素、蛋白酶、表面活性剂和生物膜,RA对 8 种植物病原菌也具有较好的抑制作用,具有广谱抗菌活性;并且可以显著促进玉米幼苗的生长。RA菌株具有作为生防菌剂和生物肥料应用的良好潜力。

利用酵母双杂交系统筛选雷竹SOC1相互作用蛋白

潘现飞,施泉,林新春,徐英武,曹友志

2016, 32(8): 207-213. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.030

摘要 ( 238 )

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在雷竹（Phyllostachys violascens）中找到SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）在开花途径中的作用靶标,进一步探索SOC1的作用机制。构建pGBKT7-PvSOC1诱饵表达载体,通过SMART技术构建开花时期的雷竹cDNA文库,酵母双杂交筛选与SOC1互作的蛋白,并对其进行分析鉴定。结果显示,成功构建了可用于酵母双杂交的cDNA文库,文库的转化率为每微克pGADT7-Rec 3.0×10⁶转化子,文库滴度为7.5×10⁶ cfu/mL,插入片段主要在250-2 000 bp之间。通过酵母双杂交实验得到与诱饵蛋白PvSOC1相互作用的蛋白,筛选到的靶标蛋白经鉴定是一个富含亮氨酸的蛋白激酶,特征氨基酸序列在不同物种中非常保守,与水稻中的同源蛋白亲缘性最高。

类弹性蛋白标签在大肠杆菌周质空间中表达研究

李晶泉, 林衡, 丁宁, 左晓雪, 史晋萍, 徐永平, 冷春玲, 杨春光

2016, 32(8): 214-220. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.031

摘要 ( 360 )

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旨在研究类弹性蛋白[I]₄₀（elastin-like polypeptide[I]₄₀,ELP[I]₄₀）在大肠杆菌周质空间的表达。构建表达载体pIG6LH/ELP[I]₄₀及pIG6LH/ELP[I]₄₀+Trx,分别将构建的表达载体转化入表达宿主菌E. coli BLR（DE3）,IPTG诱导表达,采用可逆相变循环（Inverse transition cycling,ITC）技术纯化蛋白。测定ELP[I]₄₀及ELP[I]₄₀+Trx蛋白相变温度（T_t）,检测ELP[I]₄₀、ELP[I]₄₀+Trx蛋白浓度及NaCl对相变温度的影响。结果显示,经3轮ITC纯化得到了ELP[I]₄₀、ELP[I]₄₀+Trx蛋白。分别测定ELP[I]₄₀ 和ELP[I]₄₀+Trx在10、25、50、75和100 μmol/L浓度下的T_t,其T_t依次为31.5℃、29℃、27℃、26℃、25℃和31.8℃、29.5℃、27.5℃、26℃、25.5℃;测定了不同浓度的NaCl对T_t影响,在ELP[I]₄₀和ELP[I]₄₀+Trx终浓度为25 μmol/L,NaCl浓度为0.25、0.5、0.75、1.00和1.25 mol/L时,分别使ELP[I]₄₀的T_t由29℃降至24.5℃、22℃、19℃、15℃和11.5℃,使ELP[I]₄₀+Trx的T_t由29.5℃降至25℃、23℃、20.2℃、15.5℃和11.8℃。在大肠杆菌周质空间表达的ELP[I]₄₀与胞内表达的具有相同的理化性质,ELP可作为在大肠杆菌周质空间表达的蛋白质分离纯化标签。

一株基因克隆干扰菌的鉴定及其发酵液降解DNA活性分析

刁文涛, 王雪妍, 陈晓飞, 冯菲, 宁萌, 周伏忠

2016, 32(8): 221-225. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.032

摘要 ( 235 )

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旨在寻找导致基因克隆失败的原因,检测整个电泳环境中是否存在对DNA有强降解力的菌株。依据菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列对DNA降解菌株进行鉴定,琼脂糖凝胶电泳分析菌株对DNA的降解活性。结果显示,从DNA电泳槽中分离到了一株菌,革兰氏染色鉴定为阴性菌,对该菌进行液体培养,利用质粒pUC19作为底物,检测该菌发酵液对DNA的降解能力,发现该菌发酵液能够迅速并彻底地降解DNA,其最佳降解温度为45℃,将该菌命名为DD（DNA degrading）。对该菌的16S rDNA进行测序比对后,发现其与粘质沙雷氏菌（Serrtia marcescens）的16S rDNA序列同源性高达100% 。结合菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列结果,DD菌株为一株粘质沙雷氏菌,DNA降解活性分析显示其具有很强的DNA降解能力。

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生成丙酮酸

于莹,许湄雪,刘金雷,范荣,冯惠勇,李天明

2016, 32(8): 226-232. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.033

摘要 ( 293 )

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旨在增加谷氨酸棒杆菌代谢过程中丙酮酸的积累、减少副产物的生成,利用同源重组的方法,敲除了丙酮酸代谢过程中支流代谢途径的关键基因：丙酮酸醌氧化还原酶pqo基因、丙酮酸脱氢酶pdh基因和乳酸脱氢酶lldh基因,获得了基因缺失工程菌株。利用4.5%的葡萄糖复合培养基,工程菌经摇瓶发酵48 h,丙酮酸的浓度达到14.6 g/L,而野生菌株仅为0.45 g/L;工程菌的糖酸转化率为33.18%,比野生菌提高了32.5倍。

金属离子对CHO细胞抗体表达及抗体电荷分布的影响

张鑫涛,唐红萍,赵亮,范里,刘旭平,缪仕伟,谭文松

2016, 32(8): 233-241. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.034

摘要 ( 746 )

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旨在深入认识金属离子在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养生产单克隆抗体过程中所发挥的作用。综合考察了不同铜离子和锌离子浓度下CHO细胞的生长、抗体的表达以及抗体的电荷分布情况。结果显示,一方面,当培养基中铜离子浓度为120 nmol/L、锌离子浓度为50 µmol/L时,最有利于CHO细胞的生长和抗体的表达。过高或过低的铜离子和锌离子均对细胞的生长和活性的维持产生了不利影响。另一方面,作为碱性羧肽酶抑制剂和辅因子的铜离子和锌离子对抗体的电荷分布有着重要的影响。当培养基中铜离子浓度为50 nmol/L、锌离子浓度为50 µmol/L时,最有利于减少抗体的电荷变体,提高主峰含量。过高或过低的铜离子和锌离子均导致了电荷变体的增加,主峰含量的降低。且两者的浓度和比例影响了抗体C末端赖氨酸的酶切过程,进而影响了碱性变体的含量。此外,对铜、锌离子的操作空间进行了初步的研究。金属离子在CHO细胞培养过程中对细胞的生长、抗体的表达以及抗体的电荷分布等方面都发挥着重要的作用。

分级微球BiOBr光催化材料制备及可见光灭菌性能研究

王亚, 林立, 李贝贝, 黄满红, 陈亮

2016, 32(8): 242-248. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.035

摘要 ( 253 )

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采用溶剂热法一步合成3D分级微球BiOBr,利用SEM、XRD和UV-vis等手段对其进行表征,考察所制备的BiOBr光催化材料在可见光下对大肠杆菌的灭菌性能,并初步探讨了其杀菌机理。结果表明,制备的BiOBr为直径为2 µm左右的微球,且在可见光下有较好的光响应。灭菌实验表明,BiOBr在可见光（λ>420 nm）照射下对革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coli）有较高的灭菌活性,0.5 mg/mL BiOBr时可见光照射12 h后,杀菌率可达70%以上。活性基团捕获实验表明,3D分级微球BiOBr通过空穴氧化破坏细菌的细胞膜和细胞壁,达到可见光下杀灭细菌的目的。

2016, 32(8): 300-300.

摘要 ( 115 )

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