生物技术通报

花烟草NaERF1基因的克隆及在非生物胁迫下的表达模式分析

鲁琳, 赵希胜, 刘桂雲, 刘维东, 王艳婷, 吴玲莉, 任学良, 鲁黎明

2020, 36(1): 1-8. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0550

摘要 ( 421 )

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AP2/ERF类转录因子,是植物所特有的最大的一类转录因子家族,在植物的生长发育过程中,扮演着重要的角色。探究花烟草ERF转录因子的生理功能,为花烟草抵御逆境的分子机制研究提供借鉴。采用同源克隆的方法进行基因克隆。通过对花烟草进行非生物胁迫,运用qPCR的方法进行基因表达模式分析。从花烟草（Nicotiana alata）中克隆了一个属于ERF家族的基因NaERF1。该基因的开放阅读框全长为819 bp,编码了272个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白分子量为30.7 kD,等电点为6.07;具有AP2/ERF类转录因子家族典型的保守结构域;该基因主要定位于细胞质内,并含有多个磷酸化位点。同源性分析的结果显示,NaERF1基因与茄科植物的ERF同源性较高,并且与普通烟草的ERF亲缘关系最近。NaERF1基因的表达具有组织表达特异性,花中表达量最高,茎中次之,根和叶中表达量较低。同时,在高盐、干旱、低温、ABA、低钾及H₂O₂等非生物胁迫下,NaERF1的表达呈现5种模式。其中,对低钾及ABA胁迫的响应强烈。NaERF1基因属于AP2/ERF类转录因子,可能广泛参与了花烟草包括非生物胁迫响应在内的众多生理过程。

橡胶草SRPP2基因克隆及表达分析

张睿珠, 江羽宸, 黄俊, 闫洁

2020, 36(1): 9-14. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0684

摘要 ( 449 )

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TkSRPP2是橡胶草SRPP基因家族的成员,在天然橡胶生物合成和橡胶粒子稳定方面起重要作用。采用PCR技术从橡胶草中克隆得到TkSRPP2基因全长序列,对其进行生物信息学分析、烟草亚细胞定位及定量表达分析。结果显示,TkSRPP2基因全长633 bp,编码210个氨基酸,蛋白质相对分子质量为23.15 kD,理论等电点（pI）8.51。系统进化分析表明TkSRPP2蛋白与莴苣SRPP3蛋白亲缘关系最近。烟草亚细胞定位显示TkSRPP2蛋白位于细胞质中。TkSRPP2基因在主要在根中表达,在6月龄橡胶草根部表达量最高。

稻瘟病菌分泌蛋白MoCDIE2诱导植物细胞死亡的功能分析

吴航, 李智强, 刘文德

2020, 36(1): 15-22. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0606

摘要 ( 390 )

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由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是全球最严重的植物真菌病害之一。稻瘟病菌通过分泌效应蛋白进入与植物相互作用界面或转运到植物细胞内,抑制寄主植物的免疫防卫反应,使病原菌成功侵染。通过农杆菌介导的异源表达策略,筛选到能引起非寄主植物烟草细胞死亡的候选效应蛋白MoCDIE2（Cell Death-Inducing Effector）。序列分析表明：MoCDIE2基因编码一个蓖麻毒素B凝集素蛋白;系统发育树构建结果表明MoCDIE2同源蛋白保守存在于丝状真菌中;利用基因敲除的方法获得MoCDIE2的敲除突变体,结果表明MoCDIE2的敲除突变体在菌丝生长和致病性方面与野生型菌株Guy11没有明显差异。

氨基酸定点突变提高灵芝蛋白LZ-8热稳定性的研究

孙熙麟, 蒋振彦, 刘志屹, 戴璐, 孙非, 黄伟

2020, 36(1): 23-28. doi:10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2019-0529

摘要 ( 480 )

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通过氨基酸定点突变技术提高灵芝免疫调节蛋白LZ-8的热稳定性。通过分子动力学模拟结合温度因子预测对LZ-8氨基酸突变位点进行理性设计,在毕赤酵母X33菌株内构建并表达LZ-8突变体蛋白,采用HeLa细胞生长抑制实验和差示量热扫描分析检测并比较了LZ-8突变前后生物学活性及热力学参数。结果显示,LZ-8 N-端α螺旋为理论预测的温度敏感区域,在该区域进行F8W和R9K氨基酸双位点突变,突变后的LZ-8热稳定性提高,相变温度Tm上升0.92℃,相转变焓值ΔH提高23.14 kJ/mol,但突变后LZ-8生物学活性基本不变,LZ-8和LZ-8突变体对HeLa细胞生长抑制的IC₅₀值分别是2.238 μg/mL 和2.407 μg/mL。通过理性设计氨基酸突变位点,获得了稳定性提高但生物学活性不变的灵芝免疫调节蛋白LZ-8的突变体。

橡胶树白粉菌（HO-73）启动子WY172不同长度片段的克隆及表达活性分析

殷金瑶, 王义, 徐良向, 朱利, 王晨, 刘文波, 缪卫国

2020, 36(1): 29-36. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0728

摘要 ( 425 )

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旨在克隆橡胶树白粉菌启动子WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段,以分析启动子各片段的表达活性。基于实验室前期研究基础,以WY172上游2K序列作为研究对象进行渐变缺失突变,得到4个不同长度的可能具有启动子活性的片段,结合WY172,选用pBI121载体作为骨架,分别替换GUS基因前的CaMV35S启动子,并分别构建重组表达载体,通过ATMT法转化农杆菌;利用GUS染色法和酶活性检测,分析WY172启动子及不同长度片段的酶活性。分别构建了pBI121-WY172、pBI121-WY172Q、pBI121-WY172Q1、pBI121-WY172Q2、pBI121-WY172Q3共5个重组的植物表达载体,所有植物表达载体烟草瞬时表达GUS染色均有蓝色出现,且蓝色程度均强于阳性对照CaMV35S启动子,其中pBI121-WY172Q3的GUS染色相对最深;GUS酶活性测定结果显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于CaMV35S启动子,WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。因此我们判断WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段均具有启动子活性,其中以WY172Q3启动子片段的表达活性最强。

一株地黄根腐病病原菌的分离鉴定及生物学特性研究

王亚利, 康春晓, 杨传臻, 魏艺璇, 王瑞飞, 李明军, 杨清香

2020, 36(1): 37-44. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0771

摘要 ( 390 )

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分离鉴定地黄根腐病的病原菌,对其致病性和生物学特性进行研究。利用平板分离法对地黄根腐病的病原菌进行分离纯化;利用测序技术和遗传进化分析对所得菌株进行鉴定;利用回接试验对所得菌株进行致病性检测;利用生长监测,确定所得菌株的各项生理学特性。获得一株菌落橙黄色,边缘整齐,表面光滑、湿润菌体椭圆形,有疑似出芽现象的真菌;该菌与帕鲁迪根红酵母（Rhodotorula paludigena）簇集在一起,置信度为91,遗传距离最近,具有密切的亲缘关系;该酵母菌接种侵染20 d后,地黄块根根腐病发病率达到100%;该菌株最适生长温度为28℃,最适生长pH为5.0;该酵母菌株能耐受阿魏酸、香草酸和对羟基苯甲酸（与根腐病发病密切相关的地黄根部分泌物）的最高浓度为0.5 g/L。初步证实了Rhodotorula paludigena DH5能够引起地黄根腐病,且该病原在富含酚酸类化合物的地黄根际具较强的生态适应能力。

白腐真菌落叶松锈迷孔菌产漆酶液体培养基的优化及其对染料的脱色作用

吴怡, 马鸿飞, 曹永佳, 司静, 崔宝凯

2020, 36(1): 45-59. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0974

摘要 ( 386 )

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以白腐真菌落叶松锈迷孔菌（Porodaedalea laricis）胞外漆酶为响应值,通过将Plackett-Burman设计、最陡爬坡设计和Box-Behnken设计相结合,获得了P. laricis产胞外漆酶的最适培养基为：去皮马铃薯365.61 g/L、蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、KH₂PO₄ 1.0 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.15 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.03 g/L、酒石酸铵6.68 g/L、琥珀酸钠1.5 g/L、吐温80 0.48 mL/L、玉米芯46.43 g/L、维生素B1 0.01 g/L。在该条件下,P. laricis漆酶活性为3.29 U/mL,相比于优化前提高了2.81倍,与理论值3.32 U/mL相近,说明该模型准确可靠。此外,将漆酶应用于降解多种合成染料包括活性亮蓝X-BR、雷马素亮蓝R、酸性黑172、刚果红、亚甲基蓝、中性红、靛蓝、萘酚绿B和结晶紫,反应168 h后脱色率分别可达到95.64%、97.21%、36.11%、91.63%、61.42%、74.65%、48.60%、25.13%和68.80%。

一株异养硝化-好氧反硝化皱褶念珠菌（Diutina rugosa）的分离及脱氮特性

杜全能, 朱文娟, 兰时乐

2020, 36(1): 60-65. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0685

摘要 ( 451 )

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为了获得异养硝化-好氧反硝化菌株,从养殖池塘污泥中分离筛选到一株具有异养硝化-好氧反硝化能力的酵母菌,命名为DW-1。经形态学观察和26S rDNA序列分析后鉴定为皱褶念珠菌DW-1（Diutina rugosa DW-1）。以氨氮为唯一氮源,初步探讨了碳源、C/N、初始pH值、培养温度、摇床转速对菌株DW-1除氮性能的影响。结果表明,在以乙酸钠为唯一碳源,C/N为25,pH为6.0、适宜培养温度为32℃、转速为170 r/min的条件下,菌株DW-1氨氮降解率和总氮去除率分别为94.94%、48.69%,而整个过程中亚硝氮积累量仅为0.067 mg/L。皱褶念珠菌DW-1的异养硝化-好氧反硝化特性表明其在降解含氮废水方面具有良好的应用前景。

丙氨酸转氨酶修饰对大肠杆菌L-色氨酸合成的影响

孟帅帅, 黄钦耿, 吴松刚, 刘峰

2020, 36(1): 66-72. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0864

摘要 ( 368 )

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探究大肠杆菌细胞内负责L-丙氨酸合成的转氨酶对菌株代谢及L-色氨酸合成的影响。运用Red重组技术分别对编码L-丙氨酸转氨酶的基因alaA、alaC和avtA进行敲除。通过摇瓶和50 L罐中探究其对L-色氨酸积累、L-丙氨酸代谢及菌体生长变化情况。结果显示,除3种L-丙氨酸转氨酶全部缺失的工程菌L-丙氨酸合成受阻、菌体生长受到较强抑制外,其它各任意一种或两种丙氨酸转氨酶缺失菌株的生长并未有较大差异,但色氨酸的合成变化显著。其中alaA和alaC双基因缺失的E. coli FS-T4工程菌,摇瓶发酵L-色氨酸产量达6.08 g/L,L-丙氨酸含量仅0.16 g/L,较出发菌株分别提高了26.7%和降低了91.0%。在50 L罐中E. coli FS-T4工程菌L-色氨酸产量最高可达41.9 g/L,糖酸转化率达20.5%,分别较出发菌株提高了13.8%和5.1%。转氨酶AlaA和AlaC的同时缺失,既可以满足细胞整体氨基酸池的需要,而且有利于减少杂酸的积累,使得更多的碳源流向L-色氨酸的合成。

菜豆环氧水解酶归一性水解间硝基环氧苯乙烷的研究

李闯, 文正, 刘畅, 邬敏辰

2020, 36(1): 73-80. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0624

摘要 ( 323 )

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旨在研究菜豆环氧水解酶PvEH2对映归一性水解外消旋（rac-）间硝基环氧苯乙烷（mNSO）的特性,为制备光学纯（R）-间硝基苯乙二醇（mNPED）提供优良的生物催化剂。构建表达有重组PvEH2的工程菌E. coli/pveh2。以rac-mNSO为底物,借助手性色谱法分析E. coli/pveh2全细胞的EH活性和区域选择性。基于有机助溶剂种类和剂量对酶活性的影响,筛选并优化缓冲液/助溶剂反应体系。结果显示,在菜豆植株中,PvEH2基因的转录水平可能受体外环境诱导因素的影响。E. coli/pveh2的EH活性为15.4 U/g_干细胞,水解反应的区域选择性系数α_S和β_R分别为90.3%和96.4%。在经过筛选优化的含有5%（V/V）丙三醇的磷酸盐缓冲液中,最高底物浓度为40 mmol/L,是原缓冲液体系的4倍。当反应至12 h时,所得（R）-mNPED的光学纯度ee_p及产率分别为84.9%和90.2%。E. coli/pveh2或PvEH2在水解rac-mNSO中表现出优秀的区域选择性,在制备光学纯（R）-mNPED中具有较好的应用潜力。

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的异源表达和应用

林美璇, 周小满, 关锋, 崔文璟

2020, 36(1): 81-87. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0630

摘要 ( 413 )

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旨在研究大肠杆菌产磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）的发酵表达和分离纯化,探究PI-PLC酶切GPI锚定蛋白的效果。依据NCBI数据库中蜡样芽孢杆菌的PI-PLC的基因序列,按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化,合成相应基因序列并构建基因表达载体pGEX-6P-1-PI-PLC。将重组质粒转入受体菌E. coli BL21（DE3）中,通过加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导目的基因PI-PLC表达。经检测,含有GST标签的PI-PLC融合蛋白以可溶蛋白形式存在于菌体破碎上清,分子量约为61 kDa,与预期相符。初步优化诱导表达条件后,发现最佳诱导表达条件为：以接种量5%接种体积分数接种,待菌体生长至OD_600nm达到0.5,在16℃条件下以0.3 mmol/L浓度IPTG诱导24 h。利用GST标签对蛋白进行纯化,纯化后的PI-PLC质量浓度为0.52 mg/mL,比酶活为1 322.5 U/mg。利用PI-PLC酶液对哺乳动物细胞表面的模式GPI锚定蛋白CD59进行酶切,酶切作用显著。因此,下一步可以将PI-PLC融合蛋白应用于细胞生物学中对GPI-APs的研究和鉴定。

Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

许祥, 董维鹏, 张少华, 冯晨毅, 刘田福, 燕炯

2020, 36(1): 88-94. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0369

摘要 ( 366 )

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构建脂肪特异性蛋白27（Fat-specific protein of 27,Fsp27）基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示：阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高（P<0.05）,其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示：阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高（P<0.05）;油红O染色结果发现：空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速率,其主要是通过抑制脂滴融合和增强ATGL酶的水解来完成对脂解的调控。

适宜河北省旱寒区的冬油菜品种的筛选

李爱国, 李积铭, 李和平, 刘桂华, 宋聪敏, 武军艳

2020, 36(1): 95-100. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0890

摘要 ( 358 )

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筛选适宜河北省低平原地区种植的油菜品种,同时实现生态效益和经济效益,为相似气候区油菜品种的种植选择及种植结构的调整提供理论依据。以16个油菜品种为材料,对品种间农艺性状的变化进行方差分析、相关性分析和聚类分析。各品种间分枝部位存在差异,变异系数为61.82%,品种JR5分枝部位最低,14T×38最高;其次差异较为明显的是产量和二次分枝数,变异系数分别为26.69%和24.89%,14T×38产量最高,20SY-13最低。二次分枝数最大和最小的品种分别为20SY-13和天油142。油菜产量与一次分枝数和主花序角果数呈极显著正相关（P<0.01）,株高与分枝部位、主花序长度和主花序角果数呈显著正相关关系,一次分枝数与主花序角果数呈显著正相关（P<0.05）,二次分枝数与主花序角果数呈极显著负相关。当欧式距离为5时,16个油菜品种可分为五大类。选择株高较高、一次分枝数和主花序角果数较多、二次分枝数较少且可以在当地正常越冬的油菜品种进行种植,可以获得较高水平产量;20SY-13在当地秋季种植应注意安全越冬。

miRNA在植物病原调控方面的研究进展

杨丽娟, 李世访, 卢美光

2020, 36(1): 101-109. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1045

摘要 ( 448 )

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miRNA是一类在真核生物体内普遍存在的,长度在22 nt左右的单链小RNA分子。大量研究发现,miRNA可广泛参与植物的生长发育、新陈代谢、物质运输、逆境响应及病原防御等多种生理生化过程。目前已经从植物中鉴定到大量的miRNA,但其中参与植物病原调控相关miRNA的研究较少。miRNA作为一种重要的转录调控因子,可参与调控病原相关分子模式触发的免疫反应和效应因子触发的免疫反应。拟南芥中,miRNA393通过靶向生长素受体基因对植物生长素进行负调控,从而在抵御细菌侵染方面发挥作用;水稻中,miRNA528可响应水稻条纹病毒（RSV）的侵染,人为提高miRNA528水平有助于维持水稻对RSV的抗性。阐述了miRNA的作用机制,与植物细菌、真菌和病毒侵染相关的miRNA研究进展,总结了葡萄,苹果,梨和桃等具有重要经济价值果树中病原调控相关miRNA研究情况,旨在为今后miRNA在植物,特别是在果树抗病研究方面提供全面的理论依据。

诱变育种在产油微生物生产DHA中的研究进展

李建涛, 刘宪华, 何耀东, 汪光义

2020, 36(1): 110-115. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0637

摘要 ( 390 )

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二十二碳六烯酸（DHA）对维持人体正常的生理功能至关重要,具有极高的生物医学价值。产油微生物是指具有很强的脂肪酸合成能力,DHA占总脂肪酸含量相对较高的一类微生物,是获取DHA的新途径。诱变育种作为一种有效的变异手段在产油微生物选育与改良中显示了极为重要的作用和十分诱人的前景。综述了通过物理和化学诱变选育高产DHA菌株的机理及方法,其中物理诱变包括γ射线、紫外线、离子束和常压室温等离子体等;化学诱变包括甲基磺酸乙酯、亚硝基胍和硫酸二乙酯等;主要介绍了不同诱变育种方式在产油微生物生产DHA研究方面取得的成就,探讨了诱变育种的发展方向,提出了不同诱变育种方式相结合的复合育种的思路,以期对今后产油微生物生产DHA的研究有所启发。

主要农作物细胞质雄性不育系育性恢复基因研究进展

赵国龙, 林春晶, 金东淳, 张春宝

2020, 36(1): 116-125. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0900

摘要 ( 405 )

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提升作物产量、抗逆性和品质的主要手段之一是利用杂种优势,其中细胞质雄性不育/恢复（CMS/Rf）系统是应用最广的雄性不育系统。研究细胞质雄性不育系育性恢复机理是“三系”法选育的重要分子遗传学基础。目前,各个作物已经创制了不同类型的不育系。随着分子技术、基因组学和测序技术的深入,大量育性恢复基因已被定位,且部分已被克隆和功能鉴定。针对主要作物中恢复基因的遗传模式,分子标记定位、克隆及CMS/Rf系统在杂交育种中的应用进行了系统总结。希望本文能为今后恢复系分子标记辅助选育,或利用转基因、基因编辑手段创制新恢复系提供思路。

MBW复合体在植物花青素合成途径中的研究进展

高国应, 伍小方, 张大为, 周定港, 张凯旋, 严明理

2020, 36(1): 126-134. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0738

摘要 ( 1212 )

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花青素是植物呈色的一种关键物质,它既能赋予植物丰富的色彩,又具有广泛的生物学功能,如抗氧化、抗紫外线、抗病虫害等。植物花青素生物合成途径由一系列结构基因和调节基因协同完成。结构基因表达受MYB、bHLH和WD40类转录因子以其组成的MBW复合体调控。综述了近年来MYB、bHLH和WD40类转录因子及MBW复合物在植物花青素合成中的功能研究进展,总结了花青素合成的各种生物过程和调控网络。

C类花器官特征基因AGAMOUS（AG）调控植物花分生组织维持与终止研究进展

位明明, 曾霞, 安泽伟, 胡彦师, 黄肖, 李维国

2020, 36(1): 135-143. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0877

摘要 ( 661 )

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花分生组织的维持与终止在植物花器官发生和世代交替起着至关重要的作用。成功的花分生组织决定能够确保植物正常的生殖发育和生命周期进程。诸多研究表明AGAMOUS（AG）基因作为花器官分化和开花决定的主效调节因子,能够协调花发育过程中多种细胞命运决定。然而,关于AG参与调控植物世代交替及花分生组织维持与终止的分子调控机制尚不清晰。综述了近年来AG基因参与调控植物花分生组织维持与终止的研究进展及现状,以期为深入研究植物花器官分化过程中干细胞的维持和终止,以及干细胞活动与其他发育过程之间的分子调控过程提供参考。

油茶干旱胁迫响应机制的研究进展

董斌, 李荣喜, 洪文泓, 黄丽英, 黄永芳, 赖巧晖

2020, 36(1): 144-149. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0689

摘要 ( 434 )

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油茶（Camellia oleifera Abel.）是中国特有的木本油料作物。近年来,国家大力提高食用油的自给率,油茶作为一种主推的木本油料作物,种植面积不断加大。油茶虽然其被归为耐旱树种,但其主要栽培于南方丘陵山地,极端缺水的干旱环境仍然成为限制油茶生产的主要障碍。综述了干旱胁迫下油茶形态指标、产量品质、渗调物质、保护酶系统、光合荧光及分子水平等方面的变化,在此基础上讨论了当前针对油茶干旱胁迫研究存在的问题和困境,并提出未来的展望,以期为油茶抗旱机制、抗旱栽培、抗旱育种等研究提供参考。

解淀粉芽孢杆菌相关功能机制研究进展

王世伟, 王卿惠

2020, 36(1): 150-159. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0786

摘要 ( 559 )

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解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）属于芽孢杆菌属,可广泛应用于农业生产、食品工业、环境保护、化妆品行业、医药以及沙漠治理。这些应用与解淀粉芽孢杆菌的特性和相关功能紧密相连。正因为解淀粉芽孢杆菌有多方面的生理功能,如形成生物膜、定殖于植物、促进植物生长等,才使其应用的广泛性成为可能。对解淀粉芽孢杆菌相关重要生理特征和功能机制进行了总结归纳,旨在为更好开发和利用这种益生菌提供科学理论数据。

纳米载体固定化脂肪酶及其在生物柴油转化中的应用进展

张玮玮, 杨慧霞, 薛屏

2020, 36(1): 160-166. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0618

摘要 ( 362 )

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随着全球能源需求量的不断上升和日益加剧的环境压力,固定化脂肪酶在可持续生物柴油合成中的应用受到广泛关注。纳米材料,包括纳米粒子（磁性和非磁性）、碳纳米管和纳米静电纺丝,具有比表面积大、结构稳定、易于功能化修饰等优势,是固定化脂肪酶领域的重要载体之一。综述了纳米材料作为载体在脂肪酶固定化中的应用,重点介绍这类生物催化剂在生物柴油合成中的最新进展,并对纳米材料固定化脂肪酶发展前景进行展望,旨在为固定化脂肪酶的研究和工业化应用奠定基础。

益生菌抗衰老作用机制研究进展

余洁, 刘昕, 张驰, 赵吉春, 李富华, 明建

2020, 36(1): 167-174. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0635

摘要 ( 534 )

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衰老会引起机体诸多不良的生理变化并增加对疾病的易感性,明确引发衰老的机制对于寻找其干预措施至关重要。研究发现,自由基氧化应激、炎症性衰老、免疫衰老、肠道菌群失调是引发衰老的相关机制。益生菌被报道具有潜在的延缓衰老作用,比较分析了常用益生菌抗衰老评价模型,并从衰老引发机制出发,重点综述了益生菌对肠道菌群的调节机制和抗衰老相关信号通路的影响,旨为进一步研究益生菌抗衰老作用提供新思路。

免疫细胞在棕色脂肪产热及白色脂肪棕色化过程中的功能研究进展

孙文阳, 林建春, 滚双宝, 王金勇

2020, 36(1): 175-181. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0542

摘要 ( 400 )

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肥胖已经成为威胁人类健康的全球性问题,棕色脂肪（Brown adipose tissue,BAT）及米色脂肪因其能够通过产热作用增加能量消耗这一特性,已成为一种备受关注的潜在肥胖治疗方法。近年来的研究发现M2型巨噬细胞（Alternatively activated macrophages,M2 type）能够促进BAT产热和白色脂肪（White adipose tissue,WAT）的棕色化（即米色脂肪的形成过程）,但随后的一些研究却得到了相反的结论。到目前为止,M2型巨噬细胞是否参与促进WAT的棕色化过程仍是一个备受争议的话题。主要对M2型巨噬细胞、II型固有淋巴细胞（Type 2 Innate Lymphoid Cells,ILC2s）和嗜酸性粒细胞（Eosinophils）对BAT产热和WAT的棕色化的促进作用,以及M2型巨噬细胞不参与/抑制WAT棕色化这两个方面的研究状况做一综述。

核酸切割酶在病原微生物检测中的研究进展

王昕, 朱龙佼, 许文涛, 翟晨, 王书雅, 黄蔚霞

2020, 36(1): 182-192. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0568

摘要 ( 396 )

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DNA是遗传信息的重要载体,其空间构象折叠性质使其具有很多的功能。利用核酸切割酶（cleaving DNAzyme）识别特定单链DNA分子并能够切割其中某条单链的性质来构建传感器,将特异性识别过程转化为凝胶电泳表征、释放荧光、比色现象的信号输出,同时能很好的和扩增反应结合来实现信号放大。核酸切割酶通过体外筛选技术获得,可以与靶物质（小分子、蛋白质,甚至整个细胞）特异性结合。由于具有制备简单,易于修饰和良好稳定性等优点,核酸切割酶被用于构建生物传感器以检测病原微生物,已应用到现场检测甚至医疗中的体内检测,结合已经成熟的检测设备血糖仪、横流层析试纸条带进行微生物检测,并广泛地应用到生物传感、食品安全、医疗在内的重要领域中。综述了近年来核酸切割酶在微生物检测中的应用,讨论了核酸切割酶在微生物检测中的切割机理和产物、靶标以及表征手段,探索核酸切割酶在微生物实际检测中的意义。对该技术的发展前景及其面临的问题进行展望,以期核酸切割酶在微生物检测领域能够更好的发展。

核酸适配体光学生物传感器在卡那霉素检测中的研究进展

吴亚, 徐智辉, 张彪, 赵冬芳, 曹文欣, 张兴平

2020, 36(1): 193-201. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1008

摘要 ( 420 )

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卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素,由于其效果好、价格低等优点,是我国常用兽药之一。但如果剂量过大就会大量残留在动物体内,进而通过食物链富集进入人体,引发耳毒性、肾毒性等毒副作用,严重时会导致人死亡,因此对其含量的检测十分重要。近几年,大量基于核酸适配体检测卡那霉素的光学方法被开发,以满足人们对其检测的需求。首先明确了核酸适配体与光学生物传感器等相关概念;再根据其反应机制不同,对光学方法介导的生物传感器进行了分类综述,阐述了各类传感器的基本原理及其检测范围;最后对这几类传感器的优缺点和发展前景进行了总结和展望,对这些方法的进一步探索将为食品安全检测提供新的技术支撑。

PCR-膜芯片技术在牦牛及犏牛肉制品的真假鉴定中的应用

赵睿骁, 韩斐, 江明锋, 曾莲, 韩嘉钰, 黄盈, 周航

2020, 36(1): 202-208. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0607

摘要 ( 437 )

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旨在利用PCR-膜芯片技术快速高效的鉴定牦牛及犏牛肉制品的真假。采集样品（猪、山羊、黄牛、水牛、牦牛、鸡、鸭、兔、狗、真犏牛、假犏牛肉样各8个,19个肉干制品样品）,提取并纯化DNA,利用11对特异性引物进行多重PCR,将扩增产物与含有12个探针的膜芯片反向点杂交,测试膜芯片的准确度及灵敏度,并鉴定市场上销售的牦牛肉制品真假。结果表明,膜芯片准确度高,特异性强,无交叉反应,灵敏度能达到0.1 ng,检测灵敏度高。通过鉴定市场上销售的假牦牛肉干制品几乎都以黄牛和水牛肉为原料制作。应用PCR-膜芯片技术可快速准确的鉴定出牦牛肉制品的真假,有利于打击假冒产品,维护市场平衡。

产瓦伦西亚烯酿酒酵母的表达载体适配及发酵碳氮源优化

陈和锋, 朱晁谊, 李爽

2020, 36(1): 209-219. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0564

摘要 ( 415 )

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瓦伦西亚烯是一种倍半萜类化合物,广泛应用于香水、香皂、食品和饮料等工业制造上。但由于其自然含量极低,且目前获取瓦伦西亚烯的方法较为麻烦且花费高,因而构建细胞工厂进行瓦伦西亚烯的生物合成是更为高效和环保的方法。选取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主构建细胞工厂,先在酿酒酵母基因组上引入黄扁柏的瓦伦西亚烯合成酶（Valencene synthase from Callitropsis nootkatensis,CnVS）,实现瓦伦西亚烯的初步合成,初始产量为4.16 mg/L。随后利用CRISPR/Cas9系统对酿酒酵母中Mevalonate（MVA）途径的erg9和rox1基因进行敲除,提高通往瓦伦西亚烯合成的碳流量。不同碳氮源浓度发酵的结果表明,细胞生长积累过高可能不利于瓦伦西亚烯的积累。最后探究了不同CnVS表达载体对瓦伦西亚烯产量的影响,并获得17.54 mg/L的最高产量,是出发菌株的4.2倍。

基于L5178Y细胞体外Pig-a基因突变试验方法的建立与初步探索

王亚楠, 文海若, 王雪

2020, 36(1): 220-228. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0855

摘要 ( 418 )

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利用小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk^+/--3.7.2C和阴性化合物Glc、NaCl及阳性化合物EMS、ENU、4-NQO、B（a）P建立并验证基于哺乳动物细胞的体外Pig-a基因突变检测方法。计算细胞相对倍增速率评价细胞毒性,抗体标记突变型细胞确定流式检测模板,L5178Y细胞经EMS处理后第4、8、12、16、20天检测Pig-a基因突变频率,确定最大突变频率发生时间点,免疫荧光技术检测CD90蛋白在细胞中的定位情况,采用PCR方法进行突变位点分析。结果表明：（1）Glc、NaCl、EMS、ENU、B（a）P、4-NQO所设浓度组RPD均大于50%。（2）Pig-a基因突变频率在给药后第8天出现峰值。Glc和NaCl致Pig-a基因突变频率均小于200×10^-6,各浓度组与溶剂对照组间不存在显著性差异（P>0.05）,EMS、ENU、B（a）P、4-NQO均可引起Pig-a基因突变频率增加,且与溶剂对照组相比存在显著性差异。（3）免疫荧光成像显示突变型细胞表面无CD90蛋白,野生型细胞正常表达CD45,CD90蛋白。（4）基因突变位点检测显示存在G→C、A→C、C→T三种突变类型。基于小鼠淋巴瘤L5178Y细胞分别在有无S₉代谢活化条件下成功建立体外Pig-a基因突变的遗传毒性检测方法,旨为化合物体外遗传毒性评价或药物研发早期遗传毒性筛选提供新方法。

利用电转的方法对T细胞TET2基因敲除并探讨TET2对T细胞增殖的影响

杨雷, 叶洲杰, 李兆龙, 沈阳坤, 傅雅娟

2020, 36(1): 229-237. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0891

摘要 ( 602 )

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近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视。然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用。与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率。TET（Ten-eleven translocation）家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶（5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）,5hmC作为细胞中的DNA去甲基化酶,在细胞基因组表观遗传学中起着重要调控作用。研究表明TET2 基因的缺失能够促进CAR-T 细胞的快速繁殖,产生强力的 CAR-T 细胞。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对TET2基因进行敲除。首先对sgRNA进行体外转录,与大肠杆菌诱导表达的Cas9蛋白孵育形成Cas9：gRNA核糖核蛋白复合物（RNP）,并在体外酶切验证sgRNA的活性。接着利用电转染技术将Cas9：gRNA核糖核蛋白复合物（RNP）带入细胞内,并检测T细胞基因编辑效率。最后利用流式细胞分析技术检测T细胞的增殖情况。基因测序与T7E Ⅰ 酶切结果表明,T细胞中的TET2基因被成功敲除,T细胞活力和功能并未受到影响。流式细胞技术,CCK-8以及台盼蓝细胞活率检测结果显示缺失Tet2蛋白后,T细胞的增殖速率明显快于野生型T细胞。该研究为非病毒载体替代传统的慢病毒载体构建携带嵌合抗原T细胞奠定了基础,具有制备周期短,安全性高的特点。同时TET2缺失促进了CAR-T细胞的增殖,使其能够引发有效的抗肿瘤反应,为CAR-T细胞免疫治疗提供了新的思路。

燃料乙醇发酵技术研究进展

郭振强, 张勇, 曹运齐, 刘云云, 赵于, 吴蔼民

2020, 36(1): 238-244. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0610

摘要 ( 435 )

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在分析木质纤维素类生物质制备燃料乙醇原理基础上,重点对燃料乙醇转化过程的发酵工艺进行了论述。目前乙醇发酵工艺主要包括直接发酵、分步糖化发酵、同步糖化发酵、同步糖化共发酵和联合生物加工技术等,对这几种技术的研究现状进行了分析并对其发展趋势进行了展望,通过基因工程构建高效发酵菌种的联合生物加工技术将是未来高效发酵工艺的发展趋势,旨在为有效提高发酵菌株的底物代谢能力,获得高的乙醇产量提供重要参考。

2020, 36(1): 245-245.

摘要 ( 138 )

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